真菌感染实验诊断学习PPT教案.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三章真菌感染实验诊断,第一节 真菌的基本特性,真菌是一大类具有典型细胞核，不含叶绿素，不分根、茎叶的真核细胞型微生物。,一、,真菌的,形态特性,（一）单细胞真菌呈圆形，如酵母菌。,（二）多细胞真菌由菌丝和孢子组成，,称丝状菌或霉菌。,菌丝和孢子的形态因菌而异，是鉴定,真菌的重要依据。孢子又分为多种，,如叶状孢子、分生孢子和孢子囊孢子,等。,二、真菌菌落特性,真菌培养要求不高，常用沙氏,(Sabouraud),培养基,(,含,1,蛋白胨、,4,葡萄糖或麦芽糖、,2,琼脂,),培养，,适宜温度,22,28,，但深部真菌为,37,。形成三种菌落，菌落形态是,鉴别真菌的重要依据。,1,酵母型菌落 是单细胞真菌的菌,落，形态与细菌菌落相似，较大，,表面光滑湿润柔软、边缘整齐，,如新生隐球菌。,2.,类酵母型菌落 如白假丝酵母菌，,形成假菌丝，伸人培养基中。,3,霉菌型菌落 是多细胞真菌的菌,落。菌落呈棉絮状、绒毛状，并,产生不同的色素，如皮肤癣菌。,第二节 标本采集及检验程序,一、临床标本的采集,(,一,),临床标本类别,1,皮肤的角质性物质：毛发、,指,(,趾,),甲、皮屑等。,2,各种分泌物和排泄物：生殖道,分泌物、耳垢、痰、粪便、尿,液等。,3,血液和体液：体液包括胸水、,腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。4,脓汁及渗出物。,(,二,),采集标本注意事项,1.,采集的标本要适宜 不同真菌感染,应采取不同的临床标本。怀疑为浅,部真菌感染如体癣，应刮取病变边,缘的痂、皮屑，发癣应取病发。深,部真菌感染应取血液、脑脊液、脓,汁等。,2,在用药前采集标本 一般真菌,标本须在用药前采集，对已用,药者则需停药一段时间后再采,集标本。,3,采集的标本量要足 血液和脑,脊液标本,5ml,，胸腔液,20ml,，,皮屑标本两块，活体组织两份,(,一份送病理科检查，一份作,镜检和培养,),。,4,严格无菌操作 并进行消毒处理，,尤其是采集血液和脑脊液标本，,要避免污染杂菌。,5,采集标本立即送检 深部真菌标,本最长不得超过,2h,。,第三节 真菌检验,一、标本直接检查,(,一,),显微镜检查,直接镜检对真菌病的诊断较细菌更为重要。,许多真菌标本不需染色即可直接镜检，如癣病,标本多用,KOH,湿片检查法，即取病发或病损部位,皮屑、甲屑置于载玻片上，加,1,滴,10,-20,KOH,液，然后加盖玻片并微微加热，使标本组织溶解,透明，在显微镜下可观察到真菌的孢子和菌丝。,直接镜检的意义,直接镜检阳性表示：,有诊断意义，如浅部真菌病等；,看到的就是真菌的形态，可确定某,些致病性真菌的属或种,如假丝酵,母菌的厚膜孢子等；,判断某些真菌种的致病性等,如,皮肤癣菌、曲霉等。,直接镜检也有局限性：,阴性结果不能排除真菌感染；,有假阳性结果。,因此，对直接镜检可疑结果应,作复查或用其他检验方法鉴定。,(,二,),抗原检测,常用的方法有胶乳凝集试验、,ELISA,、半定量放射免疫法。,均应设对照，防止发生假阳,性和假阴性。,用胶乳凝集试验检测标本中的白,假丝酵母菌甘露聚糖抗原。,用胶乳凝集试验和,ELISA,检测血,清和脑脊液中的隐球菌多糖荚膜抗,原，在治疗前检测非常敏感特异。,用半定量放射免疫法检测血清、,尿液和脑脊液中荚膜组织胞浆菌循,环多糖抗原，可快速诊断。,二、真菌的分离培养,真菌培养是目前鉴定真菌的惟一,方法。培养真菌的温度为,28,，,但深部真菌为,37,。菌落是鉴,别真菌的方法。注意以下几点：,菌落性质：酵母菌还是霉菌；,菌落大小，病原性真菌菌落小，,而条件致病性真菌菌落大；,菌落颜色 病原性真菌颜色淡，,污染真菌颜色深；,致病性真菌菌落下沉，有时使,培养基开裂；污染性真菌菌落,不下沉,很少引起开裂。,三、真菌的生化反应,用于主要深部感染真菌如假丝酵,母菌、隐球菌等。,1.,糖,(,醇,),类发酵试验,37,孵育，,观察糖发酵情况。,2.,同化碳源试验 含菌生理盐水,与已融化的固体同化碳源培养,基,(45),混合，然后在培养基,上分别加糖，置,25,孵育观察,结果。