第七章DNA体外重组与基因转移总结.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,第七章,DNA,体外重组与基因转移,二、,重组,DNA,分子的转化和扩增（转、增）,一、,DNA,的体外重组（切、接）,第八章 重组子的筛选与鉴定（检）,第九章 外源基因的表达,切,接,转,增,检,一、,DNA,的体外重组（切与接）,1.,同种内切酶生产的粘性末端的连接,2.,同尾酶生产的粘性末端的连接,3.,不同粘性末端的连接,5.,粘性末端的更换,4.,人工粘性末端的连接,6.,重组率,1.,同种内切酶生产的粘性末端的连接,5,5,GAATTC,CTTAAG,GAATTC,CTTAAG,EcoRI,5,G,CTTAA,AATTC,G,5,5,G,CTTAA,5,5,AATTC,G,5,退火,G,CTTAA,AATTC,G,5,G,CTTAA,5,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,5,G,CTTAA,5,AATTC,G,T4-DNA,ligase,G,AATTC,CTTAA,G,5,5,G,AATTC,CTTAA,G,G,AATTC,CTTAA,G,5,5,G,AATTC,CTTAA,G,2.,同尾酶生产的粘性末端的连接,BamHI,5,5,GGATCC,CCTAGG,GGATCC,CCTAGG,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,T,ACTAG,5,5,GATCA,T,5,退火,G,CCTAG,GATCC,G,5,T,ACTAG,5,GATCA,T,T4-DNA,ligase,T,GATCC,ACTAG,G,5,5,G,GATCA,CCTAG,T,5,TGATCA,ACTAGT,5,BclI,G,CCTAG,GATCC,G,5,T,ACTAG,5,GATCA,T,T,GATCC,ACTAG,G,5,5,G,GATCA,CCTAG,T,3.,不同粘性末端的连接,BamHI,5,5,GGATCC,CCTAGG,GGATCC,CCTAGG,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,CTGCA,G,5,G,ACGTC,3,T4-DNA,ligase,C,GATCC,G,CTAG,G,5,5,G,GATC,G,CCTAG,C,5,CTGCAG,GACGTC,5,PstI,3,T4-DNA,pol,切平,5,C,G,5,G,C,Klenow,补平,5,G,GATC,CCTAG,GATCC,5,CTAG,G,C,GATCC,G,CTAG,G,5,5,G,GATC,G,CCTAG,C,4.,人工粘性末端的连接 （,1,）,5,突出末端,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,G,CTTAA,5,5,5,AATTC,G,T4-DNA,ligase,5,5,Klenow,补平,Klenow,补平,5,G,GATC,CCTAG,GATCC,5,CTAG,G,5,G,AATT,CTTAA,5,5,5,AATTC,TTAA,G,TdT,TdT,dGTP,dCTP,G,AATT,GGGGGG,CTTAA,AATTC,GGGGGG,TTAA,G,G,GATC,CCCCCC,CCTAG,GATCC,CCCCCC,CTAG,G,G,AATT,GGGGGG,GATCC,CTTAA,CCCCCC,CTAG,G,G,GATC,CCCCCC,AATTC,CCTAG,GGGGGG,TTAA,G,5,5,G,AATT,GGGGGG,GATCC,CTTAA,CCCCCC,CTAG,GG,GATC,CCCCCC,AATTC,CCTAG,GGGGGG,TTAA,G,退火,BamH,I,BamH,I,EcoR,I,BamH,I,4.,人工粘性末端的连接 （,2,）,3,突出末端,CTGCA,3,G,G,3,ACGTC,5,GCATG,3,C,5,C,3,GTACG,T4-DNA,ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATG,CCCCCC,3,C,退火,Pst,I,Pst,I,C,3,CCCCCC,GTACG,CTGCA,GGGGGG,3,G,G,3,GGGGGG,ACGTC,5,5,GCATG,CCCCCC,G,C,GGGGGG,ACGTC,CTGCA,GGGGGG,C,G,CCCCCC,GTACG,5,5,GCATG,CCCCCC,G,C,GGGGGG,ACGTC,CTGCA,GGGGGG,C,G,CCCCCC,GTACG,5,5,GCATG,CCCCCC,TGCA,G,C,GTAC,GGGGGG,ACGTC,CTGCA,GGGGGG,CATG,C,G,ACGT,CCCCCC,GTACG,5,5,GCATG,CCCCCC,TGCA,G,C,GTAC,GGGGGG,ACGTC,CTGCA,GGGGGG,CATG,C,G,ACGT,CCCCCC,GTACG,Klenow,Pst,I,Sph,I,4.,人工粘性末端的连接 （,3,）,平头末端,C,3,G,G,5,G,3,C,5,C,3,G,T4-DNA,ligase,TdT,TdT,dTTP,dATP,G,TTTTTTTTTT,3,C,退火,C,3,TTTTTTTTTT,G,C,AAAAAAAAAA,3,G,G,3,AAAAAAAAAA,C,5,5,G,TTTTTTTTTT,G,C,AAAAAAAAAA,C,C,AAAAAAAAAA,C,G,TTTTTTTTTT,G,S1,C,3,5,5,G,TTTTTTTTTT,G,C,AAAAAAAAAA,C,C,AAAAAAAAAA,C,G,TTTTTTTTTT,G,加热,G,T,C,A,T,T,T,T,T,T,T,T,T,G,A,A,AAAA,A,A,A,C,C,A,G,T,A,A,A,A,A,A,A,A,A,C,T,T,TTTT,T,T,T,G,T,G,A,C,C,A,G,T,5.,粘性末端的更换,BamHI,5,5,GGATCC,CCTAGG,T4-DNA,ligase,Klenow,补平,GATCC,5,G,5,G,CCTAG,5,5,5,G,GATC,CCTAG,5,GATCC,CTAG,G,5,5,G,GATC,GGAATTCC,GATCC,CCTAG,CCTTAAGG,CTAG,G,5,5,EcoR,I,GGAATTCC,CCTTAAGG,EcoR,I linker,BamHI,的位点已被破坏,6.,重组率,重组率的定义,重组率=含有外源,DNA,的重组分子数/载体分子总数,在常规实验条件下，重组率一般为,25-75%,重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以,大大简化,DNA,重组的后续操作。,进行体外重组,(,体外的连接反应,),注重的插入片段和载体的比值。,重组率,提高重组率的方法,提高外源,DNA,片段与载体的分子比,：,5,:,1,-,10,:,1,载体,DNA,分子在连接前先除去磷酸基团：,5,5,GAATTC,CTTAAG,GAATTC,CTTAAG,EcoRI,5,G,CTTAA,p,AATTC,G,5,p,5,G,CTTAA,OH,5,5,AATTC,G,5,HO,退火,5,G,-,A,-,A,-,T,-,T,-,C,C,-,T,-,T,-,A,-,A,G,5,G,A,-,A,-,T,-,T,-,C,C,-,T,-,T,-,A,-,A,-,G,OH,HO,OH,HO,碱性磷酸单酯酶,碱性磷酸单酯酶,特别针对,单酶切,连接,重组率,提高重组率的方法,加装同聚尾末端：,CTGCA,3,G,G,3,ACGTC,5,GCATG,3,C,5,C,3,GTACG,T4-DNA,ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATG,CCCCCC,3,C,退火,C,3,CCCCCC,GTACG,CTGCA,GGGGGG,3,G,G,3,GGGGGG,ACGTC,5,5,GCATGCCCCCC,G,C,GGGGGG,ACGTC,CTGCA,GGGGGG,C,G,CCCCCC,GTACG,5,5,GCATG,CCCCCC,TGCA,G,C,GTAC,GGGGGG,ACGTC,CTGCA,GGGGGG,CATG,C,G,ACGT,CCCCCC,GTACG,Klenow,二、重组,DNA,分子,的转化和扩增（转与增）,1.,转化的原理与技术,2.,转化率,3.,转化细胞的扩增,1.,转化的原理与技术,Ca,2+,诱导的完整细菌细胞的转化,Ca,2+,诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），,1970,年建立此技术，其原理是,Ca,2+,与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做,感受态,.,感受态细胞的制备,（,1,）,Ca,2+,诱导的完整细菌细胞的转化,感受态的制备：,菌液接种于,LB,液体培养基中，,37,至,OD=0.3,0.4,；,收集菌体；,预冷的,CaCl,2,溶液重悬细胞，冰上放置,30 min,；,再次收集菌体；,预冷的,CaCl,2,溶液悬浮细胞。,（若现用，可,4,保存，,12,24 h,内使用转化效率最高；若长期使用，加灭菌的甘油至终浓度为,15%,20%,，混匀，液氮速冻后冻存于,-70,冰箱中。）