基因工程的基本操作步骤复习进程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的基本操作步骤,基因工程的基本操作程序,一、目的基因的获取,二、基因表达载体的构建,三、将目的基因导入受体细胞,四、目的基因的检测与鉴定,主要是指,编码蛋白质,的基因,(,一）目的基因,目前被广泛提取使用的目的基因有：,苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因,（抗病毒、抗细菌,),、,人胰岛素基因,等。,一、目的基因的获取,（二）获取目的基因的方法,1,、从基因文库中直接获取,2,、,PCR,技术扩增,3,、化学方法直接人工合成,1,、从基因文库中直接获取,（,1,）基因文库的概念,部分基因文库：,基因组DNA,文库：,将含有某种生物,不同,基因的许多,DNA,片断，导入到受体菌的,群体,中，,各个受体菌,分别含有这种生物的,不同基因,，称为基因文库,含有一种生物的,全部,基因,只包含了一种生物的,部分基因,，如,:cDNA,文库,（,2,）,基因文库的建立方法,提取某种生物的全部,DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的,DNA,片段,将,DNA,片段与运载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,方法一：直接分离法,某种生物的单链,mRNA,单链互补,DNA,双链,cDNA,片段,导入受体菌中储存,与运载体连接,cDNA,文库,反（逆）转录酶,DNA,聚合酶,方法二：反转录法,-cDNA,的合成流程图解,PCR,技术,多聚酶链式反应,PCR,扩增仪,DNA,半保留复制的基本原理,一段已知目的基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定,DNA,聚合酶,(Taq,酶）,模板,DNA,2,、利用,PCR,技术扩增目的基因,原理：,前提：,条件：,利用,PCR,技术扩增目的基因,5,3,G,G,T,C,3,5,A,G,C,C,5,3,引物,G,G,高温变性,低温退火,中温延伸,1.,目的基因,DNA,受热变性，解链；,5,3,A,G,引物,2.,引物与单链互补结合；,3.,合成链在,DNA,聚合酶作用下进行延伸。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,3,、,人工合成,核心,二、基因表达载体的构建,功能,：,使目的基因进入受体细胞并有效表达，而且要能稳定存在且遗传给后代。,基因表达载体的构建,1,）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。,2,）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。,3,）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量,DNA,连接酶，形成了一个重组,DNA,分子（重组质粒）,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,编码区,非编码区,非编码区,启动子,启动子：,位于基因首端一段能与,RNA,聚合酶,结合并能起始,mRNA,合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。,RNA,聚合酶,:,能够识别,启动子上的结合位点,并与其结合的一种蛋白质,.,终止子：,位于基因的尾端的一段特殊的,DNA,片断，它能阻碍,RNA,聚合酶的移动，并使其从,DNA,模板链上脱离下来，使转录终止。,终止子,编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,A G G T C A C G T C G,T C C A G T G C A G C,RNA,聚合酶,A G G U C A C G U C G,基因表达载体的组成：,b,、目的基因,a,、启动子,c,、终止子,d,、标记基因,e,、复制原点,1,、,下列属于获取目的基因的方法的是,利用,mRNA,反转录形成,从基因组文库中提取,从受体细胞中提取,利用,PCR,技术,利用,DNA,转录,人工合成,A.B.,C.D.,小试牛刀,2,、,1997,年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的,DNA,分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。请据右下图回答问题。,(1),此图表示的是采取,_,合成基因的方法获取,_,基因的过程。,(2),图中,DNA,是以为,_ _,模板，形成单链,DNA,，在酶的作用下合成双链,DNA,，从而获得了所需要的目的基因。,人工,目的,控制胰岛素合成的信使,RNA,小试牛刀,(3),图中代表,，,它往往含,基因，以便对,目的基因的检测。,重组,DNA,分子,标记,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴,细菌或病毒侵染细胞,的途径。,三、目的基因导入受体细胞,将目的基因导入植物细胞的方法,1,、农杆菌转化法,2,、基因枪法,3,、花粉管通道法,土壤农杆菌转化法示意图,将目的基因导入动物细胞的方法,显微注射法,将目的基因导入微生物细胞方法,宿主细胞（大肠杆菌）,感受态细胞,（大肠杆菌）,Ca,2+,四、目的基因的检测与鉴定,首先：,其次：,最后：,还要：,要检测转基因生物的,DNA,上是否插入目的基因,DNA,分子杂交技术 分子探针,检测目的基因是否转录出,mRNA,检测目的基因是否翻译出蛋白质,个体生物学水平的鉴定,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了,表达,。,受体细胞摄入,DNA,分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行,修饰,。,多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,3,（,2010,江苏高考，,27,题，,8,分,）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图,l,、图,2,中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：,（,1,）一个图,1,所示的质粒分子经,Sma,切割前后，分别含有,个游离的磷酸基团。,0,、,2,（,2,）若对图中质粒进行改造，插入的,Sma,酶切位点越多，质粒的热稳定性越,。,（,3,）用图中的质粒和外源,DNA,构建重组质粒，不能使用,Sma,切割，原因是,。,（,4,）与只使用,EcoR I,相比较，使用,BamH,和,Hind,两种限制酶同时处理质粒、外源,DNA,的优点在于可以防止,。,（,5,）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入,酶。,（,6,）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了,。,（,7,）为了从,cDNA,文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在,的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。,高,Sma,破坏质粒上的抗性基因和外源,DNA,中的目的基因,质粒和含目的基因的外源,DNA,片段自身环化,DNA,连接,鉴别和筛选含有目的基因的细胞,蔗糖为唯一含碳营养物质,此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢,