细胞凋亡及检测方法PPT课件.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,0,一、概述(i sh),细胞凋亡(apoptosis)：由体内(t ni)外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡（又称为程序性细胞死亡）,1972年由Kerr等建议用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的变化形式的。“凋亡”一词来自希腊语，apo意为“分离”，ptosis指花瓣或树叶的脱落，“凋亡”是由这两个词组合而成，意指细胞凋亡类似秋天花瓣或树叶的凋落一样,第1页/共93页,第一页，共93页。,研究(ynji)简史,半个世纪前:人们就观察到生理自发退化(tuhu)死亡现象.,1965年:发育生物学家Lockshin和Williams首先提出了PCD（程序化死亡）一词，用于描述蛾的发育过程,1972年:Kerr等首次提出了细胞凋亡的概念,1977年:人们注意到在生理或病理性刺激条件下，淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。,1980年:Wyllie研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞凋亡变化，总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征，包括核固缩和DNA降解成寡核苷酸片段等,1989年:0wen及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中证明了信号传递物质对PCD的调控作用。,1991年:Ellis首先发现了线虫(C.elegans)体内Ced-3、4两个基因与PCD的发生密切相关，随后逐渐发现了多种参与PCD的正相调节基因和负相调节基因,第2页/共93页,第二页，共93页。,第3页/共93页,第三页，共93页。,细胞(xbo)死亡的形式,坏死：活体组织细胞的死亡(swng),凋亡,第4页/共93页,第四页，共93页。,细胞凋亡与坏死(hui s)的比较,坏死,凋亡,性质,诱导因素,生化特点,形态变化,DNA,电泳,炎症反应,凋亡小体,基因调控,病理性、非特异性,强烈刺激，随机发生,被动过程，无新蛋白合成,细胞肿胀、细胞结构全面溶解、破坏,弥散性降解，电泳呈均一,DNA,片状,溶酶体破裂，局部炎症反应,无,无,生理性或病理性，特异性,较弱刺激，非随机发生,主动过程，有新蛋白合成,胞膜及细胞器相对完整细胞,皱缩，核固缩,DNA,片段化（,180-200bp,）电泳呈梯状条带,溶酶体相对完整，局部无炎反应,有,有,第5页/共93页,第五页，共93页。,坏死(hui s),第6页/共93页,第六页，共93页。,坏死炎细胞(xbo)浸润,第7页/共93页,第七页，共93页。,凋亡(dio wn),第8页/共93页,第八页，共93页。,第9页/共93页,第九页，共93页。,细胞凋亡(dio wn)的生理病理意义,确保正常发育、生长：清除多余的、失去功能价值的细胞（指趾间组织细胞）,维持内环境稳定：清除受损突变(tbin)细胞，自身反应细胞，衰老细胞,发挥积极的防御功能：病毒感染细胞凋亡，阻止病毒复制,第10页/共93页,第十页，共93页。,二、细胞凋亡(dio wn)的过程,细胞凋亡的大致过程：,凋亡信号转导,凋亡基因激活(j hu),细胞凋亡的执行,凋亡细胞的清除,第11页/共93页,第十一页，共93页。,凋亡(dio wn)的四个阶段：,凋亡诱导(yudo)因素,+,受体,cAMP,Ca,2+,神经酰胺死亡(swng)信号,凋亡基因激活,DNase,激活,Caspase,激活,巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞,第12页/共93页,第十二页，共93页。,凋亡(dio wn)过程,受体,cAMP,Ca2+,神经酰胺,凋亡相关(xinggun)基因激活,信号转导,细胞膜,细胞核,凋亡诱导因素,+,DNase激活(j hu)Caspases激活(j hu),死亡信号,第13页/共93页,第十三页，共93页。,凋亡(dio wn)过程,DNase激活(j hu),Caspases激活(j hu),凋亡细胞的清除,凋亡执行,第14页/共93页,第十四页，共93页。