基因克隆及克隆基因的表达.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,LOGO,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,吉林大学白求恩医学院 分子生物学教研室,讲 师,孙 巍,Tel:[phone],2012-10,基因克隆、,克隆基因的表达,荧光蛋白基因克隆猫,科学家复活冰冻死老鼠,修正基因蚊子防控疾病,基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛,基因克隆胚芽造就健康婴儿,基因克隆趣闻,荧光蛋白基因克隆猫,具有荧光蛋白基因的克隆猫在紫外线照射下会变色,由韩国科学技术部公布的对比照片显示出,3,只具有荧光蛋白基因的克隆猫（上图为普通光线照射下，下图为紫外线照射下）,科学家复活冰冻死老鼠,一只老鼠死亡后被冷冻了,16,年之久,日本科学家从其体内提取基因克隆了一只新老鼠,这是人类首次成功克隆冷冻动物。,修正基因蚊子防控疾病,科学家把一种可防疟疾的基因植入蚊子基因之中,对蚊子基因进行修正。,在实验中,科学家们不仅仅在蚊子体内植入了防疟疾基因,还植入了另一种可以使蚊子眼睛发出荧光的基因。这样,科学家就可以很容易识别它们。,基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛,2007,年,英国科学家在实验室中利用基因转换技术成功地在蝌蚪头部培育出第三颗眼球。这个消息对盲人来说是一个天大的喜讯。利用这种技术,干细胞科学家们真的有可能实现他们再造眼球的梦想。基因克隆胚芽造就健康婴儿,基因的秘密随着科技的日益发达而被逐渐揭开。血友病、色盲、白化病,这些遗传病困扰着一个又一个家庭，也激励着一代又一代科学家为之奋斗。,分子生物学关键的技术突破：,DNA,重组技术,1972,年，,世界上第一个重组,DNA,分子诞生,Paul Berg,a biochemistry at Stanford,猿猴病毒,DNA,噬菌体,DNA,限制性内切酶,限制性内切酶,DNA,连接酶,重组,DNA,分子,1980,年，,获诺贝尔化学奖,克隆：通过,无性繁殖,过程所产生的与亲代,完全相同,的子代群体。,molecule,Cell colony,organism,DNA clone,基因克隆,:,是指来自不同生物的,基因,同有自主复制能力的,载体,DNA,在,体外,人工连接，构建成新的,重组,DNA,，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质转移和重新组合。,一、目的,DNA,的,分,离获取（分）；,二、载体的选,择,与准备（择）；,三、目的,DNA,与载体连,接,（接）；,四、重组,DNA,转,入受体细胞（转）；,五、重组体的,筛,选与鉴定（筛）。,DNA,克隆的过程包括五个基本部分：,一、,目的DNA的分离获取（分）,分离获取目的,DNA,有多种方法：,(,一,),PCR,待扩增目的基因两端序列已知,（据此设计引物）,(,二,),基因文库,先构建，后筛选,(三,),化学合成法,直接合成目的,DNA,（序列已知、片段较短）,随机打碎：,物理方法,缺点：难以重复；获得的,DNA,量少等。,限制性核酸内切酶,的发现,1970,年，,第一个限制性核酸内切酶,定点,剪切,DNA,操作,DNA,1978,年，,获诺贝尔生理学或医学奖,限,制性核酸内切酶,用于切割,DNA,限制性核酸内切酶,Restriction,endonuclease,可分为,、,、,型，分子生物学中通常使用的是,型,：,能在,DNA,双链内部的,特异,位点识别并切割,DNA,，“,分子剪刀,”,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,核酸水解酶，裂解磷酸二酯键。,型限制性内切酶具有一些共性和特性：,1.,具有特定的识别和切割位点,限制性内切酶,识别位点,限制性内切酶,识别位点,Apa,I,GGGCCC,CCCGGG,Sma,I,CCCGGG,GGGCCC,Bam,H,I,GGATCC,CCTAGG,Sau,3A I,GATC,CTAG,Pst,I,CTGCAG,GACGTC,Not,I,GCGGCCGC,CGCCGGCG,Eco,R,I,GAATTC,CTTAAG,Sfi,I,GGCCNNNNNGGCC,CCGGNNNNNCCGG,II,型限制性内切酶的识别位点举例（,示切割位点）,识别位点通常为,6,或,4,碱基序列,2.,识别的核苷酸序列通常为回文结构（,palindrome,）,两条核苷酸链中，从,5,到,3,方向的核苷酸序列完全一致,型限制性内切酶具有一些共性和特性：,3.,切割双链,DNA,分子后产生黏端或平端,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,黏端切口,（,sticky end,）,（,blunt end,）,型限制性内切酶具有一些共性和特性：,粘性末端又可分为两种：,1,）,5,-,端突出,2,）,3,-,端突出,CTGCA,OH,G,G,HO,ACGTC,5,3,5,3,-5,5,-,PstI,CTGCA G,C ACGTC,5,5,3,3,G,OH,AATTC.,CTTAA,HO,G,5,3,-5,5,-,5,3,EcoRI,GAATTC,CTTAAG,5,3,5,3,4.,不同的酶可以产生同样的末端,同尾酶,（,isocaudarner,）：,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割,DNA,后，产生相同的黏端，这样的酶彼此互称为同尾酶。