若,24h,后无变化可重复,加糖。如能同化周围有生长圈，,否则无生长。,3.,同化氮源试验 同化碳源试,验相同，但需用无氮源的培,养基，不要加糖类，而加入,硝酸钾。,四、动物实验,实验的目的是分离病原性真菌、,确定真菌菌种的致病性、研究药物,对真菌的作用等。如假丝酵母菌接,种家兔或小白鼠，肾脏明显肿胀，,肾皮质部位有白色脓疡。,五、核酸检测,医学真菌的鉴定手段引入了分子生,物学的鉴定方法，从核酸碱基,G+C,mol,分析、限制性片段长度多态,性,(RFLP),、,Southern,印迹分析到脉,冲场凝胶电泳,(PFGE),、,PCR,指纹、,随机扩增多态性,DNA(RAPD),以及,DNA,特殊片段测序等。,（一,)G+Cmol,分类鉴定法,常用热变性温度法。原理是,DNA,加热变性使碱,基氢键被打开，双链螺旋变成单链，导致核,苷酸碱基在,260nm,紫外吸收明显增加，完全,变成单链后，紫外吸收增加停止。紫外吸收,增加的中点值温度为热变性温度（,Tm,）。,若真菌,DNA,中,G+C,碱基对含量多，,Tm,值就高。,可直接反映,G+C,碱基对的绝对含量。,计算公式为：,G+Cmol,=(Tm-53.9)2.44,(,二,),真菌核型的脉冲电泳分析,脉冲凝胶电泳技术,(PFGE),解决,了真菌大分子,DNA,的分离技术难题。,原理：,PFGE,有两个方向的电场在设,定的脉冲时间里交替变换，使大分,子,DNA,在移动中不断改变自己的形状,及迁移方向，从而绕过细小的凝胶,孔隙而得以分离。较大的,DNA,分子泳,动慢些，较小的快些，有许多因素影,响电泳带型，分离真菌等大分子量的,DNA,宜用较低电压和较长脉冲时间。,用,PFGE,分析真菌核型，可直接比较,其遗传背景,从电泳核型差异中进行,分类鉴定,又能取得基因结构的基本,数据，构建出大尺度物理图谱。,(,三,),随机扩增多态性,DNA(RAPD),分析,RAPD,分析是一种利用随机合成的单个,寡核苷酸引物，通过,PCR,扩增靶细胞,DNA,，扩增产物凝胶电泳，分析,DNA,片段大小和数量的多态性，从而比,较靶基因差异的一种技术。由于病,原性真菌基因组庞大，,RAPD,分析适,用于真菌的鉴定与分类。,六、真菌毒素的检测,真菌产生有毒的代谢产物，可引起急,慢性真菌中毒症，引起消化道中毒症,状，而且可进入人体内引起病变，如,引起肝脏损伤的黄曲霉毒素、杂色曲,霉毒素；引起肾脏损害的桔青霉素；,引起中枢神经系统损害的黄绿青霉素,等。甚至有的毒素具有致癌性，如黄,曲霉毒素与肝癌发生有关。,检测真菌毒素有许多方法，如检测,黄曲霉毒素有生物学方法和,ELISA,法,等。生物学方法主要用于检测真菌,毒素的毒性，如用鸡胚、小白鼠作,毒性试验，观察动物中毒死亡或出,现肿瘤。,ELISA,法操作简便，并具有,安全快速高效、费用低，适用于大,批量标本的筛选。,4,严格无菌操作 并进行消毒处理，,尤其是采集血液和脑脊液标本，,要避免污染杂菌。,5,采集标本立即送检 深部真菌标,本最长不得超过,2h,。,用胶乳凝集试验检测标本中的白,假丝酵母菌甘露聚糖抗原。,用胶乳凝集试验和,ELISA,检测血,清和脑脊液中的隐球菌多糖荚膜抗,原，在治疗前检测非常敏感特异。,菌落颜色 病原性真菌颜色淡，,污染真菌颜色深；,致病性真菌菌落下沉，有时使,培养基开裂；污染性真菌菌落,不下沉,很少引起开裂。,2.,同化碳源试验 含菌生理盐水,与已融化的固体同化碳源培养,基,(45),混合，然后在培养基,上分别加糖，置,25,孵育观察,结果。若,24h,后无变化可重复,加糖。如能同化周围有生长圈，,否则无生长。,五、核酸检测,医学真菌的鉴定手段引入了分子生,物学的鉴定方法，从核酸碱基,G+C,mol,分析、限制性片段长度多态,性,(RFLP),、,Southern,印迹分析到脉,冲场凝胶电泳,(PFGE),、,PCR,指纹、,随机扩增多态性,DNA(RAPD),以及,DNA,特殊片段测序等。,用,PFGE,分析真菌核型，可直接比较,其遗传背景,从电泳核型差异中进行,分类鉴定,又能取得基因结构的基本,数据，构建出大尺度物理图谱。,