,三、凋亡(dio wn)时细胞的主要变化,（一）细胞凋亡的形态学改变,细胞凋亡的特征是细胞首先变圆,随即与邻周细胞脱离,失去微绒毛,胞浆浓缩,内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合,核染色质密度增高呈半月形,并凝聚在核膜周边,核仁裂解,进而细胞膜内陷将细胞自行分割为多个(du)外有膜包裹、内涵物不外泄的凋亡小体，被吞噬细胞或邻周细胞所识别、吞噬,或自然脱落而离开生物。不引起炎症反应和次级损伤。,第15页/共93页,第十五页，共93页。,空泡化,固缩,出芽(ch y),边集,凋亡(dio wn)小体,形态学特征(tzhng),第16页/共93页,第十六页，共93页。,染色质边集,第17页/共93页,第十七页，共93页。,第18页/共93页,第十八页，共93页。,嗜酸性(sun xn)小体(凋亡),嗜酸性变及嗜酸性小体,肝细胞体积缩小(suxio)，胞浆浓缩红染，呈嗜酸性变；或胞浆进一步浓缩，细胞变圆，核碎裂，呈嗜酸性小体状,第19页/共93页,第十九页，共93页。,（二）细胞凋亡的生化(shn hu)改变,1.DNA片段化：形成180-200bp或整数倍的片段，在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征性的“梯状”条带，是判断凋亡发生的客观(kgun)指标之一。,第20页/共93页,第二十页，共93页。,凋亡(dio wn)后DNA Ladder的 agarose 电泳检测,第21页/共93页,第二十一页，共93页。,2.内源性核酸内切酶激活(j hu)及其作用：内源性核酸内切酶在核小体连接部切断DNA双链。,凋亡诱导(yudo)因素细胞内信号转导,无活性内源性核酸内切酶 活性内源性核酸内切酶,核小体连接部切断DNA双链电泳呈特征性的“梯状”条带,Ca+Mg+激活(j hu),Zn,+,抑制,第22页/共93页,第二十二页，共93页。,3.Caspase的激活(j hu)及其作用,Caspase（含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶）：一组对底物门冬氨酸部位有特异水解作用、其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶，又称死亡蛋白酶,主要作用：,灭活细胞凋亡抑制物（Bcl-2）,水解蛋白质结构，导致细胞解体，形成凋亡小体,水解级联反应相关活性蛋白，使之获得或丧失(sngsh)某种生物学功能,第23页/共93页,第二十三页，共93页。,Caspase的作用(zuyng),第24页/共93页,第二十四页，共93页。,目前(mqin)被鉴定的哺乳动物Caspase,第25页/共93页,第二十五页，共93页。,Caspase 的特点(tdin),1.含有高度保守的QACXG(X为R、Q或G）五肽序列；,2.以半胱氨酸作为裂解底物的亲核基团；,3.以天门冬氨酸为特异性底物（羧基端肽键断裂）；,4.通常以无活性的酶原形式存在，须通过水解其氨基端一段序列激活；,5.活化(huhu)后水解底物，通过级联放大诱发凋亡；,6.抑制剂，防止caspase酶原被偶然激活而对正常细胞造成伤害；,第26页/共93页,第二十六页，共93页。,3.Caspase触发凋亡(dio wn)途径,细胞(xbo)外途径：细胞(xbo)表面死亡受体途径,细胞(xbo)内途径：线粒体引发途径,内质网介导的凋亡通路,第27页/共93页,第二十七页，共93页。,细胞(xbo)外途径,细胞死亡信号(xnho)蛋白结合细胞表面相应受体，死亡受体与配体结合，导致死亡结构域聚集，使死亡受体分子活化；,Caspase-8活化：Caspase酶原在局部聚集，FADD与procaspase-8的DED结合形成信号(xnho)复合物，procaspase-8水解活化形成有活性的caspase-8；细胞凋亡：激活的caspase-8激活下游的caspase引起细胞凋亡,第28页/共93页,第二十八页，共93页。,细胞(xbo)内途径,是哺乳动物细胞程序性死亡的主要途径；,过程：凋亡刺激死亡促进因子，包括细胞色素C、凋亡诱导因子、促死亡蛋白(dnbi)、Caspase酶原释放Caspase活化细胞凋亡,第29页/共93页,第二十九页，共93页。,内质网介导的凋亡(dio wn)通路,内质网钙离子内环境紊乱及过量(guling)内质网蛋白积累激活Caspase-12；,同时胞质中的Caspase-7移入内质网，进一步激活 Caspase-12；,激活的Caspase-12可进一步剪切Caspase-3，细胞凋亡,第30页/共93页,第三十页，共93页。