核酸提取试剂盒课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,核酸提取试剂盒,洛阳惠尔纳米科技,有限公司,狄光辉,试剂盒,试剂盒分类,核酸提取,磁珠法，离心柱法，DNA和RNA，不同样本,蛋白检测,elisa试剂盒，免疫共沉淀试剂盒，化学发光试剂盒，免疫组化试剂盒，放射免疫试剂盒，免疫荧光试剂盒,重金属检测,不同重金属离子检测，不同样本中重金属离子检测,其他,PH检测，污染气体检测等等,核酸提取试剂盒,核酸核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内、生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。,根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸，简称RNA和脱氧核糖核酸，简称DNA。,DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。,RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用，其中转移核糖核酸，简称tRNA。,起着携带和转移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，简称mRNA，是合成蛋白质的模板。,核糖体的核糖核酸，简称rRNA，是细胞合成蛋白质的主要场所。,核酸提取试剂盒,DNA提取试剂盒,RNA提取试剂盒,DNA提取方法,DNA提取方法,1.碱裂解法：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的。,2.煮沸法：煮沸时将样品中的DNA通过核酸裂解液的作用释放出来，离心沉淀后将杂质去除，上清液即可用作pcr扩增。,3.浓盐法：利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯化纳提取,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来。,4.苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。,DNA提取方法,5.水抽提法：利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%，80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,即得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS。,6.阴离子去污剂法：用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。,DNA提取方法,DNA,提取方法,磁珠法：生物磁珠是一种新型的功能化固体载体，其表面包被有活性基团，可以与多种生物活性物质发生偶联，兼具有液体的流动性和固体磁性材料等特点，在外磁场的作用下可以定向移动和集中，当撤去外磁场后，稍加振荡或抽吸又可均匀分散于液体中，从而使固液相的分离变的十分快捷方便，通过简单的洗脱可以得到纯度很高的靶向物质。,核酸提取试剂盒,离心柱子法,柱子,磁珠法,生物磁珠离心柱试剂盒（细菌）概述,本试剂盒用于极大部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌细胞基因组DNA的提取。该试剂盒提供的方法简单易行，通过去垢剂处理和特殊的液体系统将裂解细胞后产生的DNA结合在柱材上，避免酚仿抽提。所获的基因组DNA具有完整性好、产量大、纯度高和稳定性好等特点。可以满足PCR、酶切、分子杂交和文库构建等各种分子生物学实验需要。,离心柱试剂盒组成,离心柱及收集管,各 xxx个,溶菌酶缓冲液 ELB xxxml,裂解液 GDL xxxml,缓冲液 GDB xxxml,蛋白洗涤液 PWB,xxxml,洗涤液 WB,xxxml,蛋白酶 K xxxml,洗脱液 EB xxxml,离心柱操作步骤所有离心步骤皆使用台式离心机，为室温下操作。,第一次使用前请先参考试剂瓶上的标签，在洗涤液,WB,中加入无水乙醇。,1.,取适量的细菌培养液（最多提取的细菌数量为,2,109,个），,10,000rpm,离心,1,分钟，弃上清，留细菌沉淀备用。,2.,提取的细菌为革兰氏阴性菌，可以在菌体沉淀中加入,200,l,裂解液,GDL,。用吸头吹打几下，充分混匀。然后进入步骤,4,3.,提取的细菌为革兰氏阳性菌，必须要进行溶菌酶破壁处理（如不确定为何种菌属，请按处理革兰氏阳性菌的方法进行）。具体操作如下：称,20mg,溶菌酶，置于,1.5ml,离心管中，取,1ml,溶菌酶缓冲液,ELB,，反复吹打几次将溶菌酶完全溶解，配制成溶菌酶裂解液。向细菌沉淀中加入,200,l,溶菌酶裂解液（未用完的溶菌酶裂解液可保存于,20,，以备下次使用），吹打重悬细菌沉淀。,37,破壁处理,30,分钟以上，一些较难处理的细菌可以延长处理时间。破壁处理完成后便可以将水浴温度调至,70,备用。,4.RNA,清除处理，补加,5,lRNase,A,溶液，充分混匀。