有机溶剂残留量的测定演示教学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,有机溶剂残留量的测定2015,国内外主要相关指导原则和文件,ICH Q3c,杂质：残留溶剂的指导原则,FDA,：,Guidence for Industry:Q3c Impurities:Residual Solvents,EMEA:Position Paper on Specification fro Class 1 and Class 2 Residual Solvents in Active Substances,化学药物有机溶剂残留量研究技术指导原则,国内研究现状：越来越重视，但仍存在很多不规范之处原因：时间短、经验少、对本质认识不够，对国际新研究结果跟踪不及时，对已有指导原则内涵领会不深刻,本讲目标：通过分析和总结，明确一些问题，使研究更科学、更规范。,各国药典中残留溶剂测定收载情况,USP35,版,Chemical Tests/Residual Solvents 185,EP7.0,版,2.4.24.Identification and control of residual solvents,ChP2010,年版,附录,P,残留溶剂测定法,以上药典方法是残留溶剂研究的重要参考依据,ICH,指导原则,人用药品注册技术要求国际协调会议,(International Conference of Harmonizition ICH),ICH,将药品生产及纯化过程中常用的,69,种有,机溶剂按照对人体和环境的危害程度分为,4,类。,残留溶剂分类,第,1,类溶剂,:,指已知可以致癌并被强烈怀疑对人和环境有害的溶剂,其残留量必须控制在规定的范围内,;,第,2,类溶剂,:,指无基因毒性但有动物致癌性的溶剂,;,第,3,类溶剂,:,指对人体低毒的溶剂。在无需论证的情况下,残留溶剂的量不高于,0.5%,是可接受的,但高于此值则须证明其合理性,;,第,4,类,:,尚无足够毒理学资料的溶剂。,有机溶剂的分类,类别,毒性,PDE,（,mg/,天）,第一类溶剂,人体致癌物、疑为人体致癌物或环境危害物,0.1,以下,(1,1,1),三氯乙烷除外,第二类溶剂,有非遗传致癌毒性或其他不可逆毒性、或其他严重的可逆,毒性,0.5-50,第三类溶剂,对人体低毒,50,第四类溶剂,没有足够毒性资料,限度的制定,残留量表示方法：浓度限度,计算公式：,浓度限度（,%,）,PDE/(1000,剂量,),100%,其中：,PDE,：,mg/,天,剂量：一般为,10g/,天,质量标准的制订和修订,PDE,、浓度限度的比较,PDE,值：绝对值，控制精确，但可能忽略多种溶剂的综合影响。,浓度限度：以,PDE,为基础，并采用比较大的每天给药量计算，给出了一个比较大的安全系数。,目前情况下，采用浓度限度比较简便，而且只要日摄入总量不超过,10g,，就无需进一步计算。,药物中有机溶剂的引入,研究对象：原料药,/,辅料、制剂,原料药,/,辅料：合成过程中引入,包括：,作为合成原料或反应溶剂引入,作为反应副产物引入,由其他合成原料或其他溶剂带入,制剂,各种成份（原料药、辅料）带入,制剂制备过程中引入,制剂制备过程中引入（缓、控释微丸包衣过程使用,有机溶剂；难溶性药物固体分散）,他克莫司溶于无水乙醇和二氯甲烷中分散,。,药物中有机溶剂的引入,研究集中在：原料药的第一种情况,影响因素：,有机溶剂在合成过程中使用的步骤,后续溶剂的影响,中间体的影响,其他（如副反应等）,有机溶剂的使用和残留与合成工艺密不可分，是评价合成工艺优劣，筛选、确定合成工艺的重要因素之一。,药物中有机溶剂的引入,第一类溶剂,原则：考虑其毒性，建议尽量避免使用。