,第31页/共93页,第三十一页，共93页。,第32页/共93页,第三十二页，共93页。,（三）细胞凋亡(dio wn)的调控,1.细胞凋亡的相关因素,（1）诱导性因素,激素和生长因子失衡：缺乏（IL-2，淋巴细胞凋亡）或过多（糖皮质激素，淋巴细胞凋亡）,理化因素：射线、高温、强酸、强碱、乙醇(y chn)、抗癌药物等,免疫性因素：如，CTL分泌粒酶靶细胞凋亡,微生物因素：细菌、病毒及毒素。（HIV）,第33页/共93页,第三十三页，共93页。,（2）抑制性因素(yn s),细胞因子：IL-2、神经营养因子,激素：ACTH、睾丸酮雌激素等,二价金属(jnsh)阳离子：Zn2+,药物：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、中性氨基酸,病毒：EB病毒、牛痘病毒CrmA,第34页/共93页,第三十四页，共93页。,2.细胞(xbo)凋亡信号转导,凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化及细胞(xbo)结构蛋白降解的中间环节。,凋亡信号转导系统的特点：,多样性：不同种类细胞(xbo)有不同系统,耦联性：凋亡与增殖分化系统在某些环节耦联，,同一因素既可引起凋亡也可引起增殖,同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统,多途性：同一凋亡诱导因素可通过不同信号转导系统,第35页/共93页,第三十五页，共93页。,研究(ynji)较多的系统：,依据：,细胞凋亡时胞内游离Ca2+浓度显著上升,用Ca2+载体(zit)A23187人为升高B淋巴细胞Ca2+水平，B淋巴细胞凋亡,用Ca2+络合剂降低胞内Ca2+水平，阻止细胞凋亡,激活Ca2+依赖谷氨酰胺转移酶,Ca2+,活化核转录因子,1,胞内,Ca,2+,信号系统（,Ca,2+,为第二信使）,第36页/共93页,第三十六页，共93页。,2,cAMP/PKA,信号系统（,cAMP,为第二信使）,依据：,双丁酰cAMP可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺细胞凋亡(dio wn),糖皮质激素使cAMP上升,cAMP激活PKA使靶蛋白某些氨基酸（苏、丝AA）残基磷酸化改变蛋白质功能,第37页/共93页,第三十七页，共93页。,3Fas蛋白(dnbi)/Fas配体信号系统,Fas蛋白：细胞膜跨膜蛋白,Fas蛋白+Fas配体（抗Fas）细胞凋亡,机制：,Fas蛋白+Fas配体（抗Fas）神经鞘磷脂酶活性产生神经酰胺蛋白激酶激活细胞凋亡,Fas蛋白+抗Fas、TNF 激活ICE样caspase 降解H1组蛋白染色体松驰DNA暴露内切酶位点,通过Ca2+信号系统传递(chund)死亡信息引起细胞凋亡,第38页/共93页,第三十八页，共93页。,4,神经酰胺信号系统,神经酰胺：神经鞘磷脂（SM）在神经鞘磷脂酶的作用下产生的一类新型第二信使物质。,介导细胞凋亡的依据：用天然(tinrn)神经酰胺处理u937白血病细胞，诱导细胞凋亡,神经酰胺途径相关诱因：电离辐射、TNF-、Fas抗原、糖皮质激素,第39页/共93页,第三十九页，共93页。,5二酰甘油(n yu)/蛋白激酶C（PKC）信号系统,二酰甘油：磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶C催化下产生的一种(y zhn)第二信使物质。,依据：,活化的PKC1可诱导u937白血病细胞凋亡,抑制PKC活性可抑制糖皮质激素诱导的小鼠胸腺细胞凋亡,PKC激动剂佛波脂可抑制某些类型细胞凋亡（糖皮质激素、T细胞受体激活、IL-2撤除）,第40页/共93页,第四十页，共93页。,6酪氨酸蛋白激酶系统(xtng),生长因子或细胞(xbo)因子激活酪氨酸蛋白激酶靶蛋白酪氨酸磷酸化Ras蛋白激活通过Raf-1、MAPKK、MAPK蛋白质磷酸化细胞(xbo)分化,生长因子或细胞(xbo)因子撤除不能激活酪氨酸蛋白激酶系统细胞(xbo)凋亡,第41页/共93页,第四十一页，共93页。,3.凋亡(dio wn)相关基因,抑制(yzh)凋亡基因：Bcl-2,促进凋亡基因：P53、Bax、ICE,双向调节基因：c-myc、Bclx,第42页/共93页,第四十二页，共93页。