这两个相同的黏端称为配伍末端,(compatible end),。,Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,互连后？,型限制性内切酶具有一些共性和特性：,5.,不同的酶可以识别同一个序列,同工异源酶（,isoschizomer,）或同裂酶,能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bst,CCCGGG,GGGCCC,C,CCCGG,CCGGG,G,+,Xma,CCCGGG,GGGCCC,CCC,GGG,GGG,CCC,+,Sma,为,DNA,操作增加了酶的可选余地,型限制性内切酶具有一些共性和特性：,6.,切割会受其他因素的影响,通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲基化的序列。,缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。,如，,EcoR,I,在正常情况下识别“,-GAATTC-”,序列，但在甘油浓度大于,5%,（,v/v,）或反应温度较低时识别序列可变为“,-AATT-”,或“,-,嘌呤嘌呤,AT,嘧啶嘧啶,-”,，这种现象称为,星号活性,（,star activity,），以,EcoR,I*,表示。,型限制性内切酶具有一些共性和特性：,M,6.,切割会受其他因素的影响,5.,不同的酶可以识别同一个序列,4.,不同的酶可以产生同样的末端,3.,切割双链,DNA,分子后产生黏端或平端,2.,识别的核苷酸序列通常为回文结构（,palindrome,）,1.,具有特定的识别和切割位点,型限制性内切酶具有一些共性和特性：,在,DNA,双链内部的特异位点识别并切割,DNA,文库法：,一个细胞只接受一个重组,DNA,分子,一般一个载体只携带一段外源,DNA,单克隆,基因组,DNA,文库（,genomic DNA library,）：,包含某一个生物细胞或组织全部基因组,DNA,序列的随机克隆群体，以,DNA,片段的形式贮存了所有的基因组,DNA,信息。,如何从文库中钓取基因？,用,带有标记的,、,已知序列的核酸片段,(,单链,RNA,或,DNA),作为,探针,，与待测,DNA,或,RNA,样品进行核酸分子杂交，,来检测被测样品中是否有与探针序列同源的目标序列，以及目标序列的量。,转膜、,变性、,封闭、,加入变性的探针、,杂交、,洗涤、,检测杂交体。,如何实现特异性的获得目的基因？,聚合酶链式反应,Polymerase Chain Reaction,PCR,体外高效,特异性,的扩增目的,DNA,片段,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（,）,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,1,3,步,25,30,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,94,55,37,Taq,DNA,聚合酶（,thermus,aquaticus,),酶,活性,(%),温度,(,),40 50 60 70 80 90 100,100,80,60,40,20,72,94,55,PCR,循环,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,标准的,PCR,反应体系,4,种,dNTP,混合物 各,200umol/L,引物 各,10,100pmol,模板,DNA,0,.,1,2ug,Taq,DNA,聚合酶,2,.,5u,Mg,2+,1,.,5mmol/L,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（,）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,1,3,步,25,30,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,子链延伸,DNA,加倍,DNA,变性,形成,2,条单链,模板,DNA,95,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,第,1,轮结束,95,第,2,轮开始,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,2,轮结束,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,模板,DNA,第,1,轮扩增,第,2,轮扩增,第,3,轮扩增,第,4,轮扩增,第,5,轮扩增,第,6,轮扩增,PCR,Primer Design,PCR,反应中有两条引物，即,5,引物和,3,引物。