,当合成路线涉及此类溶剂时,合成化学发展水平,判断使用是否合理,合理,不合理,严格控制残留量,替代研究,临床研究前,临床研究期间,产品上市后,确定何种溶剂需进行研究的原则,意义和目的,保障临床用药安全，控制产品质量,与其他方面研究工作密不可分,进一步验证工艺控制的合理性,为确定合理可行的质量标准提供数据支持,思考的出发点,有机溶剂的毒性,产品的合成工艺,确定何种溶剂需进行研究的原则,EMEA,第一类溶剂：不宜使用。一旦作为起始原料、溶剂，或者反应副产物，或者由其他溶剂带入时，残留量需符合,ICH,相关规定。,残留量控制方法：随引入情况不同而不同,直接控制终端产品,控制中间体,控制引入第一类溶剂的物质,确定何种溶剂需进行研究的原则,EMEA,第二类溶剂：可直接对终产品进行控制，可对中间体进行控制，结果需符合,ICH,相关规定,当,6,批试生产规模或者,3,批生产规模的中间体检测结果显示残留量低于,ICH,规定限度的十分之一时，可不对终产品进行控制。,确定何种溶剂需进行研究的原则,研究原则：,考虑到各类有机溶剂有毒性和在终产品中残留的可能性，建议：,第一类溶剂：无论任何步骤使用，均需进行检测,第二类溶剂：无论任何步骤使用，均需进行检测,第三类溶剂：建议可仅对用于终产品精制的此类溶剂进行研究。,确定何种溶剂需进行研究的原则,研究原则：,第四类溶剂,若结构与毒性大的溶剂非常接近，建议尽量不使用,注意中间体的处理，尽量除尽,根据结构和理化性质，参考其他的有机溶剂的检测方法进行检测和控制,注意检测图谱中未知峰的情况，尽量进行归属，若无法归属，可以控制挥发性杂质总量。,若国家标准中未控制残留溶剂，建议根据起始原料的制备工艺，对可能存在的残留溶剂一并在终产品中进行控制。,如果采用尚未批准的原料药、化工中间体等作为起始原料，建议根据起始原料的制备工艺，对可能存在的残留溶剂一并在终产品中进行控制。,9,质量标准建立,附录中无限度规定和未收载的有机溶剂,:,如在药物的制备过程中使用到了这类溶剂，,建议药物研发者尽量检索有关的毒性等研,究资料，关注其对临床用药安全性和药物,质量的影响。,表,1,药品中常见的残留溶剂及限度,第一类溶剂（应该避免使用）,溶剂名称 英文名 限度（,ppm),苯,Benzene 2,四氯化碳,Carbon tetrachloride4,1,，,2,二氯乙烷,1,2-Dicloroethane 5,1,，,1-,二氯乙烯,1,1-Dichloroethene 8,1,，,1,，,1,三氯乙烷,1,1,1-Trichloroethane 1500,第二类溶剂（应该限制使用）,溶剂名称英文名浓度限度（,ppm),乙腈,Acetonitrile410,氯苯,Chlorobenzene360,氯仿,Chloroform60,环己烷,Cyclohexane3880,1,，,2,二氯乙烯,1,2-Dichloroethene1870,二氯甲烷,Dichloromethane600,1,，,2,二甲氧基乙烷,1,2-Dimethoxyethane 100,第二类溶剂（应该限制使用）,N,N,-,二甲氧基乙酰胺,N,N-Dimethylacetamide1090,N,N,-,二甲氧基甲酰胺,N,N-Dimethylformamide880,1,，,4,二氧六环,1,4-Dioxane380,2,乙氧基乙醇,2-Ethoxyethanol160,乙二醇,Ethyleneglycol62,甲酰胺,Formamide220,正己烷,Hexane290,甲醇,Methanol3000,2,甲氧基乙醇,2-Methoxyethanol50,甲基丁基酮,Methylbutyl