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1、标 题 微生物限度检查操作规程 编码：KＦ—SＯP－０7－１3－2 共 １９ 页 第 1 页 起 草 人 审 核 人 批 准 人 起草日期 审核日期 批准日期 起草部门 质量管理部 颁发部门 办公室 生效日期 一、范围：本标准规定了微生物限度得检查方法与操作要求；适用于检品需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数、控制菌得检查。 二、引用标准：《中国药典》２015年版（通则1１05-1106） 三、目录 1。微生物限度标准 2.设备、仪器及用具 3。消毒液、稀释剂、试液及培养基 4。检查总则(通则1105：非无菌产品微生
2、物限度检查：微生物计数法,通则1106 非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法） 5。微生物计数法检查 6.控制菌检查法 7．实验技术 8、 附件 １.微生物限度标准 非无菌药用原料及辅料得微生物限度标准 需氧菌总数（cｆu/ｇ 或 cfｕ/mｌ) 霉菌与酵母菌总数(cｆu/g 或 cfu/ml） 控制菌 药用原料及辅料 10３ 102 * *未做统一规定。 1、1成品微生物限度标准 品 名 法 定 标 准 内 控 标 准 需氧菌总数(cｆu/g 或 ｃfu/ml） 霉菌与酵母菌总数（c
3、fｕ/ｇ 或 cfu/ml) 控制菌 需氧菌总数（cｆu/g 或 ｃfu/ｍｌ） 霉菌与酵母菌总数（cfu/ｇ 或 cfu／ml) 控制菌 大肠埃希菌 沙门菌 大肠埃希菌 沙门菌 乳糖 ≤100０ ≤100 — 无 ≤100 ≤50 — — 无水乳糖 ≤100 ≤１0 —/１0g —/100g ≤10０ ≤1０ -/１0g —/１00g 蔗糖 无 无 无 无 ≤10０ ≤50 — - (1）．“—”为不得检出。 (2)．目测霉变者以不合格论。 （３）。“无”为标准依据或无相应规定。 标 题 微生物限度检查
4、操作规程 编码:ＫF—SＯP－０7－１3-2 共 １９ 页 第 2 页 1、2工艺用水微生物限度标准 品 名 法 定 标 准 内 控 标 准 需氧菌总数(ｃｆu/mｌ) 控制菌（MPN／100mL或CFU／100mＬ） 需氧菌总数（cfu/ml） 控制菌（ＭPN／1０0mL或CFU/100mＬ） 生活饮用水 ≤10０ 不得检出 ≤１00 不得检出 纯化水 ≤ｌOO 不得检出 ≤８0 不得检出 1、3内包装材料微生物限度标准 品 名 （单位） 需氧菌总数 霉菌与酵母菌总数 控制菌 需
5、氧菌总数 霉菌与酵母菌总数 控制菌 药用聚乙烯烃塑料袋（100ｃｍ2) ≤1０0０cfu ≤1０0cfu - ≤100cｆu ≤１0cfu - 说明: 1．“—”为每１０0 cｍ2中不得检出。2。目测霉变者以不合格论。３.“无"为标准依据或无相应规定. 2.设施、仪器及用具 2、１、设施： 2、１、1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查得要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染得措施不得影响供试品中微生物得检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 ２、1、2．其她设备:高压蒸汽灭菌器;细菌培养箱(3０~3
6、５℃);霉菌培养箱(２5～2８℃)；电炉(或其她适宜得加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱(250~３00℃)；电冰箱。生化试剂储存箱。 2、2仪器及器皿 2、2、1。菌落计数器；显微镜（15０0X）;电子天平或药物天平（感量0、1ｇ）;ｐH系列比色计。 2、2、2．玻璃器皿：锥形瓶(2５０~３００ml,内装玻璃珠若干)、研钵（玻璃或陶瓷制,∮10～12ｃm)、培养皿（∮9 ｃm）、量筒(１00 ml）、试管（1８×180ｍm）及塞、吸管（1ml分度0、01， 10 ml分度0、１)、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。 2、2、3新购得玻璃器皿得清洁:先用流水冲洗，浸泡于1％~２%盐酸（
7、工业用）液中约2～6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗.用于化学分析得玻璃仪器,需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2～3次，晾干备用。 2、3用过得玻璃器皿： 2、3、1未被病原微生物污染得器皿：可随时洗涤.用清水冲洗(或浸泡)，除容量仪器外，可用毛刷与肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净,晾干备用.容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗,最后以纯化水涮洗2～3次. 标 题 微生物限度检查操作规程 编码:KＦ-SOP—0７-13—2 共 19 页 第 ３ 页 2、３、2已被病原微生物污染得器皿：需先经过灭菌处理后再按常法洗涤。 试管及