,5,5,3,3,5,5,First cycle,ATG TAA,3,3,Target sequence,下游引物、,3,引物、,antisense primer,上游引物、,5,引物、,Sense primer,引物设计的,总原则,提高引物与模板结合的特异性,。,PCR,反应扩增的就是一对引物之间的,DNA,片段，,PCR,反应成功扩增的关键在于引物的正确设计。,PCR,引物设计的基本原则：,1.,引物与模板的序列要紧密互补。,2.,引物自身、引物之间不应存在互补序列。,3.,引物不能在模板的非目的位点引发,PCR,。,长度：,特异性序列一般,15-18bp,。,碱基分布：,引物方向：,5,3,引物的,3,端,：是,DNA,延伸的起点，一定要严格与模板,DNA,配对。,引物的,5,端,：可以加非特异性序列,如酶切位点等。,同源性比较,：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过,70%,或有连续,8,个互补碱基同源。,PCR,引物设计的具体方法：,尽量随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象。,GC,比在,45-55%,。,3,和,5,引物具有相似的,Tm,值。,Tm=4(G+C)+2(A+T),。,PCR,引物的设计实例,已知,IFN-,cDNA,序列如下,该如何设计,PCR,引物？,at,gaaatataca,agttatatct,tggcttttca,gctctgcatc,gttttgggtt,ctcttggctg,ttactgccag,gacccatatg,taaaagaagc,agaaaacctt,aagaaatatt,ttaatgcagg,tcattcagat,gtagcggata,atggaactct,tttcttaggc,attttgaaga,attggaaaga,ggagagtgac,agaaaaataa,tgcagagcca,attgtctcc,ttttacttca,aactttttaa,aaactttaaa,gatgaccaga,gcatccaaaa,gagtgtggag,accatcaagg,aagacatgaa,tgtcaagttt,ttcaatagca,acaaaaagaa,acgagatgac,ttcgaaaagc,tgactaatta,ttcggtaact,gacttgaatg,tccaacgcaa,agcaatacat,gaactcatcc,aagtgatggc,tgaactgtcg,ccagcagcta,aaacagggaa,gcgaaaaagg,agtcagatgc,tgtttcaagg,tcgaagagca,tcccagtaa,at,gaaatataca,agt,gaagagca,tcccagtaa,atgaaatatacaagt,3,5,3,5,上游引物结合,cttctcgtagggtcatt,下游引物结合,设计引物时,:,特异性序列：,5,引物照抄，,3,引物互补倒读，,即：,5,引物与位于待扩增片段5,上游的一小段,DNA,序列相同,;,3,引物与扩增片段,3,端的一小段,DNA,序列互补。,酶切位点,加在引物的,5,；,调,GC,含量的碱基,放在最前边；,此外，无发夹结构、与基因组其它区域的同源性较差。,5,3,3,5,Sense primer:,5,CGCAGC,GGATCC,ATG,AAA,TATACA,AGT,3,15,bp,GC=12 AT=15,Anti-Sense primer:,5,ATCG,GAATTC,TTA,CTGGGATGCTCTTC,3,17,bp,BamHI,start,codon,GC=12 AT=15,EcoRI,stop,codon,引物的方向是,5,3,：,at,gaaatataca,agt,gaagagca,tcccagtaa,atgaaatatacaagt,3,5,3,5,上游引物结合,cttctcgtagggtcatt,下游引物结合,5,3,3,5,琼脂糖凝胶电泳,Agarose,gel,Electrophoresis,PCR,产物中,只含有,目的,DNA,片段吗？,M,二、,载体的选择与准备（择）；,载体（,vector,）：携带外源,DNA,，实现外源,DNA,在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些,DNA,分子。,1.,按功能,克隆载体（,cloning vector,）,表达载体（,expression vector,）,2.,按基本元件的来源,分类：,质粒载体,噬菌体载体,黏粒载体,病毒载体,人工染色体载体等,二、,载体的选择与准备（择）；,（一）根据,DNA,克隆的,目的,选择与准备适宜载体,1.,获得目的,DNA,片段,选用,克隆载体,；,2.,获得目的,DNA,片段所编码的,蛋白质,选用,表达载体,。