ketone50,甲基环己烷,Methylcyclohexane1180,第二类溶剂（应该限制使用）,N-,甲基吡咯烷酮,N-Methylpyrrolidone4840,硝基甲烷,Nitromethane50,吡啶,Pyridine200,四氢噻砜,Sulfolane160,四氢化萘,Tetralin100,四氢呋喃,Tetrahydrofuran720,甲苯,Toluene890,1,，,1,，,2,三氯乙烯,1,1,2-Trichloroethene80,二甲苯,Xylene2170,通常含有,60,间二甲苯，,14,对二甲苯，,9,邻二甲苯和,17,乙苯,第三类溶剂（,GMP,或其它质控要求限制使用）,溶剂名称英文名浓度限度（,ppm),乙酸,Acetic acid5000,丙酮,Acetone5000,甲氧基苯,Anisole5000,正丁醇,1-Butanol5000,仲丁醇,2-Butanol5000,乙酸丁酯,Butyl acetate5000,叔丁基甲基醚,tert-Butylmethyl ether5000,异丙基苯,Cumene5000,二甲亚砜,Dimethyl sulfoxide5000,乙醇,Ethanol5000,乙酸乙酯,Ethyl acetate5000,乙醚,Ethyl ether5000,甲酸乙酯,Ethyl formate5000,第三类溶剂（,GMP,或其它质控要求限制使用）,甲酸,Formic acid5000,正庚烷,Heptane5000,乙酸异丁酯,Isobutyl acetate5000,乙酸异丙酯,Isopropyl acetate5000,乙酸甲酯,Methyl acetate5000,3,甲基,1,丁醇,3-Methyl-1-butanol5000,丁酮,Methylethyl ketone5000,甲基异丁基酮,Methylidobutyl ketone5000,异丁醇,2-Methyl-1-propanol5000,正戊烷,Pentane5000,正戊醇,1-Pentanol5000,正丙醇,1-Propanol5000,异丙醇,2-Propanol5000,乙酸丙酯,Propyl acetate5000,第四类溶剂（尚无足够毒理学资料）,溶剂名称英文名,1,，,1,二乙氧基丙烷,1,，,1,Diethoxypropane,1,，,1,二甲氧基甲烷,1,1-Dimethoxymethane,2,，,2,二甲氧基丙烷,2,2-Dimethoxypropane,异辛烷,Isooctane,异丙醚,Isopropyl ether,甲基异丙基酮,Methylisopropyl ketone,甲基四氢呋喃,Methyltetrahydrofuran,石油醚,Petroleum ether,三氯乙酸,Trichloroacetic acid,三氟乙酸,Trifluoroacetic acid,残留溶剂测定方法,干燥失重：专属性差,GC,法,(,普通,),：首选方法,顶空进样法,直接进样法,HPLC,法：例如测定吡啶,离子色谱法：测定,N-,甲基吡咯烷酮,气质联用,有机溶剂残留量测定方法分类,1.,直接进样法,适用范围：,沸点高溶剂或受热不易分解样品。,优点：,简便、无需专用设备绝对进样量大。,缺点：,污染进样口及柱子，溶剂峰响应大，样品分解产物或溶剂杂质峰可能影响测定，对溶剂的纯度要求高。,2.,顶空进样法（,Headspace Analysis),2.1,静态顶空技术,2.2,动态顶空技术（吹扫捕集法）,适用范围：,沸点低溶剂或样品本身对测定有影响。,优点：,在较低温度下进行，避免组分分解；减少溶解 样品的溶剂量和样品本身对色谱系统的干扰和污染，增加色谱柱的寿命。