,重组质粒的转化感受态细胞,大肠杆菌感受态细胞,的质粒转化：,取100,m,l,感受态细胞，加入相当于,50,ng,载体的重组,冰浴静置,30 min,；,在42静置,90,秒,（热激）；,快速将转化细胞转移至冰浴中静置,2,min,；,DNA,连接液，轻轻混匀；,加入,1,ml,新鲜培养基，,于37,培养,1,h,（恢复活力、扩增并表达抗性）；,涂在含抗生素的固体培养基平板上进行蓝白斑筛选,（,2,）细菌原生质体的转化,革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源,DNA,的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用,原生质体,（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组,DNA,分子,酵母菌、霉菌、植物细胞也可用,原生质体法进行转化,不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如,34%,的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在,10.3%,的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂,细菌原生质体,的制备：,取,0.2-1,ml,的原生质体悬浮液（10,8,-10,9,个原生质体），加入,10-20,m,l DNA,重组连接液，同时加入含有,PEG1000,和,Ca,2+,的等渗溶液，混匀,细菌原生质体,的转化：,细菌原生质体,的再生,：,原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素,（,3,l,噬菌体,DNA,的转染,感受态细胞的培养：,将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和,MgCl,2,的培养基,中培养至,OD,600,=0.5,吸附：,加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟,转染裂解：,加入20倍体积的新鲜培养基，30培养2小时，直至培养液,中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选,（,4,）电穿孔转化,将待转化的质粒或,DNA,重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或,DNA,重组分子便可进入细胞内,电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验,2.,转化率,（,1,）转化率的定义,转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每,微克,载体,DNA,在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每,微克,载体,DNA,转化后，受体细胞接纳,DNA,的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）,例如，,pUC18,对大肠杆菌的转化率为,10,8,，即每微克,pUC18,中只有,10,8,个分子能进入受体细胞。,一,微克,pUC18,共有,3.4,X10,11,个分子（,6.02,X10,17/2686X660,），,也就是说，每,3400,个,pUC18,分子才有,一,个分子进入受体细胞,另一方面，在实际操作过程中，转化,一,微克,pUC18,共需,2,ml,感受态细胞，大约含有,2,X10,10,个大肠杆菌细胞，也就是说，每,200,个细胞只有,一,个细胞能接纳,pUC18 DNA,（,2,）转化率的用途,利用转化率和重组率等参数可以帮助设计,DNA,重组实验规模,例如，,某一,DNA,重组实验的重组率为,20%,，转化率为,10,7,/,m,g,载体，,经切接处理后的载体转化率比天然的载体低,100,倍，,欲获得10,4,个,重组克隆，需投入多少载体,DNA,进行重组实验？若重组率为,100%,，则转化后产生,10,4,个重组克隆需要：,10,4,/10,7,X 10,-2,=0.1,m,g,载体,DNA,考虑到实验系统的重组率为,20%,，所以实际投入载体应为：,0.1/20%=0.5,m,g,载体,DNA,载体投入量确定后，外源,DNA,的投入量即可按,101,的要求算,出（,5,m,g,），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选,（,3,）转化率的影响因素,载体及,DNA,重组分子方面：,载体本身的性质,：,不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同,载体的空间构象,：,质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载,体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的,超螺旋质粒低两个数量级,插入片段的大小,：,对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低,受体细胞方面：,受体细胞必须与载体相匹配，例如：,pBR322,转化大肠杆菌,JM83,株，转化率很低；但对大肠杆菌,ED8767,株的转化率则较高,转化方法方面：,受体细胞的预处理,：,影响最大,供受体的比例,：,Ca,2+,诱导转化,0.1,ml,感受态,细胞,50,ng,DNA,转化方法,：,Ca,2+,诱导转化,10,6,-10,7,/,m,g