第二章--种子制备.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text stylesgood1,Second levelgood2,Third levelgood3,Fourth levelgood4,Fifth levelgood5,第二章种子制备,*,生化工艺,制药与生物工程系,第二章种子制备,知识目标,1了解常见工业微生物的种类，工业微生物菌种的筛选，微生物选择性分离的原理，重要工业微生物的分离。,2理解菌种的选育方法，如诱变育种，抗噬菌体菌株的选育，杂交育种，原生质体融合技术。,2,能力目标,1.掌握种子的扩大培养，包括实验室种子制备，生产车间种子制备，基因重组微生物种子培养。,2.掌握种子质量的控制，包括影响种子质量的因素及控制，种子异常分析。,3,第一节 工业微生物菌种概述,4,（1）在较短的发酵过程高产有价值的发酵产品,（2）菌种的发酵培养基易获得，价格低廉,转化效率高,（3）菌种对人、动物、植物和环境没有危害，保证安全,（4）菌种发酵后，所产不需要的代谢产物少，产品分离容易,（5）菌种不易变异退化，稳定性好,一、发酵工业对菌种的要求：,5,二、发酵工业常用的微生物,微生物的代谢产物多达1300多种，而用于大规模工业化生产的不足100多种；微生物酶有近千种，而工业上用的不过4050种。因此，微生物具有巨大的潜力可挖掘。,61.细菌,大肠杆菌,应用：生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。,7,乳酸杆菌,应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作,8,枯草芽孢杆菌,应用：生产淀粉酶,9,2.酵母菌,种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵母、面包酵母,应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪,啤酒酵母的菌落特征,啤酒酵母,11,啤 酒 酵 母 红 酵 母,12,面包酵母,13,3.霉菌,曲霉,黑曲霉,应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶,14,黄曲霉,应用：酱油、酱类（淀粉酶）,15,应用：生产甲义丁二酸,米曲霉,应用：产糖化酶和蛋白酶,应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作,毛 霉,17,根霉,种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉,应用：酿酒,18,19,青霉,20,应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶,21,4.放线菌,种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素,应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素,第二节 菌种的选育,1.自然选育,把菌种制备成单孢子悬浮液，经过适当的稀,释以后，在固体平板上进行分离，挑取部分,单菌落进行生产能力的测定，经反复筛选，,以确定生产能力更高的菌株代替原来的菌株,自然选育的一般步骤,表现形态,目的代谢产物产量,遗传基因型纯度,传代稳定性,24,从自然界中分离筛选菌种的方法步骤,采 样,增殖培养,纯种分离,纯培养,生产性能测定,方法、地点、时间和周围环境记录,纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：,1,稀释分离法,2,平板划线分离法,涂菌：,划线分离：,分步划线法；一次划线法：,3,组织分离法,测定代谢产物或其它目的性状,25,2.诱变育种,指用人工的方法处理微生物，使它们发生突变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学实验用。诱变育种与其他育种方法相比，具有操作简便、速度快和收效大的优点，至今仍是一种重要的、广泛应用的微生物育种方法。,26,诱变的基本原理,诱变剂,物理诱变剂 紫外线、X射线、,射线，快中子,化学诱变剂 亚硝酸、烷化剂,生物诱变剂 噬菌体,诱变机理,物理诱变剂紫外线：形成胸腺嘧啶二聚体,化学诱变剂碱基突变、染色体畸变,27,诱变育种步骤,出发菌株的选择,处理菌悬液的制备,诱变处理,中间培养,分离和筛选,关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液,28,确定出发菌株,菌种的纯化选优,出发菌株的性能鉴定,同步培养,制备单细胞（或单孢子）悬液,活菌浓度测定,诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验,诱变处理,平板分离,计形态变异的菌落数，计算突变率,挑取疑似突变菌落纯培养,突变体的初步筛选,用简单快捷的方法,重复筛选,摇瓶发酵试验,选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）,29,中间培养,处理方法：,让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。,30,分离和筛选,筛选分初筛和复筛。,初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。