8、培养皿:先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内,经1２1℃灭菌30 分钟.趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗,最后以流水涮净。 吸管:全部直立浸没于清洁液得长筒形容器中,筒底应衬有棉或橡皮垫,以防管尖损坏。24小时后,逐支用流水反复冲洗洁净,晾干后包扎灭菌备用。 载、盖玻片：应分别浸泡于清洁液12~２4小时后，取出用流水冲洗，再放入３％～5％肥皂水或5％碳酸钠液内煮沸10~1５ 分钟，待自然冷却后，再用流水冲洗。沥干后置９5％乙醇中浸泡，晾干备用。 ２，3,３玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管口上端距０、5 cm处塞入约2cm得适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量
9、筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时,尚需用玻璃纸包裹瓶塞（以免振荡时供试液污染瓶塞），再用牛皮纸包扎.玻璃器皿,均于160℃干热灭菌2小时或高压蒸汽1２1℃灭菌3０ 分钟,烘干备用. 2、4用具 2、4、１大、小橡皮乳头(放于干净带盖得容器中,并应定期用７0%～75％乙醇溶液浸泡）。 2、4、2无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套,用牛皮纸包严)灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。 2、４、3接种环（白铱金或镍铬合金,环径4~5mｍ、长度6～10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀与灭菌镊子、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白
10、瓷盘、洗手盆、陶瓦盖(12 ｃｍ）、实验记录纸等。 3消毒液、稀释剂、试液及培养基 3、1消毒液、稀释剂及试液。 3、1、１ ０、１%苯扎溴铵溶液:供洗手、擦拭操作台面用。 3、1、2 5％石碳酸溶液：配制后装入玻璃消毒缸内,供消毒带菌吸管用，抑或选用其她适宜消毒液. 3、1、３.7５%乙醇溶液：配好后制乙醇棉球,供擦手、擦拭操作工具用。 3、1、４．0、9％无菌氯化钠溶液：取氯化钠9、０g,加水使溶解成1０00ml，121℃灭菌2０分钟. ３、1、5．司盘-80、单硬脂酸甘油酯、吐温-8０：供非水溶性供试品供试液制备用。 3、1、６。无菌0、１%氯化三苯四氮唑溶液（TTC
11、)：取氯化三苯四氮唑０、1g，加水使溶解成１０ ｍl。 3、1、７．甲基红指示液：取甲基红0、１ｇ,加入95％乙醇3００ml,水适量，使溶解，再加水至500ml。 3、1、８.V－Ｐ试液：①氢氧化钾试液：取氢氧化钾４0、０ｇ，加水使溶解成1００ｍｌ;②α—萘酚乙醇试液：取α—萘酚6、0g,加无水乙醇使溶解成100ml. 3、1、9.革兰染色液：①沙黄染液:取沙黄0、25g，加95%得乙醇１0ｍｌ,使完全溶解后,加水至１00ml；②结晶紫染液：取结晶紫1、０g,加95％得乙醇2０ml，使溶解，加1％得草酸铵溶液80ｍｌ,混匀。静置48小时使用,置密闭棕色瓶中储存;③碘试液：取碘化钾2、0g
12、加水3～5ｍl使溶解,加入碘片1、0g，使全部溶解后，加水稀释至300ｍl,置密 标 题 微生物限度检查操作规程 编码：KF—ＳOP-07-13-2 共 １9 页 第 4 页 闭棕色瓶中储存. 3、１、１０．中性红指示液：取中性红1、0g,研细，加95%乙醇60ml,使溶解,再加水到100ml。变色范围 pH6、8~8、０（红→黄）。 ３、1、1１．亚甲蓝指示液:取亚甲蓝0、5ｇ,加水使溶解成100mｌ。 3、１、1２．溴麝香草酚蓝指示液:取溴麝香草酚蓝0、4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0、６4ml使溶解,再加水至１０0mｌ。变色范围 pＨ6、０～7、6（
13、黄→蓝）。 ３、1、13．酸性品红指示液：以酸性品红0、5g，加水１00mｌ使溶解,再逐渐加1mol／Ｌ氢氧化钠溶液1６ml,每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水内保持15分钟，再静置２小时，滤过,即得。优点:无色,在倒管内早期发酵易观察,不易被还原。变色范围 pH6、０~７、4(红→黄）。 3、1、14．曙红钠指示液:取曙红钠2、0g,加水使溶解成100ml。 ３、1、１５。靛基质试液:取对二甲氨基苯甲醛1、０ｇ,加入95％乙醇９5ml,充分振摇，使完全溶解后,取浓盐酸20ml徐徐滴入,边加边振摇,以免骤热导致溶液色泽变深,置 冰箱保存,备用。 3、２培