,缺点：,需要特定的顶空进样装置，成本较高，对沸点较高的溶剂检测灵敏度不够，一般多应用于沸点,100,以下的溶剂。,顶空进样法的原理,顶空分析是通过样品基质上方的气体成分来测定这些组分在原样品中的含量。这是一种间接的分析方法，其基本理论是在一定条件下气相和凝聚相（液相或固相）之间存在着分配平衡。所以气相的组成能反映凝聚相的组成。,当样品的蒸气压相当低时，色谱峰面积,(A,i,),与挥发性组分（,i,）的蒸气压（,Pi),成正比,A,i,=C,i,P,i,C,i,与物质种类及检测器有关的特定常数。,对于理想混合体系，依据拉乌尔定律：,P,i,=,i,P,0,i,X,i,P,0,i,为纯组分（,i,）的蒸气压,，,X,i,为组分（,i,）的摩尔分数,i,组分的活度系数,。,服从拉乌尔定律的混合体系，其峰面积与浓度成线性关系。但在高浓度区域内分压的变化与浓度变化不成线性关系，有时甚至与浓度无关。如果不注意这一点，顶空分析会得到错误的结果。,因此分析中定量校正尤为重要。在很多情况下，样品溶液若能充分稀释，则能使其接近理想体系，服从拉乌尔定律。,顶空进样法的特点,、样品不需要前处理，它只取气相部分进行分析，大大减少了样品基质对分析的干扰。,、进样量大，灵敏度高，可用于痕量有机挥发性物质的测定。,、对于易挥发或易分解和无法直接进样分析的液体或固体样品而言，更有它的实用价值。除分析中草药中挥发性成分外，还常用于固体药物、包装材料、药物的残留溶剂分析,顶空分析可以看成是一种气相萃取方法，即用气体作“溶剂”来萃取样品中的挥发性成分，因而顶空分析就是一种理想的样品净化方法。,传统的液液萃取及,SPE都是将样品溶解在液体中，不可避免地会有一些共萃取物干扰分析。,静态顶空分析装置,手动进样装置,采用手动进样时，所需设备简单，只要有一个控温精确的恒温槽和顶空瓶。,将装有样品的顶空瓶置于恒温槽中，在一定的温度下达到平衡后，就可用注射器从容器中抽取顶空气体，注入,GC,进行分析。,手动进样的的两个缺点,1.,压力控制难以实现。,2.,温度的控制，注射器的温度低时，某些沸点高的样品组分很容易冷凝。,由于上述原因，手动进样的准确度差，分析重现性难以保证。,在只作定性分析时，手动进样不失为一种经济的方法，要作精确的定量分析最好用自动顶空进样装置。,自动顶空进样装置,自动顶空进样装置,顶空进样器工作原理影响顶空分析的因素,1.,样品的性质,顶空气体中单个组分的含量既与其本身的挥发性有关，又与样品基质有关。特别是那些在样品基质中溶解度大（分配系数大）的组分，“基质效应”更为明显。,标准溶液必须有与原样品相同或相似的基质，否则，定量误差将会很大。,一些消除或减少基质效应的方法,（,1,）利用盐析作用 在水溶液中加入无机盐（如硫酸钠）来改变挥发性组分的分配系数。但当盐浓度小于,5%,时几乎没有作用，故常用高浓度的盐，甚至用饱和浓度。盐析作用对极性组分的影响大于非极性组分的影响。此外，在水溶液中加入盐之后，溶液体积会变化，定量线性范围可能变窄。,一些消除或减少基质效应的方法,（,2,）在有机溶液中加入水，当然，水要与有机溶剂相溶。这可以减少有机物在有机溶剂中的溶解度，增大其在顶空气体的含量。分析灵敏度可增加几倍数百倍。,（,3,）调节溶液的,pH,对于碱和酸，通过控制,pH,可使其解离度改变，或使其待测物的挥发性变的更大，从而有利于分析。,（,4,）样品应溶解在合适的溶剂中，一般可用水、,DMF,、,DMSO,或其混合溶剂作溶媒。,2.,样品体积,顶空瓶中的样品体积对分析结果影响很大，因为它直接决定相比,。,Cg=Co/(K+),其中,=Vg/V,L,，,K=C,L,/Cg,对于一个给定的气液平衡系统，,K,和,Co,为常数，,与顶空气体中的浓度成正比。