,(B细胞淋巴瘤/白血病-2B cell lymphoma/leukemia-2基因的缩写),Bcl-2蛋白：229个氨基酸（人）、236个氨基酸（小鼠）,分布：线粒体内膜细胞膜内膜、内质网、核膜,作用：Bcl-2高表达能阻抑多种凋亡诱导(yudo)因素所引起的细胞凋亡,依据：,导入Bcl-2基因质粒可防止神经细胞因撤除神经生长因子所诱导(yudo)的凋亡,淋巴细胞有20%呈Bcl-2阳性时，预后不佳（耐受放射线、抗癌药物）,（,1,）,Bcl-2,第43页/共93页,第四十三页，共93页。,直接的抗氧化作用,抑制线粒体释放(shfng)促凋亡蛋白质（细胞色素C、AIF）,抑制促凋亡调节蛋白Bax、Bak的细胞毒作用,抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活,维持细胞钙稳态,Bcl-2抗凋亡作用(zuyng)机制：,第44页/共93页,第四十四页，共93页。,作用：,野生型（wtP53）：DNA结合蛋白，诱导细胞凋亡（“分子警察”）,突变型（mtP53）：抑制细胞凋亡,野生型P53的作用机制：P53蛋白细胞周期G1期检查染色体DNA损伤（检查点功能(gngnng)）发现DNA损伤剌激CIP的表达阻止细胞进入下一周期，启动DNA修复机制修复失败启动细胞凋亡机制细胞凋亡,（,2,）,P53,第45页/共93页,第四十五页，共93页。,c-myc:,一种癌基因，它能诱导增殖，也能诱导细胞凋亡，具有双向调节作用。,作用机制：c-myc蛋白为重要的转录调节因子(ynz)，既可介导细胞增殖，也可激活介导细胞凋亡，其作用取决于细胞接受何种信号及细胞的生长环境（有生长因子(ynz)增殖，无生长因子(ynz)凋亡）。,Bcl-x：能翻译Bcl-XL和Bcl-Xs两种蛋白，Bcl-XL蛋白抑制细胞凋亡，Bcl-Xs蛋白促进细胞凋亡,（,3,）,c-myc,Bcl-x,第46页/共93页,第四十六页，共93页。,三、细胞(xbo)凋亡的发生机制,1、氧化(ynghu)损伤,氧化损伤的后果之一：细胞凋亡,依据：,各种氧化剂（H2O2）可直接诱导细胞凋亡,抑制超氧化物(cho yn hu w)歧化酶（SOD）活性可诱导细胞凋亡,抗氧化剂（VitE、胡萝卜素等）可阻断有氧化应激背景的各种凋亡诱导因素（TNF-、电离辐射）引起的细胞凋亡,第47页/共93页,第四十七页，共93页。,引起DNA损伤，激活P53基因,引起DNA损伤，活化多聚ADP核糖合成酶，耗竭辅酶(NAD)，消耗大量ATP,攻击细胞膜不饱和脂肪酸，脂质过氧化，细胞膜损伤或产生过氧羟基24碳四烯酸,激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶,细胞膜损伤，Ca2+内流增多及损伤线粒体，通透性增加膜电位改变,活化核转录因子NF-B、AP-1，加速凋亡(dio wn)相关基因表达,氧化损伤引起细胞(xbo)凋亡的可能机制：,第48页/共93页,第四十八页，共93页。,2.钙稳态失衡(sh hn),细胞钙稳态失衡是细胞凋亡的重要机机制之一,依据：,各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程,凋亡发生(fshng)时胞浆Ca2+浓度显著上升，并在随后的一系列凋亡改变中起关键性作用（核酸内切酶激活、需钙蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活，细胞膜的空泡化）,钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病（神经退行性疾病）,第49页/共93页,第四十九页，共93页。,激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链,激活谷氨酰胺转移酶，催化肽链间的酰基转移酶，肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成,激活核转录因子，加速凋亡相关基因表达,Ca2+在ATP的配合(pih)下使DNA链舒展，暴露核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于DNA内切酶切割DNA,钙稳态失衡(sh hn)引起细胞凋亡的可能机制：,第50页/共93页,第五十页，共93页。