14、养基 3、２、１．培养基得制备及储存 3，２,1,1溶化：一般应放在玻璃器皿或搪瓷器内。加入纯化水,隔水加热以促其溶解,加热时应经常搅拌,防止焦结，待其溶解后补足水分。 3、2、1、２在使用干燥培养基时，先将纯化水按定量加入容器中，然后称取一定量培养基干粉放入水中,静置10～15 分钟，搅拌，振荡,或延长时间以促进溶解，一般不要加热，必要时加热，但时间不宜过长,温度不宜过高，避免某些营养成分被破坏。 ３、2、１、3校正酸碱度:培养基必须有适当得ｐH值。测定pH值就是培养基配制过程中得重要步骤之一，干燥培养基一般已校正过pH值,用时也必须再验证。pH值测定时,一般用指示剂滴入培养基中观察
15、其颜色得变化,或用pH计校正，如与所需pH值不符，可用酸或碱液加以校正.一般用氢氧化钠校正得弱碱性培养基,高压灭菌前培养基得pH值高０、2左右,灭菌后基本合适。调整pH值后要加热过滤，使培养基澄清。 ３、2、２培养基得分装： 3、２、2、1液体、半固体培养基一般在高压灭菌前分装,约装试管容积得1/3,在灭菌后还要加入成分得液体、半固体培养基,灭菌后再分装于灭菌试管或锥形瓶中。 3、２、２、2固体培养基一般分装在250 ｍl、500 ml锥形瓶中,高压灭菌后根据需要分装平皿或试管。 平皿：如倾注平皿,应在无菌室中放置3～4小时,如用塑料平皿须在35℃培养箱中倒置30～６0 分钟.水蒸气会
16、自然蒸发。 斜面：制备低层斜面分装于试管，约占容积得1/5，灭菌后趁热斜放于细玻璃棒与木杆上，使成斜度,分装时注意管口与瓶塞上勿沾有培养基，避免污染. 制备高层斜面分装于试管,约占试管容积得1／３,灭菌后趁热放置成高层短斜面,待其凝固后应用. 3、2、3培养基得灭菌：培养基得灭菌多采用高压蒸汽灭菌，各种培养基得灭菌时间与压力,按其成分不同而定。普通培养基多采用121℃、１03、４2kＰａ灭菌 15 分钟,但容器与装量较大时，可延长至２０ 分钟.高压灭菌应严格按照操作规程进行，必须逐渐加热，彻底排除灭菌器内得冷空气,再逐渐升压保持预定得压力与时间，达到全杀灭微生物得目得。 标 题
17、 微生物限度检查操作规程 编码：KF-ＳＯＰ-07-13—２ 共 1９ 页 第 5 页 3、2、４培养基得储存：保存培养基得时间需视培养基中水分蒸发得程度及有无污染而定，已制备好培养基要保存于冷暗处或冰箱中,但由于各种培养基得性质不同，不可能 固定一个保存期限。制备好得平板或试管培养基，为防止水分蒸发，应置于塑料袋内,4℃保存，可延长使用期限。微量生化反应管熔封于细玻管内，室温下可保存1年左右。 3、3注意事项： ３、3、1采用干燥培养基时，按说明配制，应对灭菌后得培养基pH值进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂得用量。试剂规格要求应为
18、化学纯（CP）以上规格，其中不能含有对细菌、霉菌、大肠杆菌生长有害得抑制物。３、３、2配制得培养基不应该有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤,并应于2小时内灭菌，避免细菌繁殖。 3、3、3培养基得分装量不得超过容器得2/3，以免灭菌时溢出.包装时,塞子必须塞 紧,以免松动或脱落造成染菌. 3、3、4配制培养基得ｐH值测定时,其波动范围应在规定得pＨ±0、2之内，还需注意高压灭菌后得ｐH值变化。 3、3、5每批培养基均应有配制记录,包括名称、配制量(各种成分用量）、配制者、校对者、配制日期以及性能与无菌试验。 3、3、６每批培养基在用于样品得分离鉴定之前均应作性能试验，以保证微生物检验
19、得质量。性能试验须用已知标准菌株进行预试，符合要求方可应用. 3、3、7棉塞以普通棉花制作,棉塞松紧应适宜，过松易污染杂菌，过紧影响透气性;每次用后需高压灭菌并随即烘干,要防尘、防霉；变硬无弹力时需更换. 3、3、8各种试管应先配上合适得棉塞，待高压灭菌后再分装培养基,可防止污染。 3、３、9培养基配制时,应先将有沉淀物得原料如蛋白胨、牛肉膏、盐类与琼脂配好,经调节pＨ值、加热并煮沸溶化后再滤清；滤清时注意趁热过滤，滤除异物、沉淀后,应将蒸发失去得溶液量按原溶液量加纯化水补足。 ３、3、10应严格遵守各种培养基规定得灭菌温度与时间，灭菌后培养基不得有混浊现象，每瓶配制并灭菌后得培养基、
20、稀释剂均应在外表清楚标明灭菌日期。 3、3、１1每批稀释剂、培养基均应有空白试验,合格后方能使用。 3、3、１2灭菌后得培养基在冷暗处保存，放置时间不能过长,一般在两周内用完。久存培养基失水过多、固体干涸变形、液体出现沉淀、棉塞松弛或脱落者均不得使用。已熔化得培养基应一次用完，开启后不宜再用。 3、3、１3勿用电炉直接熔化琼脂培养基,以免营养成份过度受热而破坏,应用水浴或微波炉加热。 4、 检查总则(11０5非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法） 4、1微生物计数法适用范围:系用于能在有氧条件下生长得嗜温细菌与真菌得计数。当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等就是否符合相应得微生物
