PCR、RT-PCR常见问题及分析解析讲课稿.ppt

单击此处编辑母版标题样式重庆,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,S b i o,.,t m m u.c o m.c n,1,重庆升博生物科技有限公司,PCR常见问题分析及解决方案,重庆升博生物科技有限公司,SHENGBO BIOTECH CO.,LTD.,PCR,技术的发明,1983 Kary Mullis,发明,1985,开始有文章发表,1993,获诺贝尔奖,广泛用于分子生物学研究领域,pcr动画.exe,PCR技术的基本原理,模板,DNA,的变性：,93,-,95,左右，,模板,DNA,与引物的退火,(,复性,),：,Ta=Tm-35,引物的延伸：,Taq DNA聚合酶之,5-3DNA聚合酶活性,变性,-,退火,-,延伸三个步骤,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,PCR的基本原理,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复13步,2530轮,目的DNA片段,扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链,与引物复性,DNA变性,形成2条单链,子链延伸,DNA加倍,PCR标准反应体系,DNA模板,引物,反应缓冲液,Mg,2,dNTP,耐热聚合酶,ddH,2,O,反应体系对PCR扩增的影响,DNA模板,纯度,蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应,完整性,模板降解会导致PCR扩增无产物,浓度,浓度适当,引物,设计,长度适当、避免二级结构和二聚体,合成质量,浓度,50uL,体系引物加量为,10-20 pmol,反应体系对PCR扩增的影响,反应,Buffer,pH、盐离子、稳定剂、增强剂,提供缓冲环境,Mg 2,浓度,过高非特异性严重,过低无扩增产物,dNTP Mixture,浓度适当，避免反复冻融,ddH2O,pH值适当，避免污染,反应,Buffer,pH、盐离子、稳定剂、增强剂,提供缓冲环境,Mg 2,浓度,过高非特异性严重,过低无扩增产物,dNTP Mixture,浓度适当，避免反复冻融,ddH2O,pH值适当，避免污染,反应,Buffer,pH、盐离子、稳定剂、增强剂,提供缓冲环境,Mg,2,浓度,过高非特异性严重,过低无扩增产物,dNTP Mixture,浓度适当，避免反复冻融,ddH2O,pH值适当，避免污染,如何选择最合适的DNA聚合酶,PCR用耐热DNA聚合酶,（PCR 实验的不同需求）,1 Taq酶,2 pfu酶,3 Hotstart Taq酶,Taq plus,Long Taq,Taq platinum,4 混合酶,1,Taq酶扩增效率最高,发现,1969年，美国黄石国家公园温泉,活性,5-3 DNA聚合酶活性,强,5-3 DNA外切酶活性,弱,荧光探针（定量PCR方法）,3-5 DNA外切酶活性,无,错配率每个循环约1/6000,3末端加“A”,能,产物可直接进行“TA”克隆,生产质检,诱导大肠杆菌表达、三次柱纯化，分离获得94kD重组蛋白。,无核酸酶和 细菌DNA污染,能有效扩增人基因组单拷贝基因,室温放置一周，无明显活性改变。,2 pfu酶保真度高,原理,具35核酸外切酶活性，即校正功能。,效率相对较低,3末端不加“A”，加A后才可进行TA克隆。,用途,表达基因的克隆,基因的定点突变,细胞内基因点突变分析（SNP）,3 HotStart Taq酶特异性高,热启动Taq酶,原 理,蜡封,抗体抑制,化学修饰,提高,PCR,特异性，减少甚至避免非特异性扩增,3加“A”，可直接做“TA”克隆,用 途,混杂模板,半定量、定量PCR,4 混合酶高扩增效率高保真度,Taq plus,Taq+pfu,用于复杂模板,（GC rich,二级结构）,扩增,大多数情况下可替代Taq,特别是产物在6Kb以上时，可扩10-20kb。,Long Taq,T,aq+pfu,超长片断扩增，15-40kb.,Taq platinum,HotStart+pfu,高扩增效率高保真度,根据PCR实验的不同需求,基因组扩增、RT-PCR ,特 异 性,基因突变、测序、表达克隆,保 真 性,构建基因图谱、测序等,长片段扩增,复杂模板扩增(GC含量高、二级结构),扩增效率,预配的,PCR,反应液,DNA聚合酶,反应缓冲液,dNTP,PCR增强剂,PCR MasterMix,特 点,快速简便,减少加样误差和污染,灵敏度高,可扩增低至2个拷贝的目的模板,特异性强,降低PCR反应的要求，增强特异性,稳定性好,-20一年以上，反复冻融不影响活性。