,3、线粒体损伤(snshng),线粒体的改变：线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜跨膜电位（m）下降，能量代谢水平显著降低,线粒体改变在细胞凋亡发生中起关键作用,依据：,抑制线粒体的三羧酸(su sun)循环或呼吸链功能可诱导细胞凋亡,在细胞核出现凋亡改变之前，常先有线粒体内膜跨膜电位（m）下降,阻止线粒体通透性的改变，可防止细胞凋亡（Bcl-2）,第51页/共93页,第五十一页，共93页。,四、细胞(xbo)凋亡与疾病,（一）细胞凋亡(dio wn)不足,1.肿瘤,发生(fshng)机制：细胞增殖过度是肿瘤发病的一个途径，凋亡受抑、细胞死亡不足是肿瘤发病的另一途径，结果导致病变组织内肿瘤细胞存活延长，存活大于死亡，肿瘤细胞数目净增长加大，形成新生物。,凋亡受抑的依据：,多种肿瘤组织中Bcl-2表达显著高于周围组织,许多肿瘤P53发生(fshng)突变，突变型P53抑制细胞凋亡,第52页/共93页,第五十二页，共93页。,发生机制：从细胞凋亡角度看，自身免疫病的发病是由于细胞凋亡不足，未能有效清除自身免疫性T细胞所致(su zh)。,依据：糖皮质激素能诱导淋巴细胞凋亡，为治疗自身免疫病的有效药物之一。,2.自身(zshn)免疫病,第53页/共93页,第五十三页，共93页。,（二）细胞凋亡(dio wn)过度,1.心血管疾病jbng),（1）心肌缺血与心肌缺血-再灌注损伤,心肌缺血与心肌缺血-再灌注损伤造成的心肌细胞损伤不但有坏死，也有细胞凋亡（干预靶点）。,特点：,缺血早期(zoq)以细胞凋亡为主，晚期以细胞坏死为主,梗死灶中央通常以坏死为主，周边以细胞凋亡为主,轻度缺血以细胞凋亡为主，重度缺血通常以坏死为主,第54页/共93页,第五十四页，共93页。,急性、严重的心肌缺血以坏死为主，慢性、轻度的心肌缺血以细胞凋亡为主,细胞凋亡的机制：,氧化应激有关（SOD可减少(jinsho)细胞凋亡）,Fas上调通过与FasL反应导致细胞凋亡,与P53基因激活有关（缺氧可增加P53基因的转录）,第55页/共93页,第五十五页，共93页。,心肌细胞凋亡造成心肌细胞数量减少可能是心力衰竭发生发展的原因之一。,在压力负荷过重引起的心力衰竭动物模型上观察到左室心肌肥大的同时，心肌细胞数量减少，经分析是由细胞凋亡造成,心衰病人心肌标本(biobn)，心肌凋亡指数高达35.5%，对照组为0.2-0.4%,诱因：氧化应激、压力或容量负荷过重、神经-内分泌失调、细胞因子、缺血缺氧。,（2）心力衰竭(xn l shui ji),第56页/共93页,第五十六页，共93页。,在神经系统疾病中有一类以特定(tdng)神经元进行性丧失为其病理特征的疾病：阿尔茨海默氏病（AD），帕金森氏病，多发性硬化症,举例：阿尔茨海默氏病（AD）与细胞凋亡的关系：AD患者的尸检发现，海马及基底神经核的胆碱能神经元丧失达30-50%，有时高达90%，大脑皮质也有不同程度的神经元丧失，大脑皮质出现广泛萎缩，脑沟变宽，脑回变窄，脑室扩大。,2.神经元退行性疾病(jbng),第57页/共93页,第五十七页，共93页。,诱因：-淀粉样蛋白、钙超载、氧化应激、神经生长因子分泌不足,可能(knng)机制：,致病因素（如：氧自由基）神经元Ca2+内流-淀粉样蛋白合成相关基因激活-淀粉样蛋白神经细胞凋亡,第58页/共93页,第五十八页，共93页。,发病机制：HIV感染CD4+淋巴细胞CD4+淋巴细胞显著免疫功能缺陷(quxin),细胞凋亡相关因素：,gp120糖蛋白：gp120糖蛋白+受体细胞凋亡,合胞体形成：HIV感染合胞体形成细胞凋亡,Fas基因表达上调：HIV感染Fas基因表达上调Fas+FasL细胞凋亡,3.病毒感染_获得性人类免疫(miny)缺陷病（AIDS）,第59页/共93页,第五十九页，共93页。,T细胞激活：HIV感染CD4+细胞激活生长因子缺乏细胞凋亡,细胞因子：HIV感染TNFTNF+TNFR-1细胞凋亡,tat蛋白：HIV感染产生tat蛋白CD4+淋巴细胞诱导产生氧自由基和Fas基因表达(biod)上调Fas+FasL细胞凋亡,HIV慢性感染CD4+（HIV-）淋巴细胞攻击CD4+（HIV+）淋巴细胞细胞凋亡,第60页/共93页,第六十页，共93页。,动脉粥样硬化：内皮凋亡过度，平滑肌细胞(xbo)凋亡不足,依据：,内皮细胞(xbo)凋亡过度：,LDL升高、血小板激活、Ag、高血压可引起内皮细胞(xbo)凋亡,检测粥样硬化的冠状动脉，病变部位内皮细胞(xbo)凋亡达34%，远高于对照8%,平滑肌细胞(xbo)凋亡不足：平滑肌细胞(xbo)凋亡增多，但仅为增殖细胞(xbo)的75%，细胞(xbo)凋亡相对不足。,（三）细胞凋亡(dio wn)不足与过度并存,第61页/共93页,第六十一页，共93页。