第三章-基因工程所需的基本条件.pdf

基因工程1基因工程的基本概念2基因工程的基本原理3基因工程所需的基本条件4基因工程的操作过程5目的基因的克隆与基因文库的构建6大肠杆菌基因工程7酵母基因工程8哺乳动物基因工程9高等植物基因工程2第三章基因工程的基本条件A用于核酸操作的工具酶B用于基因克隆的载体C用于基因转移的受体菌或细胞3A用于核酸操作的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶4学习内容重点讨论限制性核酸内切酶和DNA连接酶在 DNA切割和连接中的应用，并简要介绍其他与基因克隆有关的其它的重要的酶。5限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核昔酸序列，并切割DNA 的核酸内切酶。71.来源 主要来源于原核生物2.性质内切酶即在核酸分子链的内部制造切口的酶。形成51P和3?OH末端3.功能 自我保护作用细菌的限制和修饰系统（R/M体系）8感染EeColi kPhage入(k)1-Exoli B【E.coliB 限制(k)(1)限制(Restriction)限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解，切成小片断。L10(2)修饰(Modi告cation)细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。Dam 甲基化酶(DNA Adenine Methylase)GATC腺瞟唆N6位置引入甲基Dem甲基化酶（DNAcytosine Methylase)CCAGG或CCTGG序歹IJ在第二个胞喀咤上C5位 置上引入甲基11(b)ScoRI methylaseUnmethylated 51 DNARestriction3 6T C A G1G A3 C TEcoRI will not cleave methylated DNAMethylated 5，.DNA reI 3 512(3)限制与修饰系统相关的三个基因(来自大肠杆菌K和B株)/isdR：编码限制性内切酶这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双链DNA切断加M:编码限制性甲基化酶这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化，即起修 饰DNA的作用ohsdS:编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。13二、限制性内切酶的命名1973年H.O Smith和D.Nathans提议的命名系统,命名原则如下：1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基本名称。大肠杆菌(Escherichia coli)用co表示;流感嗜血菌（Haemophilus influenzae用H加表示142.如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。如Hind II：d菌株EcoR I：抗药性R质粒153.如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的 先后次序。如“加d II：d菌株中发现的第二个酶4.所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R,甲基化酶为M。如R.Hind III表示限制性内切酶M.Hind III表示相应的甲基化酶实际应用中，R常被省略。16三、限制性内切酶的类型目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。主要的三种:171.1型限制性内切酶的基本特性先由M.Mesekoii和RYuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。如 和 EcdK。亚基R、M、S分别具有限制性内切酶、甲基化酶和DNA特异性位点识别活性18(1)识别位点序列未甲基化修饰的特异序列。EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC19(2)切割位点在距离特异性识别位点约10001500 bp处随机切开一条单链，不产生特异片断，应用不大Recognize site k-Xt citl-1.5kb(3)辅助因子需ATP、Mg2+和SAM(S.腺昔甲硫氨酸)202.n类限制性内切酶的基本特性首先由H.O.Smith和KW.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是用d II 基因工程用途最大（1）识别位点序列 识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是呈典型的旋转对称型的回文结构）。大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 与DNA的来源无关，即没有种的特异性。21稀有切割限制酶(rare cutter)可以识别6个以上的核昔酸序列的少数的限制内切酶。如No”(GCGGCCGC)某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个碱基并非严格专一。如h加d n可识别4种核昔酸序列:5一 二 Y:ClcTGT AC R:A 或G.3,22（2）切割位点识别位点处切开双链DNA,形成粘性末端（sticky end）或 平齐末端（bhintend）。如：EcoRI 5-GWAATTO33，CTTAA 个 G5,PstI 5YTGCAWG3 3-Gf ACGTC-59产生粘性末端EcoR V 5LGATWATG33、CTA 个 TAG-5产生平齐末端231粘性末端(sticky ends,cohensive ends)含有几个核昔酸单链的末端。