DNA,原生质体转化,10,9,个,原生质体,50,ng,DNA,原生质体转化,10,5,-10,6,/,m,g DNA,l,-DNA,转染,10,7,-10,8,/,m,g DNA,电穿孔转化,10,6,-10,9,/,m,g DNA,3.,转化细胞的扩增,（,1,）扩增操作,转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：,Ca,2+,诱导转化后的,37,培养,一个,小时,原生质体转化后的再生过程,l,噬菌体转染后的,30,培养等，均属扩增操作,（,2,）扩增操作的目的,增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序,扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选,表达外源基因，便于筛选和鉴定,第八章 重组,转化子的筛选和鉴定（检）,一、载体遗传标记检测,二、克隆,DNA,序列检测,三、外源基因产物检测,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分,转化子,与非转化子,、,重组子,与非重组子、,目的重组子,与非目的重组子,转化子,重组子,目的重组子,一、载体遗传标记检测,1.,抗药性筛选法,ROP,ROI,Sal I,BamH,I,Tc,r,Pvu,I,Pst,I,Pst,I,EcoR,I,Cla,I,Hind III,Hind II,Bal I,Ap,r,抗药性筛选法的基本原理：,pBR322,4363,bp,ori,抗药性筛选法可区分,转化子,与非,转化子、,重组子,与非重组子,将外源,DNA,片段插在,Pst,I,位点：,非重组子呈,Ap,r,、,Tc,r,Tet,重组子呈,Ap,s,、,Tc,r,将外源,DNA,片段插在,BamHI,位点：,非重组子呈,Ap,r,、,Tc,r,重组子呈,Ap,r,、,Tc,s,环丝氨酸 四环素 抑菌,抗药性筛选法的基本操作：,先将转化液涂布含有,Ap,的平板,再将,Ap,平板上的转化子影印至,含有,Ap,和,Tc,的平板上,在,Ap,平板上生长、但在,Ap,和,Tc,平板上,不长的转化子即为,Ap,Ap,+,Tc,影印,挑选,重组子,2.,营养缺陷型筛选法,营养缺陷型筛选法的基本原理：,营养缺陷型筛选法可以区分,转化子,与非转化子，一般不能区分,重组子,与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子,氨基酸,核苷酸,常见的营养缺陷型筛选标记：,哺乳动物细胞中存在两条,dTTP,的合成途径：,用于,大肠杆菌,的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因,trp,+,用于高等,哺乳动物细胞,的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激,酶基因,tk,，,相应的受体细胞则选择,tk,-,缺陷型,dCDP,dTDP,dTTP,胸腺嘧啶核苷,dTMP,dTDP,dTTP,AP,TK,AP,氨基喋呤,TK,胸腺嘧啶核苷激酶,3.,显色筛选法,显色筛选法的基本原理：,显色筛选法可以区分,转化子,与非转化子，也可区分,重组子,与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒,pUC18,携带的,lacZ,基因（蓝色反应）、链霉菌质粒,pIJ702,携带的,melC,基因（黑色反应）等,互补现象,（,-,半乳糖苷酶法）,lacZ,Am,N,2,H,片段,受体,COOH,片段,供体,lacZ,显色筛选法的基本操作：,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,Ap,+X-gal,重组子（,Ap,r,+,lacZ,-,）,将外源基因克隆在,pUC18,的,lacZ,标记,基因内部，使之灭活，此时重组子呈,Ap,r,、,lacZ淡黄色菌落；而非重组子则呈,Ap,r,、,lacZ,+,，,蓝色菌落,二、克隆,DNA,序列检测,1.,限制性酶切图谱法,所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源,DNA,片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分,重组子,与非重组子，而且还能鉴定,目的重组子,。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。