21、限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品得取样量与结果得判断等.除另有规定外,本法不适用于活菌制剂得检査。如供试品有抗菌活性,应尽可能去除或中与。供试品检査时,若使用了中与剂或灭活剂,应确认其有效性及对微生物无毒性。供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中与剂或灭活剂得相容性。 标 题 微生物限度检查操作规程 编码:KF－SOP－０７—13-2 共 19 页 第 6 页 4、2微生物计数法 4、2、1 适用性试验用菌株(表１) 试验菌株 试验菌液得制备 计数培养基适用性检查 计数方法适用性试验 需氧菌总数计数 霉菌与酵母
22、菌总数计数 需氧菌总数计数 霉菌与酵母菌总数计数 金黄色葡萄球菌 （ Staphyｌococｃus ａ ｕ reu ｓ) Ｃ C Ｍ C Ｃ （B ) 2６ 003〕 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基,培养温度３ ０ 〜3 5 C ，培养时间 18〜２4小时 胰酪大豆胨琼脂培养基与胰酪大豆胨液体培养基,培养温度3０—３5℃培养时间不超过3 天，接种量不大于 10０cfu 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（M P N 法),培养温度30-35℃, 培养时间不超过３ 天,接种量不 大于１00cfu 铜绿假单胞菌 （Pseuｄomｏｎas ae
23、rugｉｎoｓa) CCMCC ( B ） 1０ 10４ 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基,培养温度３0－３5℃，培养时间18〜２4小时 胰酪大豆胨琼脂培养基与胰酪大豆胨液体培养基,培养温度3０-35℃培养时间不超过3天，接种量不大于１0０ｃfｕ 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（M Ｐ N 法)，培养温 度30—３5℃，培养时间不超过 3天，接种量不大于1００cfu 枯草芽孢杆菌 ｛、Ｂaｃilluｓ subtiliｓ) 〔CMCC(B)63 ５０1〕 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆 胨液体培养基，培养温度30-３5℃培养时间１8—24小时
24、 胰酪大豆胨琼脂培养基与胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30－35℃ 培养时间不超过3天，接种量不大于 lOOcfｕ 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（M Ｐ N 法），培养温 度3０-3５℃，培养时间不超过３天,接种量不大于lＯＯｃfu 白色念珠菌 （Candida albicans) CCMCＣ（Ｆ)9８ ０01〕 沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄 糖液体培养基,培养温度20-25℃培养时间2-3天 胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30—35℃培养时间不超过5 天，接种量不大于lOOｃｆu 沙氏葡萄糖琼脂培养基,培养温度２0—２5℃培养时间不超过5 天，接
25、种量不大于ｌOＯcfｕ 胰酪大豆胨琼脂培养基(M P Ｎ 法不适用)培 养温度3 0 〜3 5 °C，培养 时间不超过5 天,接种量不大于ｌOＯcfu 沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20－２5℃培养时间不超过5 天，接种量不大于lOOcｆu 标 题 微生物限度检查操作规程 编码：KF－SOP—07—13—２ 共 19 页 第 7 页 黑曲霉（Ａsper君山ｗs niger） C C M C C (F ） 98 00３〕 沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡 萄糖琼脂培养基,培养温度20—25℃ 培养时间5〜7 天,或直到获得丰富得孢子 胰酪大豆胨琼脂
26、培养基，培养温度30-35℃培养时间不超过5 天，接种量不大于ｌOOｃfu 沙氏葡萄糖琼脂培养基,培养温度20-25℃培养时间不超过5天,接种量不大于lOOcfu 胰酪大豆胨琼脂培养基（M P N 法不适用)培 养温度30—35℃培养 时间不超过5 天，接种量不大于lOOｃfu 沙氏葡萄糖琼脂培养基,培养温度20－２5℃培养时间不超过５天,接种量不大于lOＯcfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检査方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。 4、2、2 计数方法：包括平皿法、薄膜过滤法与最可能数法（Ｍoｓt－Probaｂle－Numbeｒ Meｔ