,（二）考虑目的,DNA,的,大小,及受体细胞的种类和来源,载体,插入,DNA,片段,宿主细胞,质粒,5,10 kb,细菌，酵母,噬菌体载体,20 kb,细菌,黏粒,50 kb,细菌,BAC,400 kb,细菌,YAC,3Mb,酵母,（三）含有合适的,MCS,克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖,（一）克隆载体（,cloning vector,）,应具备的主要特点,1.,至少有一个,复制起点,（,origin of replication,ori,）,2.,至少有一个,选择性标志,（,selection marker,）,3.,有适宜的限制性内切酶的单一切点：,多克隆位点,（,multiple cloning sites,，,MCS,）,4.,应有较高的拷贝数,pBR322,质粒图谱,克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖,（二）常用克隆载体的种类,1.,质粒,(plasmid),是最常用的克隆载体,广泛存在于细菌、酵母等多种微生物中,独立于宿主细胞染色体外的环状双链的超螺旋结构能在宿主细胞内,独立自主复制,带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些,遗传性状,质粒的不相容性,：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。,目前，已有一系列商品化质粒克隆载体可供选择，可容纳,10kb,以内的外源,DNA,。,pUC18/19,质粒图谱,pUC18/19质粒,，,2686bp,，是最常用的质粒载体,缺乏控制拷贝数的,rop,基因，因此其拷贝数达,500-700,T-,载体：,pMD18-T,2692bp,Ampicillin,resistance,origin,HindIII,Spln,PstI,HincII,AccI,SalI,Xbal,BamHI,SmaI,XmaI,KpnI,SacI,EcoRI,Sp6,T7,LacZ,T,T,克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖,（二）常用克隆载体的种类,2.,噬菌体,(phage),能感染细菌的病毒,（,1,）,噬菌体,DNA,改造系统,cos,位点,:,两端各有一条由,12,个碱基组成、彼此完全互补且,5,突出的序列,插入型：,gt,系列，适用于,cDNA,克隆,置换型：,EMBL,系列，适用于基因组,DNA,克隆,线性双链,DNA,分子,cos,cos,12bp,12bp,48500bp,Nonessential portion,for replication,Long(left)arm,Short(right)arm,2,）,M13,噬菌体,DNA,改造系统（含,lacZ,基因）,单链闭合环状,DNA,分子,克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖,（二）常用克隆载体的种类,3.,穿梭载体,(shuttle vector),可在不同宿主细胞中应用,人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源,DNA,序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增。,例如，既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体。,这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因；还有真核生物的自主复制序列及选择标记性状；具有多克隆位点。,通常穿梭载体：在细菌中用于克隆（扩增克隆的基因），,在酵母菌中用于基因表达分析。,表达,载体用于外源DNA的,表达,表达载体（,expression vector,）：用来在宿主细胞中,表达外源基因,的载体,依据其宿主细胞的不同可分为,:,原核,表达载体（,prokaryotic expression vector,）,真核,表达载体（,eukaryotic expression vector,）,三、目的DNA与载体连接（接）,T,4,DNA,ligase,Ligation,EcoRI,EcoRI,RE digestion,Vector,EcoRI,Vector,RE digestion,Recombinant,vector,Recombinant,vector,Recombinant,vector,EcoRI,EcoRI,EcoRI,EcoRI,EcoRI,单酶消化的粘性末端连接,：,连接效率高,;,载体需去磷酸,;,双向连入载体,Vector,SmaI,HeaIII,SmaI,RE digestion,RE digestion,Vector,Ligation,Helf,of,smaI,Recombinant,vector,SmaI,Helf,of,HeaIII,Recombinant,vector,SamI,Helf,of,smaI,Helf,of,HeaIII,平头末端连接,：,连接效率低,双向连入载体,自身环化率高,Target gene,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,Vector,Vector,digestion,digestion,Ligation,Vector,EcoRI,BamHI,双酶消化的粘性末端连接：,连接效率高,;,定向连接,.,Vector,EcoRV,EcoRV,digestion,Vector,Taq,DNA