,5.,加入,15,l,蛋白酶,K,，充分混匀。,6.,加入,220,l,缓冲液,GDB,充分混匀。加入缓冲液,GDB,可能会出现白色沉淀，放置于,70,水浴时便会消失。,离心柱操作步骤,7.,对于革兰氏阴性菌,70,保温,15,分钟（革兰氏阳性菌需,70,保温,30,分钟）。等溶液变成清亮后，离心数秒去除管壁上的水珠。如果溶液未变清凉，说明细菌裂解不充分，起始菌量太大，需要适当调整。,8.,加入,220,l,的无水乙醇，剧烈振荡，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。,9.,将离心柱装在收集管上，然后将所得的溶液及沉淀都转移入离心柱中。,12,000rpm,离心,1,分钟，倒掉收集管中的滤液。,10.,加入,500,l,蛋白清洗液,PWB,，,12,000rpm,离心,1,分钟。倒掉收集管中的滤液。并将离心柱放回收集管中。,11.,加入,500,l,洗涤液,WB,，,12,000rpm,离心,30,秒。（使用前请检查是否已经加入无水乙醇）,12.,重复步骤,11,的操作一次。,13.12,000,离心,1,分钟，去掉离心柱中的所有液体。将离心柱放在一个干净的新的,1.5ml,离心管中，置于,37,烘箱放置,510,分钟，待管中的乙醇全部挥发为止。,14.,往离心柱中央悬空滴加经,70,水浴预热的,100-200,l,洗脱液,EB,。室温放置,2,分钟后，,12,000rpm,离心,30,秒，洗脱,DNA,到离心管中。为了得到更多的,DNA,，可以再加,100200,l,洗脱液,EB,，室温放置,2,分钟后，,再次洗脱,DNA,。,15.,取,10,lDNA,进行,0.8,琼脂糖电泳检测提取,DNA,的完整性和质量。,离心柱注意事项,1.起始菌量对DNA提取的产量和质量有很大影响。起始菌量过多会引起细菌裂解不充分，导致堵塞离心,柱。一般情况下，LB液体培养基培养的大肠杆菌细菌在对数生长期中后期时的细菌浓度约为107108,个/ml,之间。OD600在1.0时，大肠杆菌浓度大致为109个/ml。过夜（1216小时）培养细菌OD600值大约为2.0。不同细菌因菌株特性和培养条件差异会有很大差异，为了获得准确的计数，可以通过测定OD600值和稀释法测定克隆形成单位(CFU)相结合的方法来确定。,2.确定所提细菌的归属关系也是一个重要的影响因素。革兰氏染色（Gram,stain）是细菌分类和鉴定的,重要性状。它不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称,为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G表示。细胞壁成分和结,构的差异造成两类细菌对革兰氏染色的不同反应。G+菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成,的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶,紫碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，故呈蓝紫色；G细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质,含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫碘复合物易被乙醇抽出而,脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，故呈红色。,离心柱注意事项,3.革兰氏阳性细菌主要包含细菌中的厚壁菌门(Firmicutes)（低G+C革兰氏阳性细菌）和放线菌门(Actinobacteria)（高G+C革兰氏阳性细菌）。厚壁菌门包括的常见菌属：归类于芽孢杆菌纲(Bacilli)的芽孢杆菌(Bacillus)、李斯特氏菌(Listeria)、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)和肠球菌(Enterococcus)；归类于梭菌纲(Clostridia)的常见属梭菌(Clostridium)和归类于柔膜菌(Mollicutes),的支原体(Mycoplasma)。放线菌门常见菌属如放线菌(Actinobacteria)和双歧杆菌,(Bifidobacterium)。,4.RNase A配制：将称好的RNase A完全溶于10mmol/L TrisHCl（pH7.5），0.15 mmol/L NaCl的溶液中，500,l每管分装到1.5ml离心管中。100煮10分钟。然后冷却至室温，-20保存备用。