,某一细菌质粒载体的,Tet,r,基因中含有一个,Hind,切点，用,Hind,切割果蝇的基因组,DNA,，并以该载体构建基因文库，分子杂交证明阳性克隆带有果蝇的目的基因，用,Hind,和,EcoRV,对质粒和阳性克隆克隆,15),进行酶切分析，电泳结果如图,1,，试绘出含有插入片段和不含插入片段的质粒限制性酶切图谱，并标明,Tet,r,的位置。,全酶解图谱法：,pUC18,2.7 kb,HindIII,SphI,PstI,SalI,BamHI,SmaI,KpnI,EcoRI,Ap,r,lacZ,ori,B,B,E,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,区分重组子与非重组子,用,BamHI,酶切转化子质粒,DNA,电泳观察酶解产物片段,重组子：,2.7,kb,+4.0 kb,非重组子：,2.7,kb,如果外源,DNA,片段也是,2.7,kb,，,最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然,后通过其长度来鉴定其是否为重组子,全酶解图谱法：,pUC18,2.7 kb,HindIII,SphI,PstI,SalI,BamHI,SmaI,KpnI,EcoRI,Ap,r,lacZ,ori,S,S,B,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,区分重组子与非重组子,如果外源,DNA,片段插在,pUC18,的,SphI,位点处，原则上也可用,SphI,酶解鉴定，但这样做很不经济，因为,SphI,非常昂贵（每,100,单位,50,美元）。用,HindIII,和,EcoRI,联合酶解同样可以达到目的,。,Sph I,：,150U,，,120,元,Hind III,：,3000U,，,120,元,EcoR I,：,4000U,，,120,元,全酶解图谱法：,pUC18,2.7 kb,HindIII,SphI,PstI,SalI,BamHI,SmaI,KpnI,EcoRI,Ap,r,lacZ,ori,BamHI,BamHI,EcoRI,PstI,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,区分目的重组子与非目的重组子,用,EcoRI,酶切转化子质粒,DNA,目的重组子：,3.0,kb,+,3.7 kb,或者：,1.0,kb,+,5.7 kb,反向,用,PstI,酶切转化子质粒,DNA,目的重组子：,3.2,kb,+,3.5 kb,或者：,0.8,kb,+,5.9 kb,反向,全酶解图谱法：,pUC18,2.7 kb,HindIII,SphI,PstI,SalI,BamHI,SmaI,KpnI,EcoRI,Ap,r,lacZ,ori,B,B,E,4.0 kb,2.0 kb,2.0 kb,区分目的重组子与非目的重组子,对图示的克隆片段，转化子质粒,DNA,用,EcoRI,酶切开后，只出现,2.0,kb,和,2.7,kb,两条带子，实际上,2.0,kb,的条带中含有两种不同的分子。,2.7 kb,2.0 kb,E,检测克隆,DNA,序列的其它方法：,菌落或噬菌斑原位杂交法,DNA,序列分析法,蛋白质生物功能测定法,掌握：使用噬菌斑原位杂交法检测克隆,DNA,序列的方法中，杂交探针,标记的方法有哪几种？,菌落或噬菌斑原位杂交法,菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或,DNA,片段的,同源序列,设计并合成,探针,，以此搜寻筛选含有目的基因的,目的重组子,。其中，,DNA,同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。,菌落原位杂交法的基本操作：,影印,用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板,洗涤,杂交,感光,用,0.4,N,的,NaOH,溶液浸泡影印薄膜,用,SSC,溶液浸泡清洗影印薄膜,80,烘干固定影印薄膜,薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温,用,SSC-SDS,液洗涤杂交薄膜,用,X,光胶片覆盖薄膜感光,杂交探针的制备：,用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：,单链结构（双链,DNA,可用碱变性）,足够长度（至少,12个,碱基）,内部不含互补区,探针的制备方法或来源包括：,人工合成,cDNA,合成,同源序列,mRNA,杂交探针的标记,1,：,T4-PNP,介导的末端标记,5,HO,3,HO,OH,3,OH,5,T4-PNP,Mg,2+,p,ppATP（,g,-,32,P-ATP）,5,p,3,HO,OH,3,p,5,杂交探针的标记,2,：,逆转录酶,介导的反转录标记,3,AAAAAAAAAAACCAGCTTCC,G,AACTGATTTAGGCT,5,mRNA,反转录酶,Mg,2+,dNTP,+,p,p,p,d,ATP（,a,-,32,P-dATP,）,5,TTTTTTTTTTT,5,mRNA,3,cDNA,3,AAAAAAAAAAACCAGCTTCC,G,AACTGATTTAGGCT,5,TTTTTTTTTTT,GGTCG,AA,GG,CTTG,A,CT,AAA,TCCG,A,杂交探针的标记,3,：,DNA,聚合酶,介导的缺刻前移标记,5,G,-,C,-,T,-,C,-,A,-,G,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G,-,T 