,复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.,例如：,初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。,31,紫外线的诱变育种,紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。,被照射的菌悬液细胞数，细菌为10,6,个ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为10,6,10,7,个ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。,由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。,32,3.基因工程技术,基因工程技术：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达的方法,。,33,基本程序,含目的基因DNA片段的制备；,选择合适的载体；,带有目的基因的DNA片段与载体在体外连接；,将重组的DNA分子转入受体细胞，在受体细胞内扩增；,筛选出带有重组DNA分子的转化细胞；,表达、鉴定外源基因的表达产物。,34,35,操作要点,提取目的基因,用密度梯度离心方法分别从供体细胞中提取所需要的DNA即目的基因和作为载体的细菌质粒或噬菌体核酸，目的基因也可通过化学方法人工合成。,处理目的基因,在从供体细胞中提取出的目的基因中加入专一性很强的限制性核酸内切酶进行处理，从而获得带有特定基因并暴露出粘性末端的DNA单链部分。必要时这种粘性末端也可用人工方法合成。,对作为载体的细菌质粒或噬菌体DNA可采用与处理目的基因同一种类的限制性核酸内切酶进行处理，使其形成并暴露出与目的基因相应的粘性末端。,36,体外重组,将上述分别处理过的目的基因和细菌质粒DNA片段（或噬菌体核酸）放在试管中，在较低温度（56）下混合“退火”。由于这两种DNA是用同一种限制性核酸内切酶进行处理，具有相同的粘性末端，因此相互之间能够形成氢键，这就是所谓“退火”。而相邻的核苷酸，在DNA连接酶的作用下也能形成磷酸二酯键，这样就完成了目的基因与质粒DNA（或噬菌体DNA）的重组，得到的是一个完整的具有复制能力的环状DNA重组体，即“杂种质粒”（或杂种噬菌体）。,37,载体传递,即通过载体将供体生物中的遗传基因导入到受体细胞内。载体必须具有自我复制的能力，一般可利用质粒的转化作用或噬菌体的转导作用，将供体基因带入受体细胞内。,复制、表达,在理想情况下，进入受体细胞内的杂种质粒（或杂种噬菌体），可通过自我复制到扩增，并使受体细胞表达出作为供体细胞所固有的部分遗传性状，成为“工程菌”。,筛选、繁殖,基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。,通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。,38,一、概述,1.菌种保藏的,目的,使微生物菌种保持原来的性状和活力不退化、不死亡、不被污染，便于研究、交换和使用。,2.,菌种保藏的原理,挑选典型培养物（typical culture）的优良纯种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。,菌种保藏的目的与原理,39,3.菌种保藏采取的,措施,低温,干燥,缺氧,避光,缺乏营养,添加保护剂：甘油、脱脂牛奶、血清白蛋白,40,二、,常用的菌种保藏方法,1,.,斜面传代保藏法,方法：接种适宜斜面培养基 培养 4保藏,措施：低温：4,适用：各大类,保藏期：16个月,用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间,2,.液体石蜡保藏法,方法：斜面或半固体接种 培养 加无菌液蜡高出培养 基1cm415保藏,措施：低温，隔氧,适用：不能利用石油的各大类,保藏期：12年,优点：简便,41,斜面菌种,冰箱保藏菌种,液体石蜡保藏的菌种,42,3,.,砂土管保藏法,方法：孢子或芽孢悬液 加入无菌砂土管中 干燥 封口 保藏,措施：无营养，缺氧，干燥,适用：产孢子（芽孢）微生物,保藏期：110年,4,.,冷冻干燥保藏,方法：菌种培养 用保护剂悬浮 加入安醅管中低温冻结（-25-40）抽真空（至0.01mmHg）真空封口 检查真空度 保藏,措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂,适用各大类,保藏期：515年或更长,43,5,.甘油管保藏法,方法：菌种培养 1530%甘油缓冲液悬浮 加入保藏管中 置-70冰箱保藏,措施：低温（-70）、保护剂（1550%甘油）,适用：细菌、酵母菌,保藏期：约10年,6,.,液氮保藏法,方法：菌种培养 保护剂悬浮 加入保藏管中 置液氮瓶中,措施：超低温（-196）、保护剂,适用：各大类,保藏期：15年,44,三、菌种保藏工艺流程,1.选择保藏方法,2.配制保藏培养基,3.接种培养,4.