核酸提取及常见问题分析.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,核酸提取及常见问题分析,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,核酸提取及常见问题分析,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,核酸提取 及常见问题分析,TIANGEN BIOTECH(BEIJING),CO.,LTD.,DNA,提取及常见问题分析,RNA,提取及常见问题分析,讲座内容,DNA,提取及常见问题分析,TIANGEN BIOTECH(BEIJING),CO.,LTD.,DNA,提取的原则,DNA,提取的方法,DNA,提取常见问题分析,DNA,提取及常见问题分析,保证,DNA,一级结构的完整性,排除其它分子的污染,RNA,、蛋白质、多糖等,DNA,提取的原则,基因组,DNA,的提取,CTAB,法,SDS,法,质粒,DNA,的提取,碱裂解法,煮沸法线粒体、叶绿体,DNA,的提取,差速离心结合,SDS,裂解法,DNA,提取的方法,基因组,DNA,提取主要方法,CTAB,法,适用于植物组织，真菌等,SDS,法,适用于动物组织，血液，细胞，细菌，酵母等,CTAB,法,(,植物,DNA,提取经典法,),原理,CTAB,（,hexadecyltrimethylammonium,bromide,，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。,该复合物在高盐溶液中（,0.7mol/L NaCl,）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：,CTAB,溶液在低于,15,时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的,植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于,15,。,CTAB,提取缓冲液的经典配方,组份,Tris-HCl,（,pH8.0,）,EDTA,（,pH8.0,）,NaCl,CTAB,-,巯基乙醇,终浓度,100 mM,20 mM,1.4M,2%(W/V),0.1%,（,V/V,）使用前加入,Tris-HCl,（,pH8.0,）,提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；,EDTA,螯合,Mg,2+,或,Mn,2+,离子，抑制,DNase,活性；,NaCl,提供一个高盐环境，使,DNP,充分溶解，存在于液相中；,CTAB,溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,基因组,DNA,CTAB,法,CTAB,提取缓冲液的改进配方,组份,Tris-HCl,（,pH8.0,）,EDTA,（,pH8.0,）,NaCl,CTAB,PVP40,-,巯基乙醇,终浓度,100 mM,20 mM,1.4M,3%(W/V),5%(W/V),2%,（,V/V,）使用前加入,PVP,（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少,DNA,中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,基因组,DNA,CTAB,法,CTAB,法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA,溶液,植物基因组,DNA,提取试剂盒,缓冲液,GP1,缓冲液,GP2,去蛋白液,GD,洗脱缓冲液,TE,吸附柱,CB2(20g),收集管,每个离心柱处理,材料的量为,鲜重：,100mg,干重：,30mg,SDS,法,原理,SDS,阴离子去垢剂,高温（,55,65,）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析,高盐,(KAc,或,NH4Ac),或降低温度（冰浴）,使蛋白质及多糖杂质沉淀,上清液中的,DNA,用酚,/,氯仿抽提,乙醇沉淀水相中的,DNA,组份,Tris-HCl,（,pH8.0,）,EDTA,（,pH8.0,）,NaCl,SDS,终浓度,100mM,20 mM,1.4M,2%(W/V),SDS,提取缓冲液的配方,Tris-HCl,（,pH8.0,）,提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；,EDTA,螯合,Mg,2+,或,Mn,2+,离子，抑制,DNase,活性；,NaCl,提供一个高盐环境，使,DNP,充分溶解，存在于液相中；,SDS,裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；,动物组织细胞,裂解液,上层溶液,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA,溶液,组织匀浆,SDS,法流程图,细菌基因组,DNA,提取试剂盒,血液,/,细胞,/,组织基因组,DNA,提取试剂盒,病毒基因组提取试剂盒,酵母基因组,DNA,提取试剂盒,CB2,：20,(,g),SDS,提取试剂盒,细菌基因组,DNA,提取试剂盒,1,5ml,细菌菌液,/,离心柱,10-4,0,g,血液,/,细胞,/,组织基因组,DNA,提取试剂盒,全血,100,l,1ml 3-30,g,动物细胞培养液,10,6,10,7,cells 5-30,g,动物组织,30mg 10-30,g,病毒基因组提取试剂盒,DNA,RNA,酵母基因组,DNA,提取试剂盒,Lyticase(20U/,g,）,不同材料对,SDS,提取试剂盒提取量,96,血液基因组,DNA,试剂盒,一次实验可提取,96,个样品，快捷、方便。