,样品体积,V,L,增大，,减少Cg,增大，灵敏度增加。但对于具体的 样品体系，还要看,K,的大小。当,K,时，样品体积的改变对分析灵敏度影响小。当,K,时，影响就很大。,顶空分析是只从样品瓶中取样一次，每份样品体积是否重现影响分析结果。,待测组分的分配系数越小（在凝聚相中溶解度越大），样品体积波动所造成的结果误差越大；反之越小。,3.,平衡温度,样品的平衡温度与蒸气压直接相关，它影响分配系数。,温度越高，蒸气压越高，顶空气体的浓度越高，分析灵敏度越高。待测组分的沸点越低，对温度越敏感。因此，顶空分析特别适合于分析样品中的低沸点成分。,温度对顶空分析灵敏度的影响,水中溶解性越好,平衡温度越敏感。,4.,平衡时间,平衡时间取决于组分分子从样品基质到气相的扩散速度。扩散速度越快，所需时间越短。扩散系数与分子大小、介质黏度及温度有关。温度越高，黏度越低，扩散系数越大。所以，提高温度可以缩短平衡时间。,与样品瓶有关的因素,1.,样品瓶,要求体积准确，能承受一定的压力，密封性能好，对样品无吸附。,样品瓶的体积有,5,20ml,多种，具体选用那种，要根据仪器及样品情况而定。,顶空瓶若要反复使用，可用洗液浸泡，然后用蒸馏水冲洗，最后置烘箱中烘干。,2.,密封垫,密封垫的材料主要有三种：硅橡胶、丁基橡胶、氟橡胶。,硅橡胶垫耐高温、丁基橡胶垫价格低、氟橡胶垫惰性好。,为防止密封垫对样品组分的吸附，现在多用内衬聚四氟乙烯或铝的密封垫。,选用时要看分析条件（温度）和样品具体情况而定。常规分析可用价格低的,丁基橡胶垫，痕量分析则最好选用有内衬的硅橡垫胶。,顶空分析方法开发的步骤,1.,确定如何处理样品。如待测组分挥发性太低，则可用直接进样测定。考虑用何种溶剂溶解。,2.,根据待测组分确定分析条件,-,色谱柱、检测器、及操作条件。通过标准样品进样分析来优化分离条件。,3.,确定平衡时间和平衡温度。,4.,样品的分析，主要考察灵敏度是否满足要求。通过改变分流比、顶空取样条件（改变进样时间或定量管）来控制信号的大小。改变平衡温度、相比、消除基质效应以提高分析灵敏度。,5.,对测定方法进行方法学验证,线性、回收率、精密度、最低检测量,聚苯乙烯（,PS,）中单体苯乙烯的测定,2-,甲氧基乙醇作内标（,2,）,医疗设备中环氧乙烷（,EO,）的测定,环氧乙烷（,EO,）用于医疗设备的消毒，它是一种已知的致癌物质。有关法规要求用顶空法测定经消毒的医疗设备中,EO,的含量。可用标准加入法测定聚苯乙烯（,PVC,）和高密度聚乙烯（,HDPE,）制成的医疗设备经消毒后残留的,EO,。,顶空分析条件：,HP7694,自动顶空进样器，平衡温度：,100,，平衡时间：,60min,，输送管和连接管温度：,105,，瓶压：,10psi,，加压时间,0.5min,，定量管体积,1ml,，冲样时间,0.15min,，进样时间：,2.3min,多点标准加入法,两种方法的原理,方法,A,和,B,是正交处,理方法。,在两种方法中都有共流出现象，但是方法,A,中,的共流出峰在方法,B,中得到了解决，反之亦,然。,最终通过方法,C,进行定量分析。,USP,残留量测定介绍,USP:,方法,A,顶空进样器操作条件,操作参数,1,2,3,平衡温度（）,80,105,80,平衡时间（,min),60,45,45,转移管温度（）,80-90,105-115,80-90,加压时间（,s,）,60,60,60,进样体积（,ml,）,1,1,1,水溶性物质方法,A,的制备,方法,A,系统,适用性,方法,A-1,类溶,剂,方法,A-,二类溶剂，混合液,A方法,A-,二类溶剂，混合液,B,方法,A-3,类溶,剂,方法,B,方法,B,方法,B,：系,统适用性,方法,B,1,类,方法,B-2,类,方法,B-2,类,方法,B-3,类溶,剂,方法,C,方法,C,与方法,A,相同再,加上：,标准溶液,:,在方法,A,和,B,中已定性的峰用,USP,溶剂标准品来稀释,增敏溶液,供试品与标准品的混合液,方法,C:,系统,适用性,1,类标准溶液,信噪比,S/N:1,1,1,三氯乙烷,5,1,类系统适用性溶液,信噪比,S/N:,所有的峰,3,2,类,Mixture