培养材料消毒和接种专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一、试验目标,1、掌握植物组织培养中无菌操作技术,2、掌握植物外植体表面消毒常规方法,培养材料消毒和接种专家讲座,第1页,操作前准备工作,接种室在接种前4-5 d必须通风换气。在接种前一天对接种室进行全方面消毒，普通用40%福尔马林进行全方面喷雾，并密闭24 h，然后打开换气窗10-15 min.。,培养材料消毒和接种专家讲座,第2页,A:试验器具和材料准备B:用75%酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台面上用具不要放置太多或重合放置，以免降低灭菌效果。C:关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有尤其情况，尽可能不要下工作台）,培养材料消毒和接种专家讲座,第3页,D:用7075乙醇消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：全部操作应在火焰近处并经过灼烧进行。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。,培养材料消毒和接种专家讲座,第4页,接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中,错,误,培养材料消毒和接种专家讲座,第5页,整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要快速,正,确,错,误,培养材料消毒和接种专家讲座,第6页,接种过程中尽可能到达悬空要求,预防操作带来污染,正,确,错,误,培养材料消毒和接种专家讲座,第7页,培养器材清洗与灭菌,在细胞工程试验中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。毒性物质包含解体微生物和细胞残余物以及非营养化学物质。一些化学物质仅0.01g/L就会对细胞产生毒性作用，所以对培养器皿清洗是组织培养中一项极为主要步骤。,培养材料消毒和接种专家讲座,第8页,A、新购置玻璃仪器表面常附着有游离碱性物质，可先用0.5去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在12盐酸溶液中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最终用无离子水冲洗两次，在100120烘箱内烘干备用。,培养材料消毒和接种专家讲座,第9页,B、使用过玻璃仪器清洗 先用自来水洗刷至无污物，再用适当毛刷沾去污剂（粉）洗刷，然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用。,清洗后器皿内外不可挂有水珠，不然重洗.,C、金属用具洗涤 金属用具普通不宜用各种洗涤液洗涤（新能够用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，普通用酒精擦洗，然后火焰干燥,培养材料消毒和接种专家讲座,第10页,（1）干热灭菌适合用于玻璃器皿和金属器械灭菌。操作方法：150、40min,（2）湿热灭菌适合用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。121 维持2030min,培养材料消毒和接种专家讲座,第11页,（3）过滤灭菌,培养基中一些成份碰到高温分解（如一些生长调整剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。,灭菌方法：将生长调整剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至50左右时，加入适量激素。,培养材料消毒和接种专家讲座,第12页,（4）射线灭菌主要是利用紫外灯进行照射，适合试验室空气、操作台等，灭菌时间20-30min。注意：关灯后5min后再进入。超净工作台关灯后要打开风机、,（5）火焰灼烧灭菌用火焰灼烧到达灭菌目标，适合用于接种器皿灭菌。,培养材料消毒和接种专家讲座,第13页,（6）消毒剂,适用外植体、试验器皿、操作表面、皮肤等。几个惯用消毒剂效果比较,消 毒 剂,使用浓度),消毒时间(min.),效 果,残液去除难易,乙醇,70-75,0.1-3,好,易,新洁尔灭,1020,530,好,易,氯化汞,0.11,215,最好,最难,过氧化氢,1012,515,很好,最易,抗菌素,450mgl,-1,3060,很好,较难,次氯酸钙/纳,9 10,530,好,易,培养材料消毒和接种专家讲座,第14页,二、试验原理,用于进行组织培养组织、器官和细胞称为外植体。在组织培养中，外植体假如是带菌，在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养成功最基本和主要前提。惯用消毒剂对外植体进行消毒。从室外取材料，普通先用自来水冲洗数分钟.,培养材料消毒和接种专家讲座,第15页,接种材料使用消毒剂后，要用无菌水洗涤35 遍，最终用无菌纸擦洁净。使用消毒剂标准是既要到达消毒目标，又不能损伤植物组织和细胞，还要符合就地取材标准。对一些轻易污染、较难灭菌外植体进行表面消毒时，用单一消毒剂不能收到好效果，所以常选取两种消毒剂交替浸泡法。,培养材料消毒和接种专家讲座,第16页,普通，首先用75乙醇浸泡外植体数秒钟至30s，然后置于0.1氯化汞溶液510min 或含有2活性氧次氯酸钠溶液530min，然后用无菌水洗涤。有时在氯化汞或次氯酸钠灭菌后，用无菌水洗，深入剥去几层组织或器官如叶片后，再用次氯酸钠灭菌35min，无菌水漂洗3 次后，切割、用于接种。消毒溶液对外植体消毒是在超净工作台上进行。完成表面消毒接种材料要尽快放置于培养基中。,培养材料消毒和接种专家讲座,第17页,三、试验材料,器材：,超净工作台、镊子、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿。,药品及材料：,0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、绿豆种子、培养基。,培养材料消毒和接种专家讲座,第18页,四、试验步骤,（1）准备好培养基，无菌水，培养皿及接种工具。,（2）将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，打开超净台紫外灯开关，照射最少20分钟，关闭台内紫外灯，通风五分钟后，再开日光灯进行无菌操作。,（3）接种前用肥皂洗手，尤其是将手指洗净，然后用沾有75%酒精棉球把手消毒一次。,（4）将绿豆种子在流水下冲洗洁净。培养材料消毒和接种专家讲座,第19页,（5）将种子放于广口瓶中，用75%酒精溶液浸泡30s，无菌水冲洗，然后用0.1%升汞溶液浸泡3、5、10min，期间不停摇动溶液，用无菌水洗涤5遍待用。,（6）取出培养皿，有必要话能够用沾有75%酒精棉球把皿表面擦一下。,培养材料消毒和接种专家讲座,第20页,（7）接种用镊子使用前插入95%乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上烧片刻，冷却后待用。也能够插入培养基边缘促使其冷却。,培养材料消毒和接种专家讲座,第21页,（8）在酒精灯火焰旁揭去培养皿封口膜，在靠近火焰处，右手用灭菌镊子夹取绿豆种子，将其放在培养基上，用镊子轻轻按一下，使其部分浸入培养基。每瓶可放8-12个外植体。,（9）封上封口膜，标上接种日期、材料名称、姓名等，将接种材料移到培养室培养。,培养材料消毒和接种专家讲座,第22页,培养材料消毒和接种专家讲座,第23页,五、作业,1、观察接种后25天污染情况，填入下表,接种日期,接种数,污染数,污染率,主要污染菌种,2、在接种过程中，经过哪些办法来预防细菌对接种,工具，接种材料污染？,培养材料消毒和接种专家讲座,第24页,