polymerase,dTTP,T-Vector,5,5,T,T,5,5,A,A,PCR product,Recombinant,vector,A,A,T,T,PCR product,Ligation,T-A粘性末端连接,：,连接效率高,双向,连入载体 自身环化率,四、重组DNA转入宿主细胞进行扩增（转）,宿主细胞,感受态细胞（,competent cell,）：,处于易于接纳外源物质的状态的细菌,转化,（,transformation,）,质粒或黏粒,细菌,质粒,酵母,（真核细胞）,转染,（,transfection,）,外源,DNA,真核细胞（酵母除外）,感染,（,infection,）,噬菌体颗粒细菌,病毒颗粒哺乳细胞,几个相关概念：,将重组,DNA,转入受体细胞的常用方法：,化学法：,氯化钙法,物理法：,电击法,显微注射法 等,氯化钙化学转化法,电击法,利用瞬间高压在细胞上打孔,显微注射法,Recombinant,vector,Recombinant,vector,Recombinant,vector,Recombinant,vector,连接产物,感受态细胞：,E.coli,Ligation mixture,introduce plasmid into,E.coli,cells,Transfer onto agar plate,筛选出含有,重组,DNA,(,目的基因,+,载体,),的克隆,转化后的克隆群体：,五、重组体的筛选与鉴定（筛）,1.,抗生素抗性筛选,2.,蓝白筛选,3.,限制性内切酶法,4.PCR,法,5.DNA,测序法,主要方法：,五、重组体的筛选与鉴定（筛）,细胞在含有相应抗生素的培养基中培养：,无载体转入的细胞,dead,；含有载体的细胞,alive,。,1.,利用,抗生素抗性标志,可筛选出带有载体的重组子,尚需进一步鉴定载体是否为含有目的,DNA,的重组载体,IPTG,Blue-white screening of recombinants,诱导物,半乳糖苷酶,Lac,Operon,?,在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆的方法,五、重组体的筛选与鉴定（筛）,2.,蓝白筛选,Blue colony,IPTG,X-gal,蓝色,吲哚产物,半乳糖苷酶,X-gal,Blue cell.,如果外源基因插入位于,LacZ,基因内部的多克隆酶切位点，则不能通过,-,互补编码,-,半乳糖苷酶，菌落呈,白色,。,-,互补,菌株,带有,-,半乳糖苷酶,C,端,的编码序列,载体质粒,带有,-,半乳糖苷酶,N,端,的编码序列,蓝白筛选的基本原理：,-,半乳糖苷酶,可分解培养物中的,X-gal,，,使其呈,蓝色,。,3.,限制性内切酶法,：,根据限制酶切图谱筛选特定,DNA,五、重组体的筛选与鉴定（筛）,Linear vector,(2700bp),insert,(300bp),M,空质粒,重组质粒,NcoI,HindIII,2700bp,300bp,提取阳性克隆的重组,DNA,RE,消化,电泳,有无,DNA,片段的插入；,插入片段的大小,连接前用什么酶，,就用什么酶切,可明确序列和阅读框的正确性,5.,核苷酸序列测定,是最准确的鉴定目的,DNA,的方法,五、重组体的筛选与鉴定（筛）,利用序列特异性引物，可鉴定阳性克隆。,如利用克隆位点两侧序列设计引物进行,PCR,，再结合序列分析，能可靠地证实插入片段的方向、序列和阅读框的正确性。,4.,PCR,法,：直接鉴定目的,DNA,的存在,基因工程（,genetic engineering,）,重组,DNA,技术（,recombinant DNA technology,）,分子克隆（,molecular cloning,）,DNA,克隆（,DNA cloning,）,基因克隆（,gene cloning),基因操作（,Gene manipulation,）,Short Summary of gene cloning,：,Short Summary of gene cloning,：,是指进行制备,DNA,片段，并通过载体将其导入受体细胞，在受体细胞中复制、扩增，以获得,单一,DNA,分子,大量,拷贝的过程。,What,？,How,？,M,Why,？,“,获得单一,DNA,分子的大量拷贝,”,The way to get a DNA clone,Gene Therapy,Gene analysis,Gene modification,Medicine,Vaccine,Transgene,gene knockout,Expression,Short Summary of gene cloning,：,1973,年，,Cohen,和,Boyer,第一次完整地建立起了基因克隆体系,Stanley Cohen(Stanford),Herbert Boyer(UCSF),DNA,重组技术创立近,40,年来所获得的丰硕成果已经把人们带进了一个不可思议的科学世界,Transformation,E.coli,Plasmid 1,Plasmid 2,RE,RE,ligase,Recombinant