3,3,C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C,-,A,5,Mg,2+,5,dNTP,5,pp,p,dA（,a,-,32,P-dATP）,5,G,C,-,T,-,C A,-,G,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G,-,T 3,3,C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C,-,A,5,5,G,-,C,-,T,-,C,-,A-G,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G,-,T 3,3,C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C,-,A,5,DNase,I,DNA,pol,I,杂交探针的标记,4,：,ABC,荧光标记,GCTTGAGCAGTAACCTG,荧光胺,Biotin,生物素,Avidin,生物素结合蛋白,烷烃连接臂杂交探针的标记,5,：,ABC,显色酶标记,GCTTGAGCAGTAACCTG,显色酶,Biotin,生物素,Avidin,生物素结合蛋白,烷烃连接臂,生色底物,颜色产物,杂交探针的标记,6,：,地高辛系统标记,dUTP,-,连接臂,-,甾醇半抗原,digoxigenin,DIG,抗体,-,显色酶,交联复合物,DNA,序列分析法,双脱氧末端终止测序法的基本原理：,DNA,序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采用,Sanger,发明的,双脱氧末端终止法,测定,DNA,序列，其工作原理是在,DNA,聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定,DNA,序列其关键技术有：,DNA,链聚合反应时的定点随机中断（,ddNTP,）,聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（,600,bp,/601,bp,）,电脑自动检测、记录、编辑程序,用于,DNA,测序的专一性试剂盒（,Kit,）,F.Sanger,克隆,DNA,序列检测,DNA,序列分析法,双脱氧末端终止测序法的基本操作：,A,C,G,T,ssDNA,ssDNA,ssDNA,ssDNA,Primer,Primer,Primer,Primer,Klenow,Klenow,Klenow,Klenow,dNTPs,dNTPs,dNTPs,dNTPs,ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP,A,G,T,C,DNA,聚合反应,聚丙烯酰胺凝胶电泳,克隆,DNA,序列检测,DNA,序列分析法,双脱氧末端终止测序法的基本反应：,Klenow,OH 3,5,P,T,dNTP,+,ddATP,T,T,T,T,T,OH 3,5,P,A,G,T,C,GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA,外源基因产物检测,聚丙烯酰胺凝胶电泳法,如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用,聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,淀粉酶目的基因的鉴定：,淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶,淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水,的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将,待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的,目的重组子,可,其表达的淀粉酶分泌出胞外，并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性,的多糖或单糖。因此，,目的重组子,菌落周围会形成透明圈。如果透,明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底，,易于辨认。,蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,抗菌素抗性基因的鉴定：,抗菌素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素的抗性。据此，只需往培养板中加入适量抗生素，理论上长出的菌落即是含有目的基因的目的重组子,在实际操作过程中，由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗性，因此必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒，,二次转化,受体细胞。如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落，即可认为这种抗性确由目的基因的编码产物产生,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,抗菌素抗性基因的鉴定：,目的重组子,诱导抗性,抽取重组质粒,再次转化,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,DNA,结合蛋白编码基因的鉴定：,影印,用,聚乙烯薄膜,影印裂解平板,洗涤,杂交,感光,轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定,80,烘干固定影印薄膜,与探针溶液中杂交,洗涤、干燥、感光,用,氯仿蒸汽,或,烈性噬菌体喷洒,克隆平板,聚乙烯膜,探针选用能与,目标蛋白特异,性结合的,DNA,片段,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,杂交释放转译,鉴定合并,变性,挂柱,制备,上样,淋洗,洗,脱,翻,译,测,活,重组,DNA,单链,DNA,mRNA,杂交的,mDNA,蛋白质,蛋白质,无细胞体外翻译系统：,麦胚提取物、网织红细胞提取物,外源基因产物检测,蛋白质生物功能鉴定法,放射免疫原位杂交,鉴定：,影印,用固定了特异性抗体的,聚乙烯薄膜,影印,洗涤,与,I,125,标记的,IgG,保温,感光,轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定,与,I,125,标记的,IgG,保温,洗涤、干燥、感光,用,氯仿蒸汽,或,烈性噬菌体喷洒,克隆平板,含抗体的聚乙烯膜,裂解平板,外源基因产物检测,蛋白质生物功能鉴定法,免疫沉淀,鉴定：,在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体,然后涂布转化液,37,培养,经培养后，目的重组子菌落变会分泌出目标,蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀,反应，在菌落周围形成白色的圆斑,此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大,第九章 外源基因的表达,一,.,当外源基因引入某宿主细胞表达时，应考虑以下各种因素：,1.,外源基因的启动子顺序能否在宿主细胞起作用（利用表达载体）,2.,对转录产物能否进行加工修饰（利用,cDNA,）,3.,转录产物的稳定性,4.,转录产物的核糖体识别顺序能否为宿主细胞的翻译系统所识别（利用表达载体的基因融合技术）,5.,密码子的使用频率（选用适当宿主细胞）,6.,翻译产物的后修饰 选用适当宿主细胞,7.,翻译产物的稳定性,8.,外源基因产物对宿主是否有害,9.,外源基因产物产量（选用不同拷贝数的载体）,10.,外源基因的最终产物是否具有生物活性（选用适当宿主细胞）,11.,外源基因的稳定性（改变宿主细胞遗传特性，如将外源基因插入染色体）,12.,对于制备大量外源基因产物，还须考虑到表达产物与其它细胞成分的分离方法,二,.,表达系统,1.,大肠杆菌系统,:,融合表达和直接表达,小于,80AAs,的多肽可用融合表达系统,分子量在,100-300AAs,且无过多半胱氨酸的多肽可用直接表达,pET(,p,lasmid,for,e,xpression by,T,7 RNA polymerase),pTrcHis系列载体,2.,酵母表达系统,:,酿酒酵母,和,巴氏毕赤酵母,(,Pichia,pastoris,),系统,直接表达和分泌表达,3.,昆虫杆状病毒表达系统,直接表达和分泌表达,4.,哺乳动物细胞表达系统,瞬时表达和稳定表达,:,非微生物来源的大于,500AAs,的分泌蛋白质和表面受体蛋白,考试题型,一、名词解释（,3,5,）,二、判断（,110,）,三、填空题（,1,10,）,四、问答（,10,5,）,五、分析和计算（,15 1;101,）,研究,基因表达应从以下几个方面考虑：,1,）,转录,：起始，延长和终止。