A Standard Solution,分离度,:,乙腈与二氯甲烷,1.0,如果用方法,B,的话按照它的系统适用性要求。,计算每个残留溶剂的量,ppm=5(C/W)ru/(rst-ru),C=,浓度,ppm,标准溶液的相关美国对照品浓度,W=,质量,g,为供试品贮备液中供试品的重量,r=,供试品溶液的残留溶剂的峰响应,rst=,加入标准溶液供试品溶液的残留溶剂的峰响应,方法,C:,计算,供试液制备,水溶性样品,供试品储备溶液：取,250mg,供试品，置,25ml,量瓶中，用水并稀释至刻度。,供试品溶液：取上述储备液,5ml,，置顶空瓶中，加水,1ml,，加塞，加盖。,供试液制备,非水溶性样品,供试品溶液储备液,:,转移,500mg,的待测物质,精确称,取,至一个,10ml,量瓶,用二甲基甲酰胺稀释至刻,度，混匀。,供试品溶液,:,转移供试品储备液,1.0ml,至一合适的,顶空进样瓶中，包含有,5.0ml,的水，加塞，压盖，,混匀。,标记溶液,:,转移,1.0ml,供试品储备液到一合适的顶,空进样瓶中，再加入,1ml,的标准储备液和,4.0ml,的,水，加塞，压盖，混匀,(,制备在方法,A,和方法,B,中已,经定性的各峰的增敏溶液,),可选的方法,USP-NF,总要求,:,也可选用别的在准确,度、,灵敏度、精密度、选择性或适用性方面有一定,优势的方法，以满足自动化或减少数据处理或,其它特殊的要求。这种方法应该得到验证,当出现不同或争议时，只有按药典方法获得的,结果为决定性结果USP-NF:,General Chapter,USP,固定相组成,推荐,G1,二甲基聚硅氧烷油,DB-1,G2,二甲基聚硅氧烷胶,DB-1,G3,50%,苯基,-50%,甲基聚硅氧烷,HP-50+,G5,3-,氰丙基聚硅氧烷,DB-23,G6,三氟丙基甲基聚硅氧烷,DB-210,G7,50%,氰丙基聚硅氧烷,-50,苯甲基硅氧烷,DB-225,G14,聚乙二醇（平均分子量,950-1050,）,Wax,G15,聚乙二醇（平均分子量,3000-3700,）,Wax,G16,聚乙二醇（平均分子量,15000,）,Wax,USP,固定相（,26,种）,USP,固定相组成,推荐,G19,25%,苯基,-25,氰丙基甲,基硅氧烷,DB-225,G20,聚乙二醇（分子量,380-420,）,Wax,G25,聚乙二醇,TPA(20M,对苯二甲酸,),FFAP,G27,5,苯基,-95%,甲基聚硅,氧烷,DB-5,G28,25,苯基,-75%,甲基聚硅氧,烷,DB-35,G32,20,苯甲基,-80%,二甲基聚硅氧,烷,DB-35,G35,聚乙二醇硝基对苯二甲酸酯双环氧化物,FFAP,G36,1%,乙烯基,-5,苯甲基聚,硅氧烷,DB-5,G38,G1,固定相，加拖尾抑制剂,DB-1,USP,固定相,USP,固定相组成,推荐,G36,1%,乙烯基,-5,苯甲基聚,硅氧烷,DB-5,G38,G1固定相，加拖尾抑制剂,DB-1,G39,聚乙二醇（平均分子量,1500,）,Wax,G41,苯甲基二甲基聚硅氧烷,(10,苯取代,),DB-5,G42,35,苯基,-65,二甲基乙,烯基硅烷,DB-35,G43,6,氰丙基苯,-94,二甲基聚硅,氧烷,1301 624,G45,二乙烯基苯,-,乙二醇,-,二丙烯酸酯,PLOT U,G46,14,氰丙基苯基,-86,甲基聚硅氧烷,DB-1701,USP,固定相,欧洲药典有关残留溶剂的内容,溶剂分类同,ICH,测定方法为顶空进样法，分,A,、,B,两个系统。