27、ｈｏd， 简称 MPN 法)。MＰＮ 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小得供试品,M P N法可能就是更适合得方法。供试品检查时,应根据供试品理化特性与微生物限度标准等因素选择计数方法,检测得样品量应能保证所获得得试验结果能够判断供试品就是否符合规定。所选方法得适用性须经确认。计数培养基适用性检査与供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用得培养基应进行适用性检查。供试品得微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用得方法适合于该产品得微生物计数。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。 4、2、３ 菌种及菌液制备 4、2
28、３、1菌种试验用菌株得传代次数不得超过5 代(从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第０ 代)，并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性. 4、2、3、2计数培养基适用性检查与计数方法适用性试验用菌株见（表１)。菌液制备按（表1）规定程序培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌得新鲜培养物，用PH7、０无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或０、９％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液；取黑曲霉得新鲜培养物加人3〜5ｍl含０、 ０5％ (m l/ｍ l）聚山梨酯8 0得ｐH７＿0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或０、９％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱.然后，采用适宜得方法吸
29、出孢子悬液至无菌试管内,用含0、0５％(ml/ｍl)聚山梨酯８0得ｐＨ7、0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0、９%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置,应在２ 小时内使用;若保存在2〜8℃,可在2 4小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2〜８ ℃，在验证过得贮存期内使用. 4、2、4阴性对照 为确认试验条件就是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查. 4、2、5培养基适用性检査 微生物计数用得成品培养基、由脱水培养基或按处方配制得培养基均应进行培养基适用性检查。按（表１） 规定,接种不大于lOOｃfu得菌液
30、至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表１ 规定条件下培养。每一试验 标 题 微生物限度检查操作规程 编码:KF-SOP-07-13—2 共 19 页 第 ８ 页 菌株平行制备2 管或2 个平皿。同时,用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验。被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0、５〜2 范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上得菌落一致;被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好. 4、3计数方法适用性试验 4、3、1供试液制备 根据供试品得理化特性与生物学特性，采取适宜得方法
31、制备供试液。供试液制备若需加温时,应均勻加热，且温度不应超过45℃.供试液从制备至加入检验用培养基，不得 超过1 小时。常用得供试液制备方法如下(如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其她适宜得方法） 4、3、1、1水溶性供试品取供试品,用PH7、０无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液,或PＨ7、 2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成１ : 1 0供试液。若需要,调节供试液ｐ H值至６〜8。必要时,用同一稀释液将供试液进一步1 0倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合得供试品原液作为供试液。 4、3、1、２水不溶性非油脂类供试品取供试品,用pH7、 0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，