基因转录的调控主要是起始阶段,2,）,转录后修饰,：,hnRNA,的加帽，加尾，拼接,3,）,翻译,：起始，延长和终止。调控亦是在起始阶段,4,）,翻译后修饰,：蛋白质的糖基化，蛋白质水解反应，蛋白质的分泌等。,一转录系统,1.,体外转录系统,1,）分离,RNA,聚合酶，然后在体外进行待测,DNA,的转录反应,2,）利用全细胞抽提液，加入外源,DNA,，,目前使用最广泛的抽提液来自海拉细胞和,KB,细胞,3,）利用具有,SP6,T3,和,T7,启动子的载体转录插入的外源,DNA,2.,体内转录系统,先分离细胞核，再进行转录反应,二翻译系统,体外翻译系统,（,In vitro translation system,）,又称之为体外蛋白质合成系统,(in vitro protein synthesis system),，,是一种细胞裂解物，这种系统只有翻译功能，当加入外源,mRNA,，,能量物质和氨基酸，该系统就能合成蛋白质，经,SDSPAGE,后可检测出翻译活性。,常用翻译系统有以下几种：,1.,兔网织细胞裂解物,(,reticylocyte,lysate,system),由未成熟的兔红细胞裂解而成，该种细胞是向动物,注射苯肼,后引起贫血产生的,向该系统加入血红素基和能量物质，裂解物中的内源,mRNA,可被翻译成球蛋白，其合成速度与用完整细胞的合成速度接近。,2.,小麦胚抽提物,(wheat germ extract),该系统不具内源,mRNA,，,属外源,mRNA,依赖型，利用,Sephadex-G50,可减少该系统中的内源氨基酸，因而可大大增加翻译产物的高比活性。,由于该系统存在着核酸酶和蛋白酶，因此不能用于翻译很大的,mRNA,，,该系统仅为前一系统活性的,1/10,。,3.,其它系统：,鼠骨髓瘤抽提物，艾氏腹水瘤和酿酒酵母裂解物等。,4.,两栖动物卵母细胞,:,翻译效率高，翻译产物稳定，灵敏度高（,10ng mRNA,），,也可作为转录,翻译系统。,微球菌核酸酶可除去内源,mRNA,，,同时也不会对系统中的,tRNA,和,rRNA,损伤过大。由于该核酸酶的活性依赖于,Ca,2+,，,当除去内源,mRNA,后，可用,EGTA,除去,Ca,2+,此系统仍可保持,70%,的活性。,因该系统无内源核酸酶和蛋白酶，可用于大分子,mRNA,的翻译。,三转录,翻译系统,1.,原核生物系统,1),体内基因表达系统,i.,UV,照射宿主系统,(U.V.irradiated host system),E.coli,经大量紫外线照射后，宿主细胞合成大大减少，然后感染携带外源基因的重组,分子，并同时加入带标记氨基酸。新合成的蛋白质用,SDSPAGE,检查。大多数的,蛋白质合成可用宿主已有的溶源化,或携带的质粒（含有,CI,基因）抑制。,ii.,小细胞系统,(,minicell,system),E,.,coli,突变株（,min A,，,min B,）可形成大量无核小细胞，但细胞中的质粒,DNA,可进入小细胞，当纯化的小细胞与带标记的氨基酸共培养，质粒上携带的外源基因便可获得表达，产物用,SDSPAGE,检查。,iii.,大细胞系统,(,maxicell,system),对紫外光敏感的,E,.,col,i,突变株经低剂量紫外光照射后，损伤的,DNA,会被大量降解，由于质粒,DNA,分子量小，可继续存活。加入标记氨基酸后，质粒上的外源基因可获带标记产物，用,SDSPAGE,分析。,2,),体外基因表达系,E,.,coli,无细胞粗提液，加入外源,DNA,和必须因子后可得表达产物。,2.,真核生物系统,1),哺乳动物细胞,2),两栖动物卵母细胞,第二节,外源基因的表达,一,.,当外源基因引入某宿主细胞表达时，应考虑以下各种因素：,1.,外源基因的启动子顺序能否在宿主细胞起作用（利用表达载体）,2.,对转录产物能否进行加工修饰（利用,cDNA,）,3.,转录产物的稳定性,4.,转录产物的核糖体识别顺序能否为宿主细胞的翻译系统所识别（利用表达载体的基因融合技术）,5.,密码子的使用频率（选用适当宿主细胞）,6.,翻译产物的后修饰 选用适当宿主细胞,7.,翻译产物的稳定性,8.,外源基因产物对宿主是否有害,9.,外源基因产物产量（选用不同拷贝数的载体）,10.,外源基因的最终产物是否具有生物活性（选用适当宿主细胞）,11.,外源基因的稳定性（改变宿主细胞遗传特性，如将外源基因插入染色体）,12.,对于制备大量外源基因产物，还须考虑到表达产物与其它细胞成分的分离方法,二,.,表达系统,1.,大肠杆菌系统,:,融合表达和直接表达,小于,80AAs,的多肽可用融合表达系统,分子量在,100-300AAs,且无过多半胱氨酸的多肽可用直接表达,pET(,p,lasmid,for,e,xpression by,T,7 RNA polymerase),pTrcHis,系列载体,2.,酵母表达系统,:,酿酒酵母,和,巴氏毕赤酵母,(,Pichia,pastoris,),系统,直接表达和分泌表达,3.,昆虫杆状病毒表达系统,直接表达和分泌表达