蓝耳病研究进展.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,前 言,1,致病机理,3,小 结,4,生物学特性,2,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,1,前,言,猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是,由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),引起的一种以,母猪繁殖障碍,和仔猪呼吸道疾病,为主要特征的病毒性传染病。,临床特征,主要表现为,妊娠母猪,发热、厌食，,怀孕后期,流产,、,早产,，,产弱仔,、,死胎和木乃伊胎,；,仔猪和育成猪则以,呼吸系统疾病和高死亡率,为特征。由于发病后部分病猪耳部和躯体末端皮肤发绀，故又俗称为,蓝耳病。,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,1987,年,首次发现于美国,1991,年,荷兰首次分离到该病毒，命名为,Lelystad virus(LV),1992,年,美国分离到一株,PRRSV,，命名为,VR 2332,毒株,1996,年,郭宝清等首次从流产胎儿中分离到,PRRSV,1995,年,我国北京地区首次报道发生本病,2006年,由该病毒变异株引起的,HP-PRRS,在我国广泛流行,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,2.2 基因组特征,PRRSV,是,单股正链,RNA,病毒其基因组全长约,15kb,，具有,5,端,帽子结构,和,3,端有,poly(A),尾,，其,基因组顺序,为,5-ORF1a-ORF1b-ORF(2-6)-ORF7-3,，含有,至少九个,开放阅读框,(ORF),，每个阅读框和相邻的阅读框都有部分重叠。,研究发现了一个新的,ORF,，认为在,病毒的复制和感染,过程中发挥着重要作用，并将其命名为,ORF5a,。,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,2.2 基因组特征,ORF1,包括,ORF1a,和,ORF1b,，主要编码,依赖于,RNA,的,RNA,聚合酶和复制酶,。,ORF2-ORF4,主要编码病毒的,次要结构蛋白,，包括,GP2、GP3、GP4和E,蛋白，是糖基化的囊膜蛋白。,ORF5,、,ORF6和ORF7,分别编码病毒,糖基化的囊膜蛋白,(GP5),、膜基质蛋白,(M),和核衣壳蛋白,(N),，是病毒的,主要结构蛋白,。,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,持续性感染,遗传变异,3.,1,3 致病机理,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,3.5,3.6,3.4,3.3,3.2,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,猪繁殖与呼吸综合征病毒,通过呼吸道,或,生殖道,等途径,传播,肺和淋巴结等组织的巨噬细胞,内增殖,PAM,和,PIM,大量裂解死亡,肺泡功能发生障碍,仔猪和育成猪表现,典型的呼吸道症状,在血液巨噬细胞和单核细胞内增殖,分布到全身各组织器官的巨噬细胞内,病毒血症,及相应组织器官不同程度的损伤,血液循环及淋巴循环,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,感染细胞的凋亡,邻近非感染细胞的程序性死亡,诱导产生炎性细胞因子,巨噬细胞吞噬清除功能减弱,导致,PAM释放超氧负离子的能力降低，,使其,依赖于超氧负离子所发挥的,非特异性杀菌作用,的功能下降，从而容易继发感染其它细菌或病毒,。,混合感染,、,疫情加重,。,如,PRRS,病猪可继发感染,副猪嗜血杆菌病,、,猪链球菌病,、,猪支原体肺炎,、,猪伪狂犬病,、,猪圆环病毒2型,等疾病,。,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,病毒受体是决定病毒宿主范围和组织嗜性的重要因素，关于,病毒受体特异性,和,病毒起源宿主类型,之间关系的研究是目前病毒学研究的热点和难点之一。,研究表明，,PRRSV,侵染猪肺泡巨噬细胞的,先决条件是实现与细胞上的受体完成吸附,，而这种吸附过程是PRRSV侵染靶细胞必不可少的。