,洛阳惠尔核酸提取试剂盒产品,植物基因组,DNA,提取试剂盒,动物组织基因组,DNA,提取试剂盒,动物病毒（,DNA/RNA,）提取试剂盒,中草药基因组,DNA,提取试剂盒,细菌基因组,DNA,提取试剂盒,全血基因组,DNA,提取试剂盒,血清游离,DNA,提取试剂盒,快速质粒,DNA,提取试剂盒,血清病毒（,DNA/RNA,）提取试剂盒,海洋生物,DNA,提取试剂盒,磁珠法病毒（,DNA/RNA,）提取试剂盒,法医样本,DNA,提取试剂盒（骨骼、牙齿、指甲等）,法医样本,DNA,提取试剂盒（毛发、口腔拭子、血斑、精斑、烟蒂等）,禽类全血,DNA,提取试剂盒,真菌,DNA,提取试剂盒,PCR,纯化试剂盒,磁珠法试剂盒概述,磁珠法核酸提取试剂盒采用具有独特分离作用的磁珠和缓冲液系统，从样品中分离纯化高质量基因组DNA，特殊包被的磁珠，在一定条件下对目的DNA具有很强的亲和力，而当条件改变时，磁珠释放吸附的DNA，能够达到快速分离纯化DNA的目的。整个过程不涉及有毒试剂，安全、便捷、提取的DNA纯度高。使用本试剂盒纯化的基因组DNA(OD260-OD320)/(OD280-OD320)均在1.72.0之间，可以应用到各类下游分子生物学实验。,磁珠法注意事项,1.Buffer B,、,Buffer C-20,保存，反复冻融不超过,3,次。,2.Buffer B,管中粉末状固体，可能会挂到瓶壁或瓶盖上，加入洗脱液溶解时，拧紧瓶盖后，充分混匀。,3.Buffer A,低温储存可能会出现白色絮状漂浮物，使用前在恒温水箱中温育至白色沉淀完全溶解，不影响使用效果。,4.,磁珠使用前一定要充分混匀。,5.,如果下游实验对,RNA,污染比较敏感，可在裂解时加,1,l RNaseA,（,10mg/ml,）。,6.,如果是干材料，适当延长裂解时间；种子用粉碎机打成粉末状使用，样品为种子时，裂解时间为,30min,。,7.,如果同等取样量下欲得到更多,DNA,可以增加洗脱次数（洗脱次数最好不要超过,3,次），也可以适当延长裂解时间。,磁珠法试剂盒,组成成分：,裂解液,结合液,洗涤液,洗脱液,生物磁珠,说明书,实验步骤,裂解,结合,洗涤,洗脱,四步操作，简单快速,步骤详解,裂解,破坏细胞，把,DNA,释放到溶液中,结合,把释放出的,DNA,吸附到磁珠上,洗涤,把结合过程中吸附的杂质除去,洗脱,把纯净的,DNA,从磁珠上解离下来,操作步骤（植物）,1.裂解,取新鲜植物组织xxxmg，与研钵中稍加研磨。加入xxx,l Buffer A、xxx,l Buffer B、xxx,l Buffer C，研磨均匀，然后转移至1.5ml EP管中，混合均匀（可用漩涡振荡器，xxxrpm）。然后把EP管置于恒温水箱中xxx温育xxxmin。,2.结合,将EP管从温育设备中取出，xxxr离心xxxmin。取xxx,l上清，加入振荡混匀的磁珠xxx,l、xxx,l结合液(也可加入xxx,l异丙醇，产量高于加结合液;但是提取双子叶植物种子的核酸时，异丙醇的量为上清体积的xxx倍为宜)，颠倒混匀xxxmin。将EP管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液，（吸净管盖及管底残液）。,3.洗涤,加入xxx,l洗涤液，点振xxx次（若有团状或丝状物可增加点振次数及力度），然后磁分离，吸净管盖及管底的残液,加入xxx,l洗涤液，点振xxx次（若有团状或丝状物可增加点振次数及力度），然后磁分离，吸净管盖及管底的残液,4.洗脱,加入xxx,l洗脱液，缓慢抽吸混匀，xxx温浴xxxmin。每隔xxxmin轻摇EP管几下混匀。然后磁分离，小心吸取上清液至新的EP管中，进行下游实验。,常见问题及处理,可能原因,建议,样品没有研磨充分,尽量将样品研磨充分,组织没有完全裂解完，没有离心直接进行下一步操作,如果样品裂解后，一定要离心后再进行下一步操作,结合不充分,结合过程中要使磁珠一直处于悬浮状态，结合时间严格按照说明书,取样量大于说明书给出量,严格按照说明书操作,得率低,常见问题及处理,条带弥散,样品不新鲜或样品反复冻融多次,尽量用新鲜样品进行试验，如果样品需要保存，可根据试验，将样品分装成几份，尽量避免反复冻融,研磨时间太长,研磨尽量迅速，防止,DNA,降解,环境温度太高,可以将研钵置于,-20,预冷,20min,后再进行研磨，如果所提取材料基因组极易降解，可用液氮研磨,裂解时间太长,裂解时间不要超过,60min,提取后模板,DNA,放置时间太长,提取后尽量及时跑电泳，也可,-20,保存，一周内电泳（要避免反复冻融）,常见问题及处理,洗脱液有颜色,洗涤过程不充分,如果结合后磁珠呈团状、丝状或颗粒状，要增加点震力度及次数,裂解不充分,将组织充分研磨、可增加,Buffer A,用量、也可以延长裂解时间,样品用量大于说明书给出量而其他试剂用量没有相应调整,严格按照说明书操作，如果需要增大样本量，可以等比例增大,Buffer A,、,Buffer B,以及磁珠用量，其他试剂用量可以不改变,磁珠法较离心柱的比较优点,生物磁珠具有小尺寸效应和表面效应，可高效DNA提取，满足微量生物样本DNA提取的要求。,生物磁珠表面功能团数量可以控制提取的DNA的浓度，实现定量提取的要求。,生物磁珠能够通过仪器进行自动化操作，满足数据库建设对大批量样本提取的需要，减少人为因素,用时少，操作简单，适用于大多数生物检材。,全自动核酸提取最大限度地减少了操作人员与检测的接触，可有效保护实验操作人员。,不使用酚、氯仿、异戊醇等有毒试剂，安全无毒，绿色环保。,与传统提取DNA法相比速度更快！纯度更高！一般情况下不需离心操作，单一样品多在1h内提取完毕。对全血、骨骼、植物等提取DNA在不PCR扩增的情况下能在凝胶电泳中看到较为明亮的条带。,谢谢大家！,