,五、细胞(xbo)凋亡检测,形态学观察方法,DNA凝胶电泳,酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定(cdng),流式细胞仪定量分析,Western blot检测,第62页/共93页,第六十二页，共93页。,（一）形态学观察(gunch)方法,HE染色(rns)：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色(rns)质成团块状，细胞表面有“出芽”现象,第63页/共93页,第六十三页，共93页。,第64页/共93页,第六十四页，共93页。,2.丫啶橙（AO)染色(rns),AO透过(tu u)胞膜完整的细胞，崁入细胞核DNA，发绿色荧光；,活细胞核呈绿色荧光；,凋亡细胞染色增强，核染色质呈黄绿色或橘红色，浓聚在核膜内侧（核固缩），可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体；,坏死细胞：核染色质橘红色,第65页/共93页,第六十五页，共93页。,第66页/共93页,第六十六页，共93页。,3.台盼蓝染色(rns),如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入(jnr)细胞，细胞变蓝，即为坏死细胞。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞；,区分坏死细胞,第67页/共93页,第六十七页，共93页。,4.透射电镜观察(gunch),可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶(zhu zh)，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体及凋亡小体被临近吞噬细胞吞噬现象。,第68页/共93页,第六十八页，共93页。,第69页/共93页,第六十九页，共93页。,（二）,DNA,凝胶电泳,检测原理：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180200bpDNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡(swng)，并可与坏死细胞区别。,第70页/共93页,第七十页，共93页。,结果(ji gu)判断,正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死(hui s)细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。,第71页/共93页,第七十一页，共93页。,（三）酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定(cdng),凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成(z chn)，可由ELISA法检测。,第72页/共93页,第七十二页，共93页。,检测(jin c)步骤,将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；,在微定量板上吸附组蛋白体；,加上清液使抗组蛋白抗体(kngt)与核小体上的组蛋白结合；,加辣根过氧化物酶标记的抗DNA抗体(kngt)使之与核小体上的DNA结合；,加酶的底物，测光吸收值。,第73页/共93页,第七十三页，共93页。,特点(tdin),该法敏感性高；,应用广泛；,操作(cozu)简单；,不能精确定量,第74页/共93页,第七十四页，共93页。,（四）流式细胞仪定量分析(dnglingfnx),细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用(lyng)这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用(lyng)流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。,第75页/共93页,第七十五页，共93页。,1.PI,单染色法,第76页/共93页,第七十六页，共93页。,第77页/共93页,第七十七页，共93页。