,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,试验研究已经证实存在,6种PRRSV,的细胞受体,硫酸乙酰肝素,(heparin sulphate，HS),唾液酸黏附素,(sialoadhesin，Sn),CDl63分子,(cluster of differentiation 163),波形蛋白,(vimentin),NMMHC IIA分子(非肌肉肌球蛋白重链A),CD151分子(cluster of differentiation 151),细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,硫酸乙酰肝素,(heparin sulphate，HS),肝素,、肝素酶,或硫酸乙酰肝素类似物,处理,PRRSV,，发现这些化学物质能明显抑制,PRRSV对PAM,或MARC-145,细胞的感染,，从而,证实,HS是PRRSV,的,一个细胞,受体,。,研究,发现,，,PRRSV中以,M-GP5,复合物,形式存在的病毒基质蛋白是,HS受体,的主要结合位点,，,参与,PRRSV吸附到PAM,，对感染过程十分重要，,但,主要发生在,PRRSV,的,感染早期。,另外，,PRRSV侵入PAM细胞,的过程并不能被,可溶性,的,HS,单,克隆抗体,完全阻断,，表明还存在其他细胞受体参,与PRRSV,的结合和侵入宿主细胞。,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,唾液酸黏附素,(sialoadhesin，Sn),主要功能是,介导病毒的内吞形成内吞小体,，并与,HS,受体在病毒感染过程中发挥协同作用。,病毒的内吞不依赖于,HS,，但,存在,HS,受体情况下,Sn,对病毒的结合与内吞更加容易，,Sn,可单独完成病毒的内吞。,CDl63,分子,(cluster of differentiation 163),CD163,主要作用,可能,是,协助,Sn,内吞,、,病毒脱衣壳,和,基因组,RNA,释放,到细胞质中,进行复制。,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,波形蛋白,(vimentin),PRRSV,感染,PAM,的过程有,HS和Sn的,参与，但,Marc-145细胞作为PRRSV的靶细胞本身不表达HS和Sn，可见Marc-145细胞表面另有其他受体介导PRRSV感染。通过研究发现了波形蛋白，该蛋白能与PRRSV的N蛋白结合而介导病毒的感染过程。,CD151分子(cluster of differentiation 151),通过制备,CD151,单克隆抗体,进行PRRSV,病毒阻断试验,发现其能完全阻断PRRSV对Marc-145细胞的感染,，证实CD151可能是PRRSV的细胞受体。,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,研究发现，在,PRRSV,入侵靶细胞过程还依赖于,天冬氨酸蛋白酶E和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶,，但这些分子在感染过程中所发挥的作用还需进一步研究，并且还可能存在其他未知的侵入介体。,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,图1,PRRSV,与细胞,受体结合,入侵,肺泡巨噬细胞,模式图,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,PRRSV,主要,通过,以下,途径抑制机体天然,免疫,和适应性免疫应答,：,抑制,巨噬细胞和,树突状细胞,等免疫细胞的,功能,调节T细胞免疫,诱导调节性T细胞分化,影响细胞因子的释放,抑制I型干扰素的产生,及,IFN介导的信号通路,等,延迟中和抗体产生,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,N30,N34,N35,N33,N44,N51,decoy epitope,neutralizing epitope,Signal peptide,ectodomain,hypervariable region,图,2,GP5,结构示意图及可能的糖基化,位点,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,PRRSV,主要结构蛋白,GP5的胞外结构域,有,1,个免疫显性表位,(表位A),，它能够在感染早期诱导机体产生高水平的非中和抗体免疫反应，导致位于其下游的,中和表位,(表位B),减弱或被屏蔽,，从而不能产生相应的免,疫应答。,中和表位内,以及,周围的,糖基化位点对中和表位有屏蔽作用,，因而,延迟中和抗体的产生和逃避中和抗体,。,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,抗体依赖性增强作用,(ADE),大多数病毒感染宿主细胞时，其表面抗原与靶细胞膜上的特异性受体结合，并诱导机体产生中和抗体，通常这种特异性抗体可以与病毒抗原结合使其失去感染细胞的能力。