分两种类型：T）5,端凸出（如EcoRI切点）IF）3,端凸出（如尸s石切点）24）5,端凸出（如EcoRI切点）5,G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3,C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5,EcoRI 37 5,G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3iiii iiii3,C-G-A-C-T-T-A-A-p oh-G-C-T-C 5退火4-7 OH P5,G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3 I I I iiii 3,.C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5P OH25ii）3,端凸出（如Ps”切点）5二 G-C-T-C-T-G-C-U-G-G-A-G 3，3,C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 C5,G-C-T-C-T-G-C-A-oh P-G-G-A-G 3,iiii iiii3,C-G-A-G-p oh-A-C-G-T-C-C-T-C 5退火4-7 OH P I I5,G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3 3,C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5POH262粘性末端的意义连接便利i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接O这比连接两个平齐末端容易得多。i i）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。27二 c-G 一 T-A-T 111A-A I IT-A I T-G-c 二E 3 c-G-T-A-T111A-A IT-A-T-G-c 二OeavagewitkuEcoRlOeavageAvitfcuEcoRlIII?II I I C-T-T-A-AFragments with complementary tailsA-A-T-T-CAnnealing allows recombinant DNA molecules to form by complementary base pairing.The two strands are not covalently bonded as indicated by shaded gaps.DNA ligaseG-A-A-T-T-CI I I I I I111；I 4 A A A*1 1 1,C-T-T-A-A-G 4 4*DNA ligase seals the gaps,covalently bonding the two strands.末端标记末端可用DNA多核甘酸激酶进行32P标记。末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核昔酸的尾巴（如dA和dT）,即同聚物加尾造成人工粘 性末端。补平成平齐末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。293平齐末端(blunt end)在识别序列的对称轴上同时切割如 EcoR VI IGATWATCI 133、I ICTAfTAG I 15303平齐末端(blunt end)在识别序列的对称轴上同时切割PvuII等产生的平头末端54.G-C-T C-A-G-C-T-G-G-A-G.3 I I I I I I I I I I I I3,C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5 tPvuII 37 5,G-C-T-C-A-G-oh p-C-T-G-G-A-G 3 i i i i i i iii iii-3,C-G-A-G-T-C-p oh-G-A-C-C-T-C 5314平齐末端的特点连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接 效率的1%,这种连接常出现多联体连接。粘性末端与平齐末端连接的处理方法i)添补法:利用DNA聚合酶I(klenow fragment)将碱基添补到目的基因的粘性末端上。32ii）削除（平）法利用S1和及i/31等核酸酶将目的基因粘性末 端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端335同裂酶(Isoschizomer)不同来源的酶，识别相同的序列,切割方式 相同或不同。完全回裂酶：识别彳立点和切点完全相同如印d III禾口小 IHind III 5AWAGCTT33FCGA-A5Hsu I 5AWAGCTT33，TTCGA 个 A534不完全回裂酶：识别位点相同，但切点不同。AXma I 和 Sma IoXmal51CWCCGGG 33,GGGCC 个 C5Sma 5、CCCWGGG33、GGG 个 CCC5356同尾酶(Isocaudamers)识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH Iv Bgl II v Bell、Xho II等BamH IBgZHBellXho II51GWGATCC331CCTAG 个 G-5,51AWGATCT-331TCTAG 个 A-5,51tWGATCA33ACTAG 个 T-55UWGATCY33YCTAG 个 U-5U代表0票吟；Y代表喀咤。