32、或PH７、 2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成1 ： 1 ０供试液.分散力较差得供试品，可在稀释液中加人表面活性剂如0、１ ％得聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要,调节供试液ｐ Ｈ 值至6〜8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步1 ０倍系列稀释. ４、３、1、3油脂类供试品取供试品,加人无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化得无菌聚山梨酯8 ０或其她无抑菌性得无菌表面活性剂充分混勻.表面活性 剂得温度一般不超过4 0 t：（特殊情况下，最多不超过４5°C） ，小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加人预热得稀释液使成1 ： 1 0 供试液,保温，混合，并在最短时
33、间内形成乳状液.必要时，用稀释液或含上述表面活性剂得稀释液进一步10倍系列稀释。 4、3、1、4需用特殊方法制备供试液得供试品膜剂供试品取供试品,剪碎,加Ｐ H ７ 、0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液,或P Ｈ 7 、2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基,浸泡，振摇,制成1 : 1 ０得供试液。若需要,调节供试液p H 值至6〜8。必要时,用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品,加人P H 6 、8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或ＰH7、 ６ 无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂），置45℃水浴中，振摇,使溶解，制成１：10 得供试液。必要时，用同一稀释液将供试液
34、进一步10倍系列稀释。 4、3、1、5气雾剂、喷雾剂供试品取供试品,置一20°C或其她适宜温度冷冻约１小时,取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温,并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。供试品亦可采用其她适宜得方法取出.用无菌注射器从每一容器中吸出药液于无菌容器中混合,然后取样检査。 ４、３、１、６贴剂供试品取供试品，去掉防粘层,将粘贴面朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上，在粘贴面上覆盖一层适宜得无菌多孔材料（如无菌纱布),避免贴膏剂粘贴在一起.将处理后得贴膏剂放入盛有适宜体积并含有表面活性剂(如聚山梨酯8 0或卵磷脂)稀释液得容器中,振荡至少3 0分钟。必要时,用
35、同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释. 标 题 微生物限度检查操作规程 编码:KF—SＯP-07—13－2 共 １9 页 第 ９ 页 ４、3、2、 接种与稀释 按下列要求进行供试液得接种与稀释,制备微生物回收试验用供试液。所加菌液得体积应不超过供试液体积得1%.为确认供试品中得微生物能被充分检出,首先应选择最低稀释级得供试液进行计数方法适用性试验。 ４、3、2、1试验组取上述制备好得供试液，加入试验菌液,混勻，使每ｌm l供试液或每张滤膜所滤过得供试液中含菌量不大于lＯOcfｕ. 4、3、2、2供试品对照组取制备好得供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作
36、 4、３、2、3菌液对照组取不含中与剂及灭活剂得相应稀释液替代供试液,按试验组操作加人试验菌液并进行微生物回收试验。 ４、3、2、4若因供试品抗菌活性或溶解性较差得原因导致无法选择最低稀释级得供试液进行方法适用性试验时,应采用适宜得方法对供试液进行进一步得处理。如果供试品对微生物生长得抑制作用无法以其她方法消除，供试液可经过中与、稀释或薄膜过滤处理后再加人试验菌悬液进行方法适用性试验。 4、4抗菌活性得去除或灭活 供试液接种后,按下列“微生物回收” 规定得方法进行微生物计数。若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数得值小于菌液对照组菌落数值得５0％ ,可采用下述方法消除供 试品得抑菌活
37、性. 4、4、1增加稀释液或培养基体积。 4、4、2加入适宜得中与剂或灭活剂.中与剂或灭活剂（表2 ）可用于消除干扰物得抑菌活性，最好在稀释液或培养基灭菌前加入。若使用中与剂或灭活剂,试验中应设中与剂或灭活剂对照组，即取相应量稀释液替代供试品同试验组操作，以确认其有效性与对微生物无毒性。中与剂或灭活剂对照组得菌落数与菌液对照组得菌落数得比值应在0 、5〜2 范围内。 表2 常见干扰物得中与剂或灭活方法 干扰物 可选用得中与剂或灭活方法 戊二醛、汞制剂 酚类、乙醇、醛类、 醛类 季铵化合物、对羟基苯甲酸、双 胍类化合物 季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸 水银 水银、汞化物、
