肌糖原的酵解.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,肌糖原的酵解,实验研讨,01,实验内容,肌肉糜的糖酵解,乳酸的测定,02,结果和分析,03,课后研讨题,04 心得与体会,PPT主要内容提要：,实验内容,肌肉糜的糖酵解,（1）取4支试管编号，加入新鲜,肌肉糜,0.5g。1、2管为样品管，,3、4管为对照管,。向3、4对照管内加入15%的,偏磷酸溶液,3m,L,，用玻璃棒将肌肉碎块,打,散搅匀，以沉淀蛋白质、终止酶的反应。,（2）4支试管中分别加入3m,L,pH 7.4的磷酸缓冲液,和1m,L,0.5%淀粉,，用玻璃棒,充分搅匀,。再加入1m,L,/管,液体石蜡,，以隔绝空气。将4支试管同时放入,37,恒温水浴中保温,1小时,。,（3）取出试管，立即向1、2号试管内加入15%,偏磷酸液3m,L,并混匀。将各试管内容物分别,过滤,，弃去沉淀。,（4）量取每个样品的滤液4m,L,分别加入已编号的试管中，然后每管内加入,饱和的硫酸铜液,1m,L,，混匀，再加入0.4g,氢氧化钙粉末,，用玻璃棒充分搅匀，放置,30min,，并不时搅动内容物，使糖沉淀完全。将每个样品分别过滤，弃去沉淀。,实验内容,乳酸的测定,（1）取4支,洁净、干燥,的试管，编号。各加入,浓硫酸,1.5m,L,和3滴对羟基联苯,试剂（每滴大小要一致），混匀后放入,冰浴中冷却,。,（2）将每个,样品的滤液,0.25m,L,逐滴加入到已冷却的上述混合液中，随加随摇动冰浴中的试管，,注意冷却,（注意加对羟基联苯和滤液时避免滴到试管壁上）,（3）将各试管混合均匀，放入沸腾的水浴中待显色后即取出，比较和记录各管溶液的颜色深浅，并加以解释。,结果和分析,实验结果：,左一（样品1）：呈现紫罗兰色，颜色较浅,左二（样品2）：呈现紫罗兰色，颜色较深,左三（空白1）：呈现深黄色,左四（空白2）：呈现浅黄色,结果分析：,左一（样品1）：乳酸可以与硫酸共热便成乙醛，后者再与对羟基联苯反应生成紫罗兰色物质,可能因淀粉或蛋白质处理不彻底，影响了其显色效果。,左二（样品2）：乳酸可以与硫酸共热便成乙醛，后者再与对羟基联苯反应生成紫罗兰色物质。,左三（空白1）：在加入三氯乙酸后，没有完全震荡，肌肉糜中的酶没有与三氯乙酸完全反应，导致其后加入的淀粉发生酵解反应，最终生成少量乙醛与显色液发生反应；另外在肌肉糜中本身含有糖类，在未加入三氯乙酸之前反映了一部分，生成部分乳酸。,左四（空白2）：分析同上,课后研讨题,1.本实验在37 保温前不加液体石蜡是否可以？为什么？,不可以，肌糖原的酵解实验最后是测量乳酸的含量，而乳酸的产生是在无氧条件下产生的。糖酵解是糖原在细胞溶胶中经过一系列酶反应生成丙酮酸，在无氧条件下转换为乳酸；若有氧存在，丙酮酸会进入线粒体，在酶催化条件下最终生成水和CO2,2.本实验如何检验糖酵解作用？,糖酵解作用最后由乳酸的生成来观察，在除去蛋白质和糖后，乳酸和浓硫酸共热变成乙醛，后者再与对羟基联苯反应生成紫红色物质，根据颜色的显色加以鉴定。,3.在乳酸测定过程中，为什么先要进行冰浴并随时冷却？,浓硫酸接触有水的试剂后会放出大量热，冰浴可以吸收浓硫酸放出的热量。,4.在本实验中，怎样做才可以尽可能减小实验误差得出理想结果？,实验过程中蛋白质和糖对实验的影响很大，在实验前要把实验所用的试管洗干净，在实验糖酵解过程中要在无氧条件下进行。,5.