,2.,TUNEL,法,即原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique,ISEL)；,原理(yunl)：利用TdT（末端DNA转移酶）将标记的dUPT连接到3-OH端形成新的DNA；,特点：敏感度高，操作简单，应用广泛；,也可以进行形态学观察,第78页/共93页,第七十八页，共93页。,第79页/共93页,第七十九页，共93页。,3.PI-Annexin V,双标法,原理(yunl)：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测；,磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，与PS具有高度的结合力；,将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞染色。,第80页/共93页,第八十页共93页。,第81页/共93页,第八十一页，共93页。,结果(ji gu)判断,正常活细胞Annexin V、PI均低染；,凋亡(dio wn)细胞Annexin V高染、PI低染；,坏死细胞Annexin V/PI均高染。,第82页/共93页,第八十二页，共93页。,第83页/共93页,第八十三页，共93页。,应用(yngyng),细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂，因此(ync)Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡；,较TUNEL法更为灵敏；,不需固定细胞；,是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。,第84页/共93页,第八十四页，共93页。,4.,Hoechst 33342/PI,双染色法,Hoechst和PI均可以与细胞核DNA或RNA结合，但PI不能通过正常的细胞膜，而Hoechst为膜通透性荧光染料，正常细胞、坏死(hui s)细胞、凋亡细胞均着色；,正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），细胞形态正常；凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），核碎片状，边集；坏死(hui s)细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI+）,第85页/共93页,第八十五页，共93页。,第86页/共93页,第八十六页，共93页。,（五）其它(qt)检测方法,Caspase-3活性的检测(jin c),第87页/共93页,第八十七页，共93页。,1.Caspase-3活性的检测(jin c),Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在(cnzi)于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。,第88页/共93页,第八十八页，共93页。,Western blot,分析Procaspase-3的活化，以及(yj)活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等的裂解。,第89页/共93页,第八十九页，共93页。,荧光分光(fn un)光度计分析,原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物）。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映(fnyng)Caspase-3被活化的程度。,第90页/共93页,第九十页，共93页。,细胞凋亡(dio wn)（科普诗）,似秋叶的凋零，,告别(gobi)生命之辉煌；,那难以计数的攻击、诱导，,轻启着道道程序，,逼细胞步步走向生命的末端；,啊，活性氧处处肆虐，,钙波涛惊石裂岸，,线粒体把生命之光一点一点拧淡;,第91页/共93页,第九十一页，共93页。,危难中的细胞啊，,你沉稳不乱，,DNA片片切割，,化云梯直通天堂；,细胞体分团相聚，,把生命的凝重浓集在小体上；,分别了朝夕相处的伙伴，,再见了快乐美好的时光；,这一切(yqi)的一切(yqi)又融入临近的胞体，,腾出的空间再写生命的篇章。,第92页/共93页,第九十二页，共93页。,感谢您的观看(gunkn)！,第93页/共93页,第九十三页，共93页。,