,但当,机体内,中和抗体水平低,于,免疫保护水平(亚中和水平抗体)时，,抗体可以与病毒结合形成抗原抗体复合物，协助病毒入侵靶细胞，使其复制和感染能力显著增强,，导致病毒的持续性感染,。,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,猪群免疫,弱毒苗,时，免疫初期诱导产生的,抗体水平较低,，中和病毒的活性,弱,，此时抗体可能会对,野毒株在猪体内的复制起到增强作用,，从而影响疫苗的免疫保护效果,。,由此可见，,PRRSV,诱导产生,的,抗体在不同水平所,发挥的,作用不,同,，就像一把,“双刃剑”,。,这提示我们在研发疫苗时需要进行,ADE,评估,，,在,疫苗免疫时能够快速产生高水平中和抗体，回避抗体介导的,ADE,作用，从而保证疫苗的安全有效,。,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,PRRSV,在感染猪体后常会引起持续性感染，即病毒在感染猪体内和污染猪场内感染猪群中持续性存在。,从流行病学角度：,引种；水平传播和垂直传播；潜伏感染猪,从免疫学角度：,免疫抑制；抗体依赖性增强作用；母源抗体水平低,从遗传学角度：,抗原表位突变；基因重组,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,PRRSV,基因组具有高度的变异性，不同基因型及相同基因型的不同分离株间的基因组遗传变异程度较为明显，进而导致,毒力及,抗原性的差异。除了编码,M蛋白,和,N蛋白,的基因相对保守外，,NSP2,和,ORF5,基因在,PRRSV,基因组中的变异程度较高,。,大量研究表明，在流行毒株的,中和表位存在突变,，突变后可能会减弱病毒对中和抗体的敏感性，从而影响中和抗体与病毒的结合，导致病毒逃逸。,细胞损伤机制,细胞受体,免疫抑制,抗体依赖性增强作用,遗传变异,持续性感染,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,PRRSV,可引起猪群的持续性感染，这也为病毒的遗传变异提供了很好的机会和环境。,丹麦疫苗株返强现象和美洲非典型,PRRS,的发生,表明,PRRSV,在猪体内持续感染的过程中发生变异。,病毒基因组除了发生,点,突变和缺失,外，还可能发生,基因重组,，但目前还没有研究证实两种不同基因型毒株同时存在是否会发生重组，从而产生毒力更强的新毒株。,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,3 小 结,目前，国内外学者对于猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病机理进行了大量研究，但对于,病毒逃逸宿主的免疫监视以及免疫抑制的分子作用机制,等方面尚未研究清楚，,病毒抗原表位基因突变在毒力变异中的作用,还需要进一步探索研究,，从而为研发新型疫苗、新型免疫佐剂以及抗病毒药物奠定坚实的理论基础。,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,研究思路：,制备单克隆抗体，研发抗独特型抗体疫苗,考虑对优势抗原的中和表位及糖基化位点进行修饰,运用分子标记及噬菌体展示技术研究病毒入侵机制,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,问题：,感染,PRRSV,的妊娠母猪如何引起子宫内胎儿感染？,因为抗体和病毒等大分子物质不能通过母猪的胎盘屏障，推测,PRRSV,可能由穿过胎盘屏障的单核细胞和巨噬细胞携带进入胎儿体内，从而引起胎儿感染,PRRSV,。,如何做好,ADE,评估？,PRRSV,引发的抗体依赖性增强作用提示我们研发疫苗时需要进行,ADE,评估，回避抗体介导的,ADE,作用。,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,问题：,如何进行优势抗原的中和表位及糖基化位点修饰？,囊膜蛋白,GP3,和,GP5,是,PRRSV,的主要保护性抗原，但是抗原性存在明显变异，而其他蛋白的免疫原性相对较弱，因此在抗原表位及糖基化位点的修饰策略上存在矛盾。,我们实验室,PRRSV,研究方向？,近年来，由于实验室研究课题的限制，对于,PRRSV,的关注较少。目前，我们主要进行流行毒株的分离鉴定及遗传变异分析，是否还有其他研究方向？,猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展,Thanks for your attention!,