,不同材料对,SDS,提取试剂盒提取量,基因组,DNA,其它裂解方法根据细胞裂解方式的不同有：,物理方式：玻璃珠、超声波、研磨、冻融,化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解,生物方式：酶法,基因组,DNA,纯化的方法,吸附材料结合法：,吸附材料,纯化原理,硅质材料,高盐低,pH,值结合核酸,低盐高,pH,值洗脱,阴离子交换树脂,低盐高,pH,值结合核酸,高盐低,pH,值洗脱,磁珠,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的,硅基质膜,(,离心柱型,)DNA,产物纯化试剂盒,超薄,普通,大量,寡核苷酸,96,CB1,CB2,CB3,CB2,CB2,5,g,20,g,40,g,20,g,20,g,100bp-40kp,100bp-40kp,100bp-40kp,20bp-10kb,100bp-40kp,质粒,DNA,提取,TIANGEN BIOTECH(BEIJING),CO.,LTD.,碱裂解法,煮沸法,碱裂解法原理,染色体,DNA,比质粒,DNA,分子大得多，且染色体,DNA,为,线状分子，而质粒,DNA,为共价闭合环状分子；,当用碱处理,DNA,溶液时，线状染色体,DNA,容易发生变性，共价闭环的质粒,DNA,在回到中性,pH,时即恢复其天然构象；,变性染色体,DNA,片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒,DNA,分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液,III,中和,溶液,I,充分重悬,溶液,II,裂解,上清液,上层溶液,抽提,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,质粒,DNA,溶液,离心柱型 质粒,DNA,提取试剂盒,小提,小提中量,大提,高纯度小提,高纯度小提中量,无内毒素小提,酵母,1,5ml,5-15ml,100-200ml,1-5ml,5-15ml,1,5ml,1,5ml,CB3,CB4,CB5,CB3,CB4,CB3,CB3,40,g,70,g,1000,g,40,g,70,g,40,g,40,g,去蛋白液,去蛋白液,去内毒素树脂,去蛋白液,Lyticase,96,系列,96,高纯质粒小提试剂盒,96,快速质粒小提试剂盒,96,个样品,96,个样品,去蛋白液,CB3(,40,g),异丙醇或者酒精沉淀,细胞器,DNA,提取,TIANGEN BIOTECH(BEIJING),CO.,LTD.,细胞器,DNA,线粒体,叶绿体,差速离心法原理,是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。,将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA,提取基本步骤,基因组,DNA,新鲜材料，低温保存,血液基因组,DNA,提取选择有核细胞,细胞培养时间不能过长,含病毒的液体材料提取前先富集,质粒,DNA,对数期的菌体,培养时应加入筛选压力低拷贝或大质粒，应加大菌体用量,菌株不要频繁转接（质粒丢失）,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA,提取基本步骤,基因组,DNA,材料过多影响裂解，导致,DNA,量少，纯度低,针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：,植物材料液氮研磨,动物组织匀浆或液氮研磨,组培细胞蛋白酶,K,细 菌溶菌酶破壁,酵 母破壁酶或玻璃珠,质粒,DNA,菌体量适当，除净培养基,变性的时间不要过长（,5,分钟）,控制复性时间，避免基因组,DNA,的污染,G,菌、酵母细胞酶或机械处理,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA,提取基本步骤,采用吸附材料吸附分离,DNA,，应提供相应的缓冲体系,采用有机溶剂（酚,/,氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀,离心分离两相时，应保证一定的转速和时间,针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA,提取基本步骤,蛋白质的去除：,酚,/,氯仿抽提,使用变性剂（,SDS,、异硫氰酸胍等）,蛋白酶处理,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA,提取基本步骤,多糖的去除：,多糖水解酶,在提取缓冲液中加,1/2,体积氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。,用,PEG8000,代替乙醇沉淀,DNA,：在,500L DNA,液中加入,200l 20%PEG8000(,含,1.2 M NaCl,),，冰浴,20min,。,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA,提取基本步骤,多酚的去除：,加入还原剂：,-,巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等,加入易与酚类结合的试剂：如,PVP,、,PEG,，可防止酚类与,DNA,的结合,盐离子的去除：,70,的乙醇洗涤,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA,提取基本步骤,预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀,加入,1/10,体积的,NaAc,（,pH5.2,，,3M,）更充分沉淀,晾干,DNA,，让乙醇充分挥发,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,若长期储存建议使用,TE,缓冲液溶解,pH,值为,8.0,，可防止,DNA,发生酸解,DNA,提取基本步骤,问题一：,DNA,降解,材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老,提取操作过于剧烈，,DNA,被打断,外源核酸酶污染,低温保存，避免反复冻融,液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入裂解缓冲液,增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后操作应尽量轻柔,试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌,DNA,分装保存于缓冲液，避免反复冻融,问题二：,DNA,样品不纯,DNA,中含有蛋白、多糖、多酚类杂质,DNA,在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应,DNA,中残留有金属离子,重新纯化DNA,，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）,重新沉淀,DNA,，让酒精充分挥发,增加,70,乙醇洗涤的次数（,2-3,次）,实验材料不佳或量少,破壁或裂解不充分,沉淀不完全,洗涤时,DNA,丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料,动植物要匀浆研磨充分；,G,菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁,高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加,PK,的用量）,低温沉淀，延长沉淀时间,加辅助物，促进沉淀,洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,问题三：,DNA,提取量少,RNA,提取及常见,问题,分析,TIANGEN