,适用范围,大规模基因检测,目的基因拷贝数极低的样本,GC,含量高,有二级结构的模板,复杂基因组样本,PCR Master Mix 产品特点,PCR常见问题分析,PCR常见问题,无扩增产物,非特异性扩增或拖尾,假阳性,问题1：无,扩增产物,现象,：正对照有条带，而样品则无,M,样品A,样品B,正对照,纯度：含有抑制物,浓度：含量低,质量：全长,结构：二级结构,原因,对,策,纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板DNA,加大模板的用量,用好的反转录酶,用温度高的反转录酶,无,扩增产物之模板原因,引物错误,引物设计不好,引物降解,引物合成、纯化不好,原因,对,策,合成前检查,评价、重新设计引物,换一管新引物,免费重新合成,无,扩增产物之引物原因,退火温度,延伸时间,循环次数,原因,对,策,递度PCR,聚合酶的延伸速度,适当增加循环数,无,扩增产物之PCR条件原因,现象：,条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带,问题2：非特异性扩增,M 1 2,引物特异性差,模板或引物浓度过高,酶量过多,Mg,2+,浓度偏高,退火温度偏低,循环次数过多,原因,对,策,重新设计引物或者使用巢式PCR,适当降低模板或引物浓度,适当减少酶量,降低镁离子浓度,适当提高退火温度或使用二阶段温度法,减少循环次数,非特异性扩增,靶序列或扩增产物,的交叉污染,原因,开管轻柔，防止形成气溶胶；防止靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外,更换试剂、耗材,试剂分装，贮存适当。,更换实验室和所有试剂耗材。,问题3：假阳性,现象：,空白对照出现目的扩增产物,对策,提高PCR特异性的策略,巢式PCR（Nest-PCR）,递减PCR（TouchDown PCR）,热启动PCR（HotStart PCR）,使用PCR增强剂,四种策略,策略之一 巢式,PCR（Nest-PCR）,P,1,P,2,P,3,P,4,增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度,降低了扩增多个靶位点的可能性,提高困难PCR（如5 RACE）特异性,前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。,循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。,特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。,递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。,策略之二 递减PCR（TouchDown PCR）,热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度,通常选择热启动Taq酶,热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一,策略之三 热启动PCR,甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等,可能的机理：降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区,增强剂浓度要适当,策略之四,使用PCR增强剂,RT-PCR简介,主要内容,RT-PCR原理,RT-PCR步骤,常见问题分析,两步法RT-PCR,mRNA,5,3,AAAAAAAA,Poly(A)*尾,T T T T,Oligo(dT),Super RnaseH,-,Reverse Transcriptase,T T T T,AAAAAAAA,mRNA,cDNA,T T T T,cDNA,3,5,5,3,PCR扩增,Super RnaseH,-,Reverse Transcriptase,3,5,T T T T,cDNA,T T T T,cDNA,PCR扩增,5,3,mRNA,AAAAAAAA,Poly(A)*尾,3,5,3,5,一步法RT-PCR,两步法与一步法RT-PCR比较,两步法,一步法,引物,Oligo dT，随机引物，GSP,GSP,优点,PCR扩增失败时便于分析原因,特异性和灵敏度高,适用,检测多种目的基因,半定量RT-PCR,大量样品分析,定性,分析基因的转录水平,获取目的基因,合成cDNA探针,RT-PCR主要用途,逆转录酶的选择,AMV,：,禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42，最新版本可达60 （Bioflux公司）。,MMLV：,Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最适37，最新版本42（赛百盛）,Super RNaseH,-,Reverse Transcriptase,MMLV反转录酶的RNase H-突变体，它能将更大部分的RNA转换成cDNA，最适42。（Tiangen天根生化）,RNase H的作用,水解RNA-DNA杂合链中的RNA,Super RNaseH,-,Reverse Transcriptase,MMLV反转录酶的RNase H-突变体,逆转录效率高,RT-PCR引物的选择,随机引物,：,适用于长的或具有发卡 结构的RNA,特异性最低。