36Sau 3A5“GATC3,3，CTAG 个 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别OBamH IBgl IIBamH I51GGATCI33CCTAGA5Bgi iiySau337限制酶的酶活性限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。所以一般使用专一的反应缓冲液。星号（*）活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割 效率，称为星号（*）活性。38使用的时候要特别注意!EcoR I和BmH I等都有*活性。EcoR I：GAATTCI在低盐、高pH 08）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等*39诱发星号（*）活性的原因i）高甘油含量ii)内切酶用量过大iii）低离子强度iv）高pHV）含有机溶剂，如乙醇vi）Mn2+s Mg2+、Cu2+v Zn2+等二价阳离子的存在酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件408 ns型限制性内切酶移动切割(shifted cleavage):在离它的不对称识别位点一侧的特定距离 处切割DNA双链。Hga I5,GACGCNNNNN yCTGCGNNNNNNNNNNf(3)II型限制性内切酶不具有甲基化功能II型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。它们识别相同的DNA序列，但功能不同。如EcoR I限制性内切酶和EcoR I甲基化酶前者：5LGWAATTO3,3FTTAA 个 GS 后者：5?GAA*TTC3 3-CTT*AAG-5作用的位点也不相同42（4）II型限制性内切酶对单链DNA的切割定义为切割双链DNA,但有一些还可以 特异识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低如：Hha I切割单链DNA比切割双链DNA效率低50%433.III类限制性内切酶在完全肯定的位点切割DNA,但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S.腺昔蛋氨酸）。EcoPl:AGACC_IcoP15:CAGCAG_在基因工程操作中用途不大。44核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修 饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基 化酶分开共同亚基的双功 能酶内切酶的 蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用 所需要的 辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和 SAM寄主特异 性位点识 别序列Ecdix TGA(N)8TGCT coK：AAC(N)6GTGC回文序列（II s型除外）Ecd?:AGACCEcoP15:CAGCAG45切割位点在距离识别位点 至少1000bp处随机切开一 条单链位于寄主特 异性位点或 其附近距寄主特异 性位点3,端2426bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性 位点寄主特异性位点 识别未甲基化的序 列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用用处不大46I、限制性内切酶酶解反应条件 1.标准酶解体系的建立一个单位（U）的限制性内切酶定义:在合适的温度和缓冲液中，在20W的反应体系中,lh完全酶解Ijig DNA所需要的酶量。推荐：稍过量的酶（25倍）和较长的反应时间472.酶解过程配酶解体系混匀反应终止酶解结果鉴定48酶解体系一般20m，保证酶液体积不超过反应总体积的10%前提下，尽量降低反应总体积。加样顺序一般是：ddH2O buffer DNA酶49大部分H型核酸内切酶需要相似的反应条件:0-50 mM低盐酶100 mM150 mM高盐酶Tris-HCl 50 mM pH 7.5MgCl2 10 mMNaCl0-150 mMDTT1 mMVolume20-100 mlTT 37 1-1.5 hrDTT：二硫苏糖醇50混匀移液枪吹打或手指轻弹管壁*若底物分子很大（如基因组DNA）,应避免强烈振荡。*混匀后微量高速离心机进行短暂离心,使管壁液体全部下沉。51反应终止三种方法:/螯合Mg2+i）加乙二胺四乙酸（EDTA）至终浓度10 mmol/L;加十二烷基硫酸钠（SDS）至终浓度0.l%（W/V）ii）65 用热 20min或者70力口热lOminiii）酚/氯仿曲提52酶解结果鉴定快速进行微型琼脂糖凝胶电泳观察 然后决定是否终止反应53酶切后发现除了目的DNA条带外，还有其它条带存在“星号”活性,造成非特异性切割;I不正确的操作，导致其它内切酶污染;底物DNA中可能存在其它DNA污染。电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常I底物DNA不纯；内切酶不纯;酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNA结合在一起使电泳条带移动距离异常543.限制性内切酶对DNA分子的消化(1)内切酶与识别序列的结合模式1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发 现II型限制酶是以同型二聚体的形式与靶序 列结合。