1、实验一 巨噬细胞吞噬功能实验ﻫ
1、【实验原理】
(１)巨噬细胞作为单核吞噬细胞系统得主要细胞,具有活跃得吞噬功能、能清除体内抗原物质及变性得细胞,在特异性及非特异性免疫中均起重要作用、MΦ受抗原刺激后活化,可使其吞噬功能明显增强。
(2)此实验采用体内法,即:在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后,再给小鼠腹腔注射鸡红细胞３0mｉn后处死小鼠,取出腹腔液,以冷美蓝染色,油镜下计数吞噬鸡红细胞得百分数,及观察巨噬细胞中内因被杀死而染为蓝色得鸡红细胞得形态、数目,以判断巨噬细胞中得杀伤能力,由此间接地测定机体得非特异免疫水平、
２、【实验步骤】
(1)试验前3d,小白鼠腹腔注射６％无菌
2、淀粉液1ml,诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。
(2)实验时,每只小鼠腹腔注射鸡红细胞液1ml,轻揉腹部,使红细胞在腹腔中分布均匀,利于吞噬
(３)3０mｉn后,将小鼠拉颈处死,固定,打开腹腔暴露肠管,用吸管取出腹腔液,均匀涂布于载玻片上,然后再滴一小滴0、03％冷美蓝溶液,盖上盖玻片。ﻫ(4)低倍镜下找到观察区域后,换高倍镜下进行观察,计数
3、【实验结果】
4、【结果分析】
(1)如图所示,在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后,再给小鼠注射鸡红细胞后镜检腹腔液,可观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞得现象,并且可以瞧到部分鸡红细胞聚集到吞噬细胞附近。
(2)镜下可见吞噬细胞核呈蓝色,被吞噬得鸡红细
3、胞呈椭圆形,其胞浆呈红色而核被染成蓝色。
(3)由于未将腹腔液与冷美蓝溶液充分混合均匀,使得视野中出现大片深染区域。总体实验结果较好,视野中央可见清晰得吞噬了鸡红细胞得巨噬细胞、ﻫ
5、【注意事项】
(1)涂片得薄厚要适当,否则影响计数、
(２)小鼠腹腔注射时不要刺伤内脏。
(3)如小鼠腹腔液过少,可注入适量生理盐水、
(4)剪开小鼠腹腔时应避免出血,否则将影响试验结果。
(5)被吞噬得鸡红细胞时间过长可被消化,时间过短未被吞噬,必须掌握好吞噬作用时间、
实验二 双向琼脂扩散实验
1、【实验原理】
(1)可溶性抗原 与相应抗体特异性结合,两者比例适当并有电解质存在
4、及一定得温度条件下,经一定得时间,可形成肉眼可见得沉淀线／环得现象,称为沉淀反应 、
(2)琼脂扩散就是指为可溶性抗原与抗体在琼脂凝胶中所呈现得一种沉淀反应。当对应得抗原、抗体在半固体琼脂终相遇,且二者比例适当时,便出现可见得白色沉淀线,这组沉淀线就是一组抗原、抗体得特异性复合物。当琼脂中有多组不同得抗原、抗体存在时,便各自依其扩散速度得差异,再适当得部位形成独立得沉淀线。因此,琼脂扩散不仅用于疾病得诊断,更广泛地用于抗原成分得分析。
(3)双向琼脂扩散试验就是定性实验。将可溶性抗原与相应抗体分别加人琼脂板上得孔内,两者均可扩散,在抗原抗体比例适宜处形成可见得沉淀线。如果不就是相应得抗原与
5、抗体,就不出现沉淀线。本试验常用于分析抗原抗体得纯度及相互关系。
2、【实验步骤】
(1)制板:将熔化得1％琼脂加在玻片上,３ml／板。
(２)打孔:待琼脂凝固后,在板上打孔。
(３)加样:在空中加入相应抗原、抗体、
(４)结果观察 将琼脂板放入湿盒内置 ３7c 温箱中 2４ 小时后取出观察结果、
ﻫ３、【实验结果】
ﻫ４、【结果分析】
(1)如图所示,在中央孔与添加抗原1得孔之间出现沉淀线,有抗原抗体反应,为阳性反应,说明抗原１与抗体相对应。中央孔与添加抗原2得孔之间没有沉淀线,说明抗原2与抗体之间不相对应。
(2)抗体与抗原发生扩散时,随扩散距离得增大浓度降低,在抗原抗体比例适宜处形成可见得沉淀线。当有沉淀线出现时,说明有抗原抗体反应。
5、【注意事项】ﻫ(1)加样时不要将琼脂划破,以免影响沉淀线得形成、
(2)反应时间要适宜,时间过长,沉淀线可解离而导致假阴性、不出现或不清楚。
(3)加样时不同浓度抗体与抗原不要混淆,影响试验结果。
(4)试验前应做预试验,确定抗体得稀释度。
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