阐述分析糖酵解作用在糖代谢过程中的地位及生理意义,理情况下，大多数组织有足够的氧以供有氧氧化之需，很少进行糖酵解，因此这一代谢途径供能意义不大，但少数组织，如视网膜、睾丸、肾髓质和红细胞等组织细胞，即使在有氧条件下，仍需从糖酵解获得能量。在某些情况下，糖酵解有特殊的生理意义。例如剧烈运动时，能量需求增加，糖分解加速，此时即使呼吸和循环加快以增加氧的供应量，仍不能满足体内糖完全氧化所需要的能量，这时肌肉处于相对缺氧状态，必须通过糖酵解过程，以补充所需的能量。在剧烈运动后，可见血中乳酸浓度成倍地升高，这是糖酵解加强的结果。又如人们从平原地区进入高原的初期，由于缺氧，组织细胞也往往通过增强糖酵解获得能量。在某些病理情况下，如严重贫血、大量失血、呼吸障碍、肿瘤组织等组织细胞也需通过糖酵解来获取能量。倘若糖酵解过度，可因乳酸产生过多，而导致酸中毒。,5.,总结本实验操作的关键环节和注意事项。,实验成功的两个关键步骤：,（1）向空白管加入30%三氯乙酸。30%三氯乙酸的作用是使肌肉糜失活，这一步一定要保证肌肉糜完全失去活性，以增强最终显色的比色效果，判定肌肉糜失活的标识是肌肉糜呈惨白色，无血色。,（2）加入饱和CuSO4和Ca(OH)2粉末。加入饱和CuSO4和Ca(OH)2粉末的作用是去除反应体系中的糖和蛋白质，对羟基联苯反应非常敏感，若体系中含有糖和蛋白质，可能会对以后的颜色鉴别产生影响，因此这步非常关键。,注意事项：,（1）30%三氯乙酸的作用是使肌肉糜失活(即肌肉糜中的蛋白失活)，因此在用30%三氯乙酸处理空白管中的肌肉糜时，一定要充分，直至肌肉变为惨白色为止，在处理过程中，可使用玻璃棒不断搅捻肌肉糜，使其充分接触三氯乙酸，以使肌肉糜完全失活。,（2）加液体石蜡目的是隔绝空气，给反应体系创造无氧环境，加入的石蜡不用太多，刚好把口封住最佳。,（3）37度保温时间1-1.5h，可通过前期的预实验确定最佳保温时间。,（4）在加入饱和CuSO4之前需将肌肉糜挑出。,（5）加入饱和CuSO4和Ca(OH)2粉末的作用是去除反应体系中的糖和蛋白质，加入饱和CuSO4和Ca(OH)2粉末如一定要充分震荡10min，使CuSO4、Ca(OH)2和反应体系充分接触，完全去除多余的糖和蛋白质。,（6）乳糖的测定中，在加入样品滤液和对羟基联苯时，一定不要加到壁上，否则会对结果造成干扰。,心得与体会,1.在碾碎肌肉糜时，要注意玻璃棒不要硬捅试管底部，而是挤压试管壁。,2.空白组加完三氯乙酸后，不要急着加磷酸缓冲液，而是不断用玻璃棒搅动肌肉糜，使肌肉糜完全失去血色，变为白色为止，即熟肉的颜色一样，此步骤是本实验的关键所在，要是没有使空白组中的酶没有完全失活，则空白组中也会发生酵解作用，所以会使最后的空白组有颜色。,3.加入淀粉溶液的目的是增加第五浓度，使酵解左右明显，从而使实验结果明显。,4.实验中加入石蜡的目的是为了产生无氧环境，从而使酵解左右得以正常进行，否则在有氧条件下会进行有氧呼吸，不产生乳酸。,5.实验中加入饱和硫酸铜溶液的目的是为了除去糖，加氢氧化钙的目的是为了让蛋白质变质，原因是糖类和蛋白质会影响最乳酸的显色反应，此步骤也是实验的关键，加入这两样东西后，一定要充分振荡，除去糖类和蛋白质的影响。,6.用于检验乳酸产物的四只试管必须是干燥洁净的，否则可能会混入糖类或蛋白质对最后结果产生影响,7.乳糖的测定中，在加入样品滤液和对羟基联苯时，一定不要加到壁上，否则会对结果造成干扰。,8.注意一些金属离子、PH、温度等对组织中酶类的影响作用，要尽量排除组织中未知物质的干扰作用以及空气中氧气、二氧化碳及环境中其他因素的影响。,谢谢观赏,