,下列溶剂不宜用顶空法测定：,甲酰胺（,formamide,）,2-,乙氧基乙醇（,2-methylethanol),四氢噻砜（,sulfolane),2-,甲氧基乙醇（,2-methoxyethanol),乙二醇（,ethylene glycol),N-,甲基吡咯啉（,N-methylpyrrolidone),欧洲药典残留量测定样品制备,根据样品的溶解性选择合适的溶剂,水溶性样品用水作溶剂，非水溶性样品用二甲基甲酰胺作溶剂。,测定二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺时用,1,、,3-dimethyl-2-dimethyl-2-imidazolidinone(DMI),作溶剂。,供试液制备,：取,0.2g,样品，用上述溶剂溶解，稀释至,20ml,。,测定溶液,:,取供试液,5.0ml,，加,1.0ml,空白溶剂。,对照溶液的制备,对照储备液：取待测溶剂，溶于适量二甲亚砜中，加水稀释至,100ml,，取适量用水稀释至一定浓度。,测试用对照溶液：取样品溶液,5.0ml,，置顶空瓶中，加,1.0ml,对照储备液，加盖，密封。,欧洲药典残留量测定色谱条件,A,色谱柱：,30m0.32,（,0.53,）,mm1.8,（,3.0,）,m 6%,氰丙基苯,-94,二甲基聚硅氧烷（,HP-624,）,载气：,N,2,或,He,线速度,:35cm/s,分流比：,5,：,1,进样口温度：,140,检测器温度：,250,柱温：,40,（,20min,），,20/min,升温至,240,，维持,20min,。,系统要求：乙腈与二氯甲烷的分离度,1.0,，信噪比：,5,RSD1.0,，信噪比：,5,，,RSD15%,结果判断,测定溶液色谱峰面积小于对照溶液峰面积的,50,，结果符合规定。,如需定量测定，可采用标准加入法测定。,中国药典,2010,年版附录残留量测定方法,药物中常见的残留溶剂及限度见附表,1,，除另有规定外，第一、第二、第三类溶剂的残留量应符合表中的规定；对其他溶剂，应根据生产工艺的特点，制定相应的限度，使其符合产品规范、,GMP,或其他基本的质量要求。,色谱柱,毛细管柱,除另有规定外，极性相近的同类色谱柱之间可以互代使用。,（,1,）非极性色谱柱 固定液为,100,的二甲基聚硅氧烷的毛细管柱。,（,2,）极性色谱柱 固定液为聚乙二醇（,PEG-20M,）的毛细管柱。,（,3,）中极性色谱柱 固定液为（,35%,）二苯基,-,（,65%,）甲基聚硅氧烷，（,50%,）二苯基,-,（,50%,）二甲基聚硅氧烷，（,35%,）二苯基,-,（,65%,）二甲基聚硅氧烷，（,14%,）氰丙基苯基,-,（,86%,）二甲基聚硅氧烷，（,6%,）氰丙基苯基,-,（,94%,）二甲基聚硅氧烷的毛细管柱。,（,4,）弱极性色谱柱 固定液为（,5%,）苯基,-,（,95%,）甲基聚硅氧烷，（,5%,）二苯基,-,（,95%,）二甲基聚硅氧烷共聚物的毛细管柱。,2,填充柱 以直径为,0.25,0.18mm,的乙二烯苯,-,乙基乙烯苯型高分子多孔小球或其他适宜的填料作为固定相。,系统适用性试验,（,1,）用待测物的色谱峰计算，毛细管色谱柱的理论板数均应大于,5000,；填充柱法的理论板数应大于,1000,。,（,2,）色谱图中，待测物色谱峰与其相邻的色谱峰的分离度应大于,1.5,；,（,3,）以内标法测定时，对照品溶液连续进样,5,次，所得待测物与内标物峰面积之比的相对标准偏差（,RSD,）应不大于,5,；若以外标法测定，所得待测物峰面积的相对标准偏差（,RSD,）应不大于,10,。