55(2)完全消化内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开56(3)局部消化只有有限数量的酶切位点被切开通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反 应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。57Enzyme Recognition,Sourcedeavage sequence Cleavage patternEcoRI E.coff-L-L-Lc-T.T-a.a.c-L XJ-Li.T.T.A.A c-L-LXI，A-A C T TT A A T Ti I I 77 t 7;i i i i i 7-_，；Hindi”！Haemophilus influenzae1 1 1 T T C C A A 1 1 1 1 1 J t T C C-A AJ 1 180mHiE 3 c 11 G clllc T IHA-A t T G-c c-c 二Illy G-ATCF I I.Bacillus omyloliquefociensC.C-T-A.C G58Thermus aquotkus/UI 4 A-TT I!A 一 c HIG I *GAJ一Arthrobacter luteusHaettlHaemophilus aegypticusBrevibacterium albidumSou3Atltt TTirr艮，晨，,LLLC-A-T-Cq-p-pStophy/ococcus aureus594.限制性内切酶酶解反应中的注意事项大多数厂家供应的限制内切酶为浓缩液1U的酶液足以在lh内消化lOpgDNA,酶和底 物比例2.10U/ug DNA,避免使用过高的酶浓度浓缩液使用前可用1义限制酶缓冲液稀释限制性内切酶在含50%的甘油的缓冲液 中，于-20稳定保存60五、影响限制性内切酶活性的因素L DNA的纯度DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。一般采取纯化DNA加大酶的用量，lugDNA用10U酶 延长保温时间扩大反应体积（20R）61需要合适的底物：底物(DNA)纯度要高.不能含 有RNA和蛋白质;也不能含有过高的EDTA。更不 能含有酚、氯仿 乙醇、SDS和其他有机试剂。DNA的浓度不宜过高，高浓度的DNA会使溶液的 粘度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不 彻底。常为50皿内含lug DNA。622.DNA的甲基化程度大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒:DNA腺瞟吟甲基化酶(DNA adenine methylas 9dam)(修饰GATC中的A)；DNA胞喀喔甲基化酶(DNA cytosine ethylas,dcm)(修饰CCA/TGG的C)o基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。633.温度不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37。少数要求40-65（。每微克DNA用15 单位的酶，保温12小时。酶最适温度 酶最适温度 酶最适温度 Apa I Bell Mae II Taq I30505065ApylBstE IIMae III306055Ban IMae ISma I504525644.缓冲液(Buffer)是影响限制酶活性的重要因素商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液65（2）两种或两种以上的酶切割DNA样品在相同的缓冲液中反应同时进行若需要不同的缓冲液,采用3种方法i）先用要求低离子强度的酶切割（低盐酶），再加NaCl调节 离子强度，并用第二种酶切割（高盐酶）；五）先用一种酶切割,然后用25倍体积的乙醇沉淀酶解产物，再重悬于另一种缓冲液中进行第二种酶切割；道）使用所有限制性酶的通用buffer,如KGB（谷氨酸钾 buffer）,经适当稀释可达到各种限制性酶要求的buffer条件。66练习题I何为限制性内切酶？有哪些类型，各有什么作用和特点I什么是限制性内切酶的星号活性？受哪些因素 影响？限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是【】A B C D E修复自身的遗传缺陷促进自身的基因重组强化自身的核酸代谢提高自身的防御能力补充自身的核昔酸消耗67DNA连接酶68DNA连接酶一、DNA连接酶（ligase）的发现从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。DNA复制一定有断口691967年，世界上数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶。DNA连接酶:一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶70二、DNA ligase的特点1.两种共价连接DNA限带lj片段的DNA连接酶(1)大肠杆菌连接酶只能连接粘性末端，背景低，准确性高(2)T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端712.