起始浓度范围为20l体系50-250g。,Oligo(dT,15-18,)：,适用于具有PolyA尾巴的RNA。起始浓度范围为20l体系0.2-0.5g。,特异性引物：,与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已知的情况。起始浓度范围为20l体系1pmol。,提高RT-PCR灵敏度,分离高质量RNA,使用无RNaseH活性的逆转录酶,提高RT-PCR特异性,提高逆转录酶保温温度,减少基因组DNA污染,RT常见问题,RNA降解或起始量少,RNA含抑制成分,cDNA 5端不全,目的基因在组织中不,表达或表达量太低,原因,对,策,分离高质量的RNA,使用高温逆转录酶，如RT007（BioFlux）,使用随机引物或GSP,尝试其它组织,问题1：RT-PCR没有产物,PCR,RT-PCR,六种Taq和MasterMix,：,Taq、Pfu、HotStart Taq、Taq plus、Long Taq、Taq Platinum,dNTP,引物,SP6,Tn7,M13,Super RNase H,-,Reverse Transcriptase,TA 克隆系统：,pBS-T 载体、连接和克隆试剂盒,pGM-T 载体、连接和克隆试剂盒,pCF-T、pCF-Blunt 载体、快速连接试剂盒,感受态细胞,DNA Marker：,22种不同大小的分子量标准,TIANGEN相关产品,PCR引物设计,引物的重要性,引物设计是PCR成功的关键。,PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。,引物设计需要一定的经验，不能单纯依赖软件。,引物设计一般原则：,长度,引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但长片段扩增时，引物长度30-35 bp。,引物过短易引起错配现象。,例：一个12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点，而20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.,较长的引物（28-35bp)，还常用来区分同源性较高的模板序列或者用于产生一些突变位点。,引物设计一般原则：,结构,尽量避免引物序列形成发夹，特别是3端。,尽量避免引物间形成二聚体、特别是3端前3个碱基间不能有二聚体。,避开局部富含GC或AT，3端避开连续同样的碱基，如GGG，CCC和AT rich.,引物设计一般原则：,错配,尽量避免引物在模板上有错配位点,3端尤其不要形成非特异性结合。,无法避免错配时，最好不要有产物生成。,引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。,引物设计一般原则:,GC含量,引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。,上下游引物的GC含量不能相差太大。,不同的算法推荐45-55%或50-60%,引物设计软件,Primer Premier5.0（自动搜索）*,Oligo6（引物评价）,Vector NTI Suit,DNAsis,Omiga,DNAstar,Primer3 （在线服务）,Primer premier5.0使用简介,主要功能:,1、引物设计,2、限制性内切酶位点分析,3、DNA基元(motif)查找,4、同源性分析,Primer premier5.0使用简介,引物设计最常用软件,引物序列自动搜索功能最强大,简单易用,可用于设计简并引物,Primer premier5.0使用简介,Primer Premier5.0下载、安装。,主页之下载中心,Primer Premier5.0使用演示,Primer premier5.0使用简介,Primer Premier5.0使用步聚：,粘贴序列:,复制序列FileNewDNA SequenceCtrl+V,选AS is,PrimerSerch设置引物参数OK,搜索完成再点OK，选择合要求的引物序列。,Blast检查引物特异性，必要时重新设计。,Primer premier5.0使用简介,Primer Premier5.0评价引物方法,粘贴序列:,复制序列FileNewDNA SequenceCtrl+V,选AS is,PrimerSEdit Primer Ctrl+VAnalyzePrimerOK,PrimerAEdit Primer Ctrl+VAnalyzePrimerOK,免费引物设计服务,升博提供免费引物设计服务,免费引物设计服务注意事项,客户提供明确的序列,客户明确引物设计要求,设计报告以PDF文件提供，打开密码为升博网址。,确认合成请再发序列至升博邮箱:,sbio1999,Primer Premier使用实例,Human actin-beta Primer设计演示,致谢,Thank you for your attention!,谢谢你的关注！,