plasmid,基因克隆技术,重组蛋白,人源抗体,重组多肽药物,重组疫苗,基因克隆,DNA,序列测定,重组载体,基因治疗载体,RNA,转录载体,打靶载体,转基因载体,基因敲除动物模型,转基因动物模型,发夹,RNA,RNAi,核酸探针标记,分子杂交,Southern blot,Northern blot,构建文库,基因组文库,cDNA,文库,基因合成,PCR-,克隆,-,亚克隆,基因突变,基因克隆技术是分子生物学的核心技术,克 隆 基 因 的 表 达,获取重组蛋白,重组子,目的基因的,mRNA,表达蛋白质,亚克隆（,Sub cloning,）,克隆载体,表达载体,原核表达系统,Prokaryotic expression system,Eukaryotic expression system,真核表达系统,大肠杆菌,酵母,昆虫细胞,哺乳动物细胞,转化宿主细胞,Recombinant vector,promoter,Target gene,Proteins,Transformation/,Transfection,原核表达系统：,外源基因引入,原核,细胞，使其快,速高效表达基因产物。,真核表达系统：,外源基因引入,真核,细胞，,使外源,基因在真核细胞中表达。,表达体系,第一部分,.,外源基因在,原核,细胞,中的表达,原核细胞表达系统组成,二、原核表达载体,一、原核宿主细胞,大肠杆菌,（,E.coli,),优点：,简便,快速、成本低,可高密度发酵培养,20-30min,12 hours,6-8,Billion bacteria,Once the recombinant system is established,it is,cheap,to manufacture.,insulin,Recombinant,一、原核宿主细胞,注意：,用来,克隆,基因和,表达,基因的菌株,不一样,，,表达时，选用与表达载体相匹配的菌株。,生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。,基因组结构简单，便于基因操作和分析。,多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。,生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。,不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。,内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。,原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下的特点：,二原核表达载体,在,原核,细胞中,表达,外源基因的,载体,。,质粒：,噬菌体：,最方便，,最常用。,长片段,原核表达质粒,强启动子,终止子,SD,序列,1,、原核表达质粒的元件：,ori,P,T7,SD,MCS,Terminator,Prokaryotic Expression Plasmid,Prokaryotic promoter,Lac I,start,piont,Ampicillin,resistance,克隆元件：,表达元件：,复制原点插入位点,筛选标记,启动子,终止子,SD,mRNA,多肽链,利用,强,启动子，增加蛋白质的生物合成,转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤，,因此，选择强的、可调控启动子是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。,原核表达载体的启动子都是,可诱导的,目的是在需要目的蛋白的时候才表达它,.,最理想的,可调控,启动子应该是：,早期阶段,：启动子被阻遏,当细胞数目达到一定密度时,：通过诱导使阻遏物失活，,RNA,聚合酶快速起始转录。,Plac,：受,Lac,阻遏蛋白负调节，,受,IPTG,的诱导。,P,L,启动子,：噬菌体早期,左向启动子。,常用的,原核启动子,P,R,启动子,：噬菌体早期,右向启动子。,受,噬菌体,CI,基因调控,乳糖操纵子结构：调控元件,+,结构基因,RNA Pol.,阻遏,蛋白以恒定的速度表达，特异性地结合到操作子上，,对,操作子,的调控：,乳糖或类似物是阻遏蛋白的诱导物。,O,H,OH,H,H,H,OH,H,OH,CH,2,OH,O,H,OH,H,H,H,H,OH,CH,2,OH,O,OH,IPTG,is an analog of lactose but can not be hydrolyzed by,galactosidase,.,Lactose,Why IPTG?,(,Isopropyl-D-1-thiogalactopyranoside,异丙基硫代半乳糖苷,),乳糖操纵子的应用：,利用乳糖操纵子的基本原理构建原核细胞表达载体。