连接条件（1）必须是两条双链DNA（2）DNA 3,端有游离的-OH,5,端有一个磷酸基团（P）（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中：NAD+72DNA连接酶的基本性质将DNA双链上相邻的3,羟基和5,磷酸基团共价结合形成 磷酸二酯键，并使之修复nick OH P5,G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,i i i i i i i i i i i i3,C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5I I P OH nickT4-DNA连接酶5,G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,I I I I I I I I I I I I3,C-G-A-A-C-(-T-C-C-T-C 573(4)DNA连接酶的反应条件Tris-HCI 50-100 mM,pH 7.5MgCI2 10 mMATP 0.5-1 mMDTT 5 mMVolume 10-20 mlTT 4-15 ,4-16 hr1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应1小时，完全连接1间A,-DNA(HMdlll片段)所需的酶量。74如何连接由限制性内切酶切割形成 片断的末端1_75K连接反应的温度1 最佳温度连接酶反应的最佳温度是37。（2。2.实用温度但在37下粘性末端的结合很不稳定。所以一般采用416。76五、影响连接反应的因素1.DNA末端的浓度两种构型：线状分子和环状分子 与DNA浓度及DNA分子长度相关2.插入片段与载体的浓度比例1020倍增加插入片段与载体的接触机会，减少同一个 分子末端自我连接的现象。773.反应温度黏性末端：1216平头末端：102047 ATP浓度一般，ATP最适的终浓度为0.5mmol/L.ATP浓度高至5mmol/L,影响平头末端的连接ATP浓度高至7.5mmol/L,抑制粘性末端及平头 末端的连接。78六、DNA连接的反应体系酶切纯化后的DNA片断1连接缓冲液 DNA连接酶79七、平头双链DNA片段的连接操作I从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创 造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平 头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反 应速度要慢得多。80提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10%PEG8000,促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl）,最终浓度150-200 mM81DNA聚合酶82DNA聚合酶(DNA polymerase)能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖多核 甘酸连续地加到双链DN A分子引物链的3，一 OH末端，催化核昔酸的聚合作用.83一、基因工程中常用的DNA聚合酶1.大肠杆菌DNA聚合酶2.Klenow fragment3.T7 DNA聚合酶4.T4 DNA聚合酶5.修饰过的T7 DNA聚合酶6.逆转录酶7.Taq DNA聚合酶84二、常用的DNA聚合酶的特点1.共亘特点把dNTPs连续地加到引物的3,一 OH端2.主要区别持续合成能力和外切酶活性不同。T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。853.常用DNA聚合酶的特性比较DNA聚合酶夕卜 切酶活性5，t3夕卜 切酶活性聚合 速率持续 能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低K1 enow fragment低无中低T4 DNA聚合酶高无中低T7 DNA聚合酶高无快高 化学修饰T7 DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低_匚Taq DNA聚合酶1无有快86三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.Klenow fragment(1)Klenow fragment的性质具有聚合酶活性和外切酶活性。外切酶活性）。（失去了Klenow fragment0335枯草杆菌蛋白酶DNA Pol I T Klenow fragment(76KD)实际上是大肠杆菌DNA聚合酶I C端大片段，由Klenow通过枯草杆菌蛋白酶位点特异性降解而得87(2)主要用途3,端补平补平限制性内切酶切后形成的3,隐蔽端。5DNA3,末端标记在3，隐蔽端加上放射性标记的dNTP o88限制性内切酶切EcoRIBamH I3,隐蔽末端的DNA片断5，G3，3CTTAA5,5，G3，3，CCTAG5根据末端的顺序选 择一种 a-32p-dNTPs|25 1hKI enow fragment 补平a-32P-dATPa-32P-dGTP末端标记的DNA5，GAA3，3LCTTAA55，GG3，3，CCTAG55，GAATT3,3，CTTAA55，GGATC3,3，CCTAG589cDNA第二链的合成mRNA5.逆转录3cDNA 第一链 3,5引物kI enowcDNA第二链5,3,902.T4 DNA聚合酶(1)T4 DNA聚合酶的性质来源从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化，由噬菌体基因43编码。酶活性|有聚合酶活性和3,一5,外切酶活性(降 解单链更快)。91T4 DNA聚合酶3353特点A当没有dNTP时，T4 DNA聚合酶行使3,一5，外切酶功能，制造出3,隐蔽端。B如果只有一种dNTP,则降解到该dNTP的位置。C在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。