38、醛类 EDTA、唆喏酮类抗生素 磺胺类 β内酰胺类抗生素 亚硫酸氢钠 吸附物稀释法 甘氨酸 卵磷脂 聚山梨酯 巯基醋酸盐 硫代硫酸盐 镁或钙离子 对氨基苯甲酸 β内酰胺酶 4、4、3采用薄膜过滤法^ ４、4、4上述几种方法得联合使用。若没有适宜消除供试品抑菌活性得方法，对特定试验菌回收得失败，表明供试品对该试验菌具有较强抗菌活性,同时也表明供试品不易被该类微生物污染。但就是,供试品也可能仅对特定试验菌株具有抑制作用,而对其她菌株没 标 题 微生物限度检查操作规程 编码:KF-SOP—0７—13－２ 共 １9 页 第 1０ 页 有抑制作用。因此
39、根据供试品须符合得微生物限度标准与菌数报告规则,在不影响检验结果判断得前提下,应采用能使微生物生长得更高稀释级得供试液进行计数方法适用性试验.若方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级得供试液进行供试品检査。 4、5供试品中微生物得回收 表１所列得计数方法适用性试验用得各试验菌应逐一进行微生物回收试验.微生物得回收可采用平皿法、薄膜过滤法或M PＮ法。 ４、5、1平皿法平皿法包括倾注法与涂布法。表１ 中每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果。倾注法:取照上述“ 供试液得制备” “ 接种与稀释”与“抗菌活性得去除或灭活” 制备得供试液lｍl，置直径9
40、0mm得无菌平皿中，注入15〜2０ml温度不超过4５℃熔化得胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基,混匀，凝固,倒置培养。若使用直径较大得平皿，培养基得用量应相应增加.按表1规定条件培养、计数.同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组得平均菌落数。涂布法:取15〜２0mｌ温度不超过45℃得胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注人直径9０ｍm得无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜得方法使培养基表面干燥。若使用直径较大得平皿,培养基用量也应相应增加。每一平板表面接种上述照“供试液得制备” “接种与稀释” 与“抗菌活性得去除或灭活” 制备得供试液不少于０、１ml.按表1规定条件培养、计数。同
41、法测定供试品对照组及菌液对照组菌数.计算各试验组得平均菌落数。 4、5、２薄膜过滤法薄膜过滤法所采用得滤膜孔径应不大于0、45pm,直径一般为5０ｍm，若采用其她直径得滤膜,冲洗量应进行相应得调整。供试品及其溶剂应不影响滤膜材质对微生物得截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜得方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后得完整性。水溶性供试液过滤前先将少量得冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜与滤器在使用前应充分干燥.为发挥滤膜得最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量一般为1０0mｌ.总冲洗量不得超过1000ｍl，以
42、避免滤膜上得微生物受损伤。取照上述“供试液得制备” “ 接种与稀释" 与“抗菌活性得去除或灭活” 制备得供试液适量（一般取相当于ｌg 、lｍ l或10cm2得供试品,若供试品中所含得菌数较多时,供试液可酌情减量)，加至适量得稀释液中，混匀，过滤。用适量得冲洗液冲洗滤膜.若测定需氧菌总数,转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上;若测定霉菌与酵母总数,转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。按表１ 规定条件培养、计数。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。 4、５、3MPＮ法M P Ｎ法得精密度与准确度不及薄膜过滤法与平皿计数法，仅在供试品需
43、氧菌总数没有适宜计数方法得情况下使用，本法不适用于霉菌计数。若使用M P N法， 按下列步骤进行。取照上述“供试液得制备” “ 接种与稀释” 与“ 抗菌活性得去除或灭活” 制备得供试液至少3 个连续稀释级，每一稀释级取3 份lm l分别接种至3 管装有９〜１０ｍl胰酪大豆胨液体培养基中，同法测定菌液对照组菌数。必要时可在培养 基中加入表面活性剂、中与剂或灭活剂。接种管置30〜35°C培养3 天,逐日观察各管微生物生长情况。如果由于供试品得原因使得结果难以判断，可将该管培养物转种至胰 标 题 微生物限度检查操作规程 编码:KＦ－ＳOP-０7-1３—2 共 19 页 第