,IPTG,:,类乳糖诱导剂,“O”,持续开放,培养基,葡萄糖耗尽,“P”,开放pET,vectors and BL(DE3)inducible system (,Novagen,),终止子：强终止子、二聚体终止子,转录过度的危害：,影响目的基因的转录和翻译效率,干扰基因载体的复制等生物学功能,增加受体细胞的无效能量消耗,启动子,终止子,SD,mRNA,NNN,AAGGAGG,NNNNN,AUG,CAA AUU,SD,与,16S,rRNA,3,富含嘧啶的碱基互补配对,对蛋白质翻译的起始非常重要,!,39,nt,3-11,nt,SD,序列,:,原核,mRNA,具有独特的,SD,序列,是核糖体结合位点,.,(ribosome binding site,RBS),SD,序列：影响翻译效率,SD,序列与,16SrRNA,的互补性,SD,与起始密码子之间的距离,成熟型,融合型,分泌型,减少原核细胞对外源蛋白的降解,-,天然完整蛋白,-,融合蛋白,-,分泌性蛋白,2,、原核表达质粒的类型：,1,）成熟型表达载体,ori,promoter,SD,MCS,Expression vector,特点：,外源基因需携带,ATG,和,TAA,只表达目的基因编码的氨基酸,产生天然蛋白，容易被降解，因此,产量小,，也可能不稳定。,缺点,!,P,Foreign DNA,2),融合型表达载体,载体,1,：,.ATG,ACG,TCA,GAT,.,载体,2,：,.ATG,N,AC,GTC,AGA,T.,.,载体,3,：,ATG,NN,A,CGT,CAG,AT.,第一种情况：,ATG,ATG,N,ATG,N,ATG,N,ATG,N,N,Insert site,Insert site,Insert site,第二种情况：,表达载体含有一段编码原核蛋白的基因顺序，使表达的蛋白质,N,端或,C,端带着一小段原核多肽。,Protein of interest with a small additional peptide at N or C end.,Fig.A schematic structure of fusion protein,2),融合型表达载体,Most popular,prokaryotic expression plasmid with his-tag.,融合型表达载体,举例,融合蛋白,Ni-affinity chromatography,if the fused is,6-his,Ni,Ni,His-his-his-his-his-his,Ionic bond,His-tag,Protein,可以加入蛋白酶切位点,His,taq,His,taq,TAA,NcoI,(ATG),EcoRI,HindIII,离子键,亲和层析,外源蛋白以融合蛋白的形式表达,读码框架固定或可选择,特点：,小结,:,融合型表达载体,表达效率高,产物稳定,易纯化：利用融合原核多肽的特性,Fusion protein can be purified easily,Can be made in large amounts.,优点：,缺点：,非天然蛋白，需要表达后切除融合蛋白,3),分泌型表达载体,Secretion expression vectors,ATG,下游构建了信号肽基因序列,Secreted into medium?(!),E.Coli,can not do that,Cell wall,Cytoplasmic,membrane,Genome,分泌到细胞周间隙中的重组蛋白质,Recombinant protein,the space between cell membrane and cell wall.,The recombinant protein will be secreted into,periplasm,避免目的蛋白被细菌蛋白酶降解,The high expression level,利于收集外源蛋白,优点：,读码框架固定,:,The target gene does not need start,codon,because it uses the ATG of signal peptide.,特点：,Single colony,50 ml LB medium for 5 hours.,OD=0.6 induce,foreign gene expression in host.,t,ransform,recombinant plasmid,into,expression host cell(BL21,DE3,),转化平板,细菌处于对数生长期时,扩大培养,留种，然后,1/100,接种。,转化的表达菌要与表达载体相,配套！,三、外源基因在,E.coli,中的表达,IPTG addition,IPTG Induction,：,adding IPTG to the culture if the vector uses Lac,operon,to regulate foreign gene expression.,Quantity,of target protein,in cell,units,Where your expressed protein will be located?,Inclusion bodies,(insoluble),Cytoplasm,(soluble),Secreted into,periplasmatic,space,(soluble or insoluble),Nothing,Recombinant protein may be hydrolyzed by,proteinases,resistant to,proteinase,hydrolysis t,hat results in the high