BIOTECH(BEIJING),CO.,LTD.,RNA,提取相关知识及注意事项,RNA,提取方法,RNA,提取常见问题分析,10,7,个细胞,10,g,30mg,动物组织，,30-100mg,植物组织,rRNA,占,80,85,mRNA,占,1-5%,AAAAAA,细胞中,RNA,的含量,AAAAAA,tRNA,mRNA,rRNA,RNAase,mRNA,的应用,RT-PCR,Northern,杂交，,cDNA,文库构建,mRNA,末端快速扩增,(RACE),，差异表达,(DDRT-PCR),，引物延伸反应，体外转录,RNA,标记，,RNA,酶保护试验，,RNA,微注射,(RNA Microinjection),RNA,的不稳定性,内因：,核糖残基的,2,和,3,位置带有羟基，易被水解,外因：,内源、外源,RNA,酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活,常用的,RNA,酶抑制剂,焦碳酸二乙酯（,DEPC,）,与,RNA,酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，强烈但不彻底的,RNA,酶抑制剂,异硫氰酸胍,目前是最有效的,RNA,酶抑制剂，裂解组织的同时也使,RNA,酶失活。,RNasin,从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。可以和多种,RNA,酶结合，使其失活,氧钒核糖核苷复合物,由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和,RNA,酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制,RNA,酶的活性,SDS,、尿素、硅藻土等,常用的,RNA,酶抑制剂,RNAsafe,RNA,酶抑制剂,提取,RNA,的注意事项,经常更换新手套。皮肤和实验室用品上可能有,RNase,，会导致,RNase,污染,塑料器皿可用,0.1%DEPC,水浸泡,4-10,小时，再灭菌,玻璃器皿可在,180,烘烤,4,小时,塑料制品和枪头避免交叉污染,RNA,提取相关知识及注意事项,RNA,提取方法,RNA,提取常见问题分析,异硫氰酸胍,/,苯酚法,细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放,释放出来的,DNA,和,RNA,由于在特定,pH,下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离,动植物材料,研磨或匀浆,细胞裂解,基因组,DNA,水相,有机相,RNA,氯仿,纯化,pH5.7,离心,加入裂解液,(TRNzol),RNA,提取流程示意图,等体积异丙醇沉淀,70,乙醇洗涤沉淀,晾干溶解,RNA,吸附柱,去蛋白液,漂洗,洗脱,水相,RNA,传统方法：有机溶剂抽提，得率高,柱纯化法：纯度高，无有机溶剂,RNA,提取流程示意图,TRNzol(DP405),RNAprep(DP401),RNAultra(DP406),RNAprep(DP402),RNAplant(DP407),普遍适用,动物组织,富含多糖和酚类的植物组织,50-100mg/500,l,30-100mg/,离心柱,30-100mg/,离心柱,50100mg/1ml,可选择的,RNA,提取产品,材料准备,TRNzol,裂解细胞,加入氯仿抽提,RNA,沉淀 柱纯化,RNA,溶解,保存,植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位,培养细胞除尽培养液,消化系统的组织选取杂质少的部位,细菌和酵母需要破壁处理,样品切成小块投入液氮或专门的,RNA,样品储存液中保存,液氮研磨时不要使液氮挥发净,RNA,提取基本步骤,材料准备,TRNzol,裂解细胞,加入氯仿抽提,RNA,沉淀 柱纯化,RNA,溶解保存,异硫氰酸胍、酚,(TRNzol,),裂解细胞灭活,RNase,TRNzol,要与细胞组织充分接触,裂解尽量充分,RNA,提取基本步骤,材料准备,TRNzol,裂解细胞,加入氯仿抽提,RNA,沉淀 柱纯化,RNA,溶解保存,氯仿抽提时充分混匀,离心分离两相，保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和,DNA,分布到有机相和中间层，,RNA,留在水相中,注意避免吸入中间层,不慎吸入再次用有机溶剂抽提,RNA,提取基本步骤,材料准备,TRNzol,裂解细胞,加入氯仿抽提,RNA,沉淀 柱纯化,RNA,溶解保存,异丙醇低温沉淀,RNA,高盐低,pH,值，核酸与硅胶膜结合,70,乙醇洗涤，晾干,用经,DEPC,处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解,RNA,70,分装保存或加入,RNase,抑制剂,(RNAsafe),RNA,提取基本步骤,RNA,提取相关知识及注意事项,RNA,提取方法,RNA,提取常见问题分析,RNA,提取常见问题一：样品不纯,蛋白,多糖多酚,DNA,离子,保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心,增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化,加入不含,RNase,的,DNase,处理,增加洗涤次数,RNA,提取常见问题二：得率低,样品太多或太少,RNA,在柱子上未洗出,洗出液中有酒精,减少或增加样品使用量,加入,RNaseFree,放置几分钟再离心,漂洗后再次离心,RNA,提取常见问题三：降解,样品不新鲜或保存不当,RNase,污染,RNA,溶液储存不当,取新鲜的样品；取样后立即放入液氮或储存液保存,研磨样品及时补充液氮,严格处理相应的器具和试剂,-70,冻存，分装使用,谢谢大家！,联系我们,技术支持：,010-62521767 62526072,24,小时热线：,010-80972619,免费咨询：,800-810-2177,E-mail,：,peopletw-,TIANGEN,公司,福州特约经销商：厦门泰京驻福州办事处,订货电话：,0591-83758122 87640182,E-mail:,market,