44、 １1 页 酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基,在相同条件下培养１〜2 天,观察就是否有微生物生长。根据微生物生长得管数从表3 查被测供试品每l g 或每ｌm l中需氧菌总数得最可能数。 表３ 微生物最可能数检索表 生长管数 需氧菌总数 最可能数 95%置信限 每管含样品得g 或m l数 M Ｐ Ｎ /g 或 m l 下限 上限 ０、 1 0、 01 0、００１ 0 ０ 0 〈３ 0 9、４ ０ 0 １ ３ 0 ９、5 0 1 0 ３ 0、１ １0 0 1 1 6、1 １、2 1７ 0 2 0 6、２ 1
45、２ １７ 0 3 0 9、4 ３、5 35 1 0 ０ 3、６ 0、2 17 1 0 １ ７、2 1、2 1７ １ 0 2 1１ ４ 35 1 1 ０ 7、4 1、3 ２0 1 １ 1 １１ 4 35 1 2 0 11 ４ 35 1 2 １ 15 ５ ３8 1 ３ ０ 1６ 5 38 ２ ０ 0 9、2 1、5 ３5 ２ 0 1 1４ 4 ３5 ２ 0 2 20 5 38 2 1 ０ 15 4 38 2 １ 1 2０ ５ ３
46、8 ２ 1 ２ 27 9 ９4 2 ２ 0 21 5 40 2 2 １ 2８ 9 9４ 2 ２ 2 35 ９ 9４ ２ 3 0 29 9 94 2 3 1 3６ ９ 94 3 0 ０ ２3 5 94 3 0 1 38 9 １０4 3 0 2 6４ １6 181 3 1 ０ ４3 9 181 3 １ 1 ７5 17 1９0 标 题 微生物限度检查操作规程 编码：ＫＦ—SOP-０７-13—２ 共 １9 页 第 12 页 3 1 ２ 12
47、0 3０ ３6０ 3 1 ３ 1６0 30 3８０ 3 2 ０ 93 １８ 36０ 3 2 1 150 3０ 380 3 2 2 ２10 30 400 3 2 3 290 90 9９０ 3 3 ０ ２40 90 990 ３ 3 1 460 90 1980 ３ 3 ２ １１00 20０ ４000 3 3 3 >1100 注:表内所列检验量如改用l g (或m l )、0、 ｌ g ( 或ｍ l ）与O、Ｏｌg(或ｍ l ）时,表内数字应相应降低1 ０ 倍；如改用Ｏ 、O lg (
48、 或m l)、Ｏ、OOｌg（ 或m l ）与O、OＯOlg（ 或m l )时,表内数字应相应增加１ ０ 倍，其余类推。 ５、 微生物计数法检查 ５、1计数方法适用性试验中,采用平皿法或薄膜过滤法时,试验组菌落数减去供试品对照组菌落数得值与菌液对照组菌落数得比值应在０ 、5〜2 范围内;采用M P N法时，试验组菌数应在菌液对照组菌数得95%置信限内。若各试验菌得回收试验均符合要求，照所用得供试液制备方法及计数方法进行该供试品得需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数计数。方法适用性确认时,若采用上述方法还存在一株或多株试验菌得回收达不到要求，那么选择回收最接近要求得方法与试验条件进行供试品得检査.
49、5、2供试品检查 5、2、1检验量：检验量即一次试验所用得供试品量(g、m l或cｍ2) 。 一般应随机抽取不少于2 个最小包装得供试品，混合,取规定量供试品进行检验。 除另有规定外，一般供试品得检验量为10g或１0ml；膜剂为1０0ｃm2； 贵重药品、微量包装药品得检验量可以酌减.检验时，应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品,大蜜丸还不得少于4 丸，膜剂还不得少于4 片. 5、2、2供试品得检査按计数方法适用性试验确认得计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数得测定。胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测 定需氧菌总数;沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌与酵母菌总
50、数阴性对照试验以稀释液代替供试液进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长，如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调査。 ５、3平皿法 平皿法包括倾注法与涂布法.除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性试验确认得方法进行供试液制备与菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备２ 个平板。培养与计数除另有规定外,胰酪大豆胨琼脂培养基平板在３０〜3５°C培养3〜5 天,沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20〜25°C培养5〜７ 天，观察菌落生长情况,点计平板上生长得所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片得平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液得平均菌落数,按菌数报告规则报告菌数.若同稀释级两个平板得菌落数
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