925,33,5无 dNTPsVT4 DNA聚合酶5,33,593（2）T4 DNA聚合酶的用途补平隐蔽末端DNA3,末端标记标记末端（取代合成法或置换合成法）用外切酶活性作用于所有末端形式的3,端（平端、3,隐蔽端、5,隐蔽端）制造出3,隐蔽端。再利用它的聚合酶活性补平，并加入放射性 标记的dNTP。94DNA酶切片断5?3,35无dNTPsT4 DNA聚合酶（3，.5,外切）523加入某种32PYNTP和dNTPsT4 DNA聚合酶（5，-3,聚合）酶切中间产生两个末端标记5335内切酶切5，3，595DNA修饰酶96一、末端脱氧核昔酸转移酶(terminal transferase)pi.来源 小牛胸腺。2.组成大小两个亚基。3.特性 5,一3，DNA聚合酶活性97需要3，一OH、二甲肿酸缓冲液。不需要模板！底物可以是单链DNA、是3，-0H突出的双链DNA、平末端需Co2+激活，但反应效率低。随机添加的dNTPs。如果只有一种dNTP,就添加上同聚物。DNA 5，I=3，!dTTP,末端转移酶 I I TTT I-984.末端转移酶的用途(1)同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的 同聚物尾巴，以使它们有效地连接。外源 DNA 5,3 V|J 载体 DNAdCTP J末端转移酶I dGTPI ICCC I IGGGCCC GGG99(2)再生酶切位点便于回收克隆片断。55AAGCTT-TTCGAA)KI enow补平100AAA外源DNAAAA101连接/加III位点_A_/nd川位点 _A_AGCTTTT AAAAGCTT(3)DNA3-0H末端标记催化非放射性或放射性标记物掺入DNA片断的3,端。（生物素71-dUTP等）102二二碱性磷酸酶1.碱性磷酸酶种类（1）细菌性碱性磷酸酶Bacterial alkaline phosphatase,BAP从大肠杆菌中分离出来。具有抗热性。（2）小牛肠碱性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase,CIP 从小牛肠中纯化出来。SDS中加热68。（2可完全失活。1032.碱性磷酸酶的特性催化脱掉DNA(或RNA)5,端的磷酸根。55 P-I I-OH yy HO-P 5,碱性磷酸酶5,HO-OH yy HO-I I-OH 53.碱性磷酸酶的功能(1)防止线性化的载体份子自我连接104单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。或 AAGCTT _TTCGAA)I Hind川酶切A-OH 5 P-AGCTT.TTCGA-P 彳 HO-A 1!碱性磷酸酶105A-OH HO-AGCTTTTCGA-OH HO-AOH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。同一酶切后的外源DNA的5,端有P,能与脱磷酸的载体OH连接。106外源DNA5PAGCTT-1A-OH y3 HOA-1TTCGA-P 5107第五节 核酸外切酶(Exonucleases)是一类从多核昔酸链的一头开始催化降解核普 酸的酶。一、单链DNA外切酶1.大肠杆菌核酸外切酶I(exo I)5-3,外切|识别5-0H2.大肠杆菌核酸外切酶区(exo VII)53 3,一5,外切识别30H、5P108二、双链DNA外切酶L核酸外切酶III(exo III)3，5,外切 识别3-0H主要用途:在DNA双链的末端产生出单链区域。与k I enow配合进行3,端标记1092.九核酸外切酶a exo）5,一 3,外切。识别5P（但不能降解50H）主要用途：使DNA双链变成单链（短）。55成为测序模板。1103.T7基因6核酸外切酶5，73,外切。既能识别5P,又能识别50H。5,I II 1 5I 591 1用途与九exo一样。已被克隆到大肠杆菌中表达。111DNA外切at1切割方式识别位点单链大肠杆菌，(exo I)核酸外切酶1513，50H大肠杆菌，(exo VII：核酸外切)酶VII53，5T3OH双链核酸外切i酶 III(exo III)35，30H九核酸外力口酶(Xexo)53，5TT7基因6核酸外切酉1535T5-OH112单链DNA内切酶113一、S1核酸酶1.来源稻谷曲霉(Aspergillus oryzae)。2.特性(1)高度单链特异性(2)反应条件低水平ZM+pH4.04.31143.S1核酸内切酶的功能(1)催化单链RNA或DNA降解。(2)切掉双链核酸中的单链区。发卡或有缺口的部位。甚至能识别单个核昔酸的单链区!、t/TACGTA CGTACGATGCAT GCATGC4.S1核酸酶的用途(1)定位RNA某限制酶位点（参照物）DNA/某限制酶切反?与RNA杂交RNA200bp400bp内切酶位点不能位于内含子序列中!117RNA位置一 人RNA位于某限制酶位点左200bp和右400bp。(2)用mRNA测定基因中的外显子序列不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。DNAmRNA118二、Bal 31核酸酶1.来源埃氏交替单胞菌(Alteromonoas espejiana)2.功能既有单链特异的DNA(RNA)内切酶;又有双链特异的DNA外切酶。降解双链DNA或其上的单链缺口、未配对的 单链区域。1193.反应条件Mg2+、Ca2+EGTA（乙二醇双四乙酸）专一性螯合Ca2+,可终止反应。4.Ba 131的用途定位测定DNA片断中的限制酶位点分布oBarA IEcdR IcoR I120Ba 131控制消化法:用Ba 131消化线性DNA,并在不同的时间加 入EGTA终止反应,再酶切电泳。与对照组（不用Ba 131消化）只用相同的酶切的电泳比较。根据酶切片断消失的先后顺序，判断这些片断在原DNA中的位置。121Hind IIIEcoR I BamH I EcoR I分别用各个内切酶切后电泳，记录片断122Hind IIIBal31Hind III 1