保藏,45,附录：,菌种保藏机构,中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM,中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC(归口中国科学院),中国科学院微生物研究所(AS),中国科学院武汉病毒研究所(AS-IV),中国农业微生物菌种保藏中心ACCC(归口中国农业科学院),中国农业科学院土壤与肥料研究所(ISF),中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会),中国食品发酵工业研究所(IFFI),46,中国医学微生物菌种保藏中心CMCC(归口卫生部),中国医学科学院皮肤病研究所(ID)，南京,卫生部药品生物制品检定所(NICPBP),中国预防医学科学院病毒研究所,中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC(国家医药管理局),中国医学科学院医药生物技术研究所,四川抗生素研究所(SIA)，四川,华北制药厂抗生素研究所(IANP),石家庄,47,中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC(归口农业部),农业部兽药监察研究所(NCIVBP),中国林业微生物菌种保藏中心CFCC(归口中国林业科学院),中国林业科学院林业研究所(RIF),48,菌种复壮,菌种的衰退,degeneration,生产性状的劣化,原有典型性状的不典型等,菌落及细胞形态的改变,生长速度缓慢,代谢产物生产能力下降,致病菌对宿主侵染力下降,抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱,49,2.,菌种衰退的原因,基因自发突变,退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程。,自发突变率,加速退化的因素,传代次数过多,不适宜的培养条件,50,3.,防止衰退的措施,（1）控制传代次数,（2）创造良好的培养条件：培养基；培养温度等,（3）利用不易衰退的细胞传代：霉菌、放线菌：无性孢子或有性孢子,（4）采用有效的菌种保藏方法,51,菌种合理传代方法之一,52,4,菌种的复壮 rejuvenation,狭义复壮,在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。,广义复壮,在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。也称,生产育种。,53,(1)纯种分离法,平板表面涂布法,平板划线分离法,琼脂培养基浇注法,用“分离小室”进行单细胞分离,用显微操纵器进行单细胞分离,用菌丝尖端切割法进行单细胞分离,菌落纯,（菌种纯）,细胞纯,（菌株纯）,纯种分离法,54,平板涂布方法,55,平板划线方法,56,(4)淘汰已衰退的个体,对,S.microflavus,“5406”农用抗生菌的分生孢子采用-10 -30的低温处理5-7天，使其死亡率达到80%左右，结果会在抗低温的存活个体中留下未退化的个体，从而达到复壮的效果,57,第三节 种子扩大培养,一、,优良种子应具备的条件,1.菌种细胞的生长,活力强,，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短。,2.菌种,生理性状稳定,，如菌丝形态、菌丝生长速率等符合要求。,58,3.,菌体浓度及总量,能满足大容量发酵罐,的要求。,4.,无杂菌污染,。,5.能保持,稳定的生产能力,。,59,二、种子扩大培养的任务和培养类型,1.任务,：,获得,大量,的,活力强,的种子，以便在发酵罐的发酵培养过程中尽可能地缩短迟滞期。,扩大培养的级数,；,放线菌（生产抗生素）三级放大，（其中链霉素须四级扩大）；细菌生长较快，用二级放大培养（斜面菌种一级种子摇床培养二级种子罐培养发酵罐）,60,种子扩大培养流程图,1、2-保藏种子 3-斜面 4-摇瓶 5-茄子瓶 6-固体培养 7、8-种子罐 9-发酵罐,61,2.培养类型,实验室种子扩大培养的方法：,液体培养法（三角瓶摇床振荡或转式培养）；,固体培养法,试管,三角瓶,茄子瓶,62,生产车间种子扩大培养的方法,园盘制曲机,A、固体培养（曲法培养）,63,B、液体培养,液体深层培养：,目前几乎所有的好气发酵均采用此法,；,64,第四节 种子质量控制,1.培养基：,选用原则,：,组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。种子培养基是培养菌体的（以,菌体增殖,为主要目的），应该是糖份少而氮源多些。,但种子罐与发酵罐培养基成分趋于一致时，可缩短发酵生产的周期，但在各成分的数量（原料配比上），应根据培养目的而定。,65,2.种龄与接种量,种龄,：种子培养时间。,一般选择对数期，缩短发酵周期。,接种量,：移入的种子液体积与接种后培养液体积比。,多数抗生素的接种量在7%-15%，有时20-25%。依据具 体的发酵类型和工艺条件而定。,3.温度：,温度直接影响生长和酶的合成；,最适温度,66,4.pH值：对微生物有明显的影响,各种微生物都有生长的最适pH。培养基pH值在发酵时要受菌体代谢的影响。,调节方法,(1),酸碱溶液中和,(2)缓冲溶液,(3)生理缓冲剂,67,5.通气搅拌,搅拌：,促进氧的溶解，营养物质与代谢产物的分散。,通气：,通气量的多少以,溶解氧,来衡定。,68,6.泡沫：,危害,：,影响微生物对氧的吸收。,消泡方法：,（1）消泡剂：天然动植物油、石油化工矿物油；改性油，表面活性剂（有机硅聚合物）；,（2）机械消泡：,（3）改变培养基成分。,69,7.染菌的控制,染菌原因,：,设备、管道、阀门漏损、发酵罐结构“死角”、,灭菌不彻底,、空气净化不好、,无菌操作不严,、菌种不纯；,70,8.种子罐级数,种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于控制，减少染菌。,71,作业,1.简述大规模工业生产常用的培养方法。,2.简述影响种子质量的主要因素。,72,