,供试品溶液的制备,1,顶空进样 除另有规定外，精密称取供试品,0.1,1g,；通常以水为溶剂；对于非水溶性药物，可采用,N,，,N,二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或其他适宜溶剂；根据供试品和待测溶剂的溶解度，选择适宜的溶剂且应不干扰待测溶剂的测定。根据品种正文中残留溶剂的限度规定配制供试品溶液，浓度满足系统定量测定的需要。,2,溶液直接进样 精密称取供试品适量，用水或合适的有机溶剂使溶解；根据品种正文中残留溶剂的限度规定配制供试品溶液，其浓度满足系统定量测定的需要。,对照品溶液的制备,精密称取各品种项下规定检查的有机溶剂适量，采用与制备供试品溶液相同的方法和溶剂制备对照品溶液。若为限度实验，根据残留溶剂的限度规定确定对照品溶液的浓度；若为定量测定，为保证定量结果的准确性，应根据供试品中残留溶剂的实际残留量确定对照品溶液的浓度；通常对照品溶液的色谱峰面积与供试品溶液中对应的残留溶剂的色谱峰面积以不超过,2,倍为宜。必要时，应重新调整供试品溶液和对照品溶液的浓度。,测定法,第一法,毛细管柱顶空进样等温法,当需要检查的有机溶剂数量不多，并极性差异较小时，可采用此法。,色谱条件 柱温一般为,40,100,；常以氮气为载气，流速为每分钟,1.0,2.0ml,；顶空瓶加热温度为,70,85,，顶空瓶加热时间,30,60,分钟；进样口温度为,200,；如采用,FID,检测器，温度为,250,。,测定法 取对照品溶液和供试品溶液，分别连续进样不少于,2,次，测定待测峰的峰面积。,第二法,毛细管柱顶空进样系统程序升温法,当需要检查的有机溶剂数量较多并极性差异较大时，可采用此法。色谱条件 如为非极性色谱系统，柱温一般先在,30,维持,7,分钟，再以,8/min,的速度升至,120,，维持,15,分钟；如为极性色谱系统，柱温一般先在,60,维持,6,分钟；再以,8/min,的升温速率升至,100,，维持,20,分钟；以氮气为载气，流速为,2.0ml/min,；顶空瓶温度,70,85,，顶空时间,30,60,分钟；进样口温度为,200,；如采用,FID,检测器，温度为,250,。,具体到单个药品的残留溶剂检查时，可根据该品种项下的残留溶剂组成调整程序升温速率。,测定法 取对照品溶液和供试品溶液，分别连续进样不少于,2,次，测定待测峰的峰面积。,第三法,溶液直接进样法,可采用填充柱，亦可采用适宜极性的毛细管柱。,测定法 取对照品溶液和供试品溶液，分别连续进样不少于,3,次，每次,2l,，测定待测峰的峰面积。,计算法,（,1,）限度实验：以内标法测定时，计算单位重量样品中的色谱峰面积与内标峰面积之比；供试品溶液所得的峰面积比的平均值不得大于由对照品溶液所得的峰面积比的平均值。以外标法测定时，供试品溶液所得的单位重量中样品待测物峰的平均面积不得大于由标准溶液所得的待测物峰的平均峰面积。,（,2,）定量测定：按内标法或外标法计算各残留溶剂的量。,顶空进样法测定应注意问题,A,应根据供试品中残留溶剂的沸点选择顶空温度。对沸点较高的残留溶剂，通常选择较高的顶空温度；但此时应兼顾供试品的热分解特性，尽量避免供试品产生的挥发性热分解产物对测定的干扰。,B,顶空时间一般为,30,45,分钟，以保证供试品溶液的气,-,液两相有足够的时间达到平衡。顶空时间通常不宜过长，如超过,60,分钟，可能引起顶空瓶的气密性变差，导致定量准确性的降低。,C,对照品溶液与供试品溶液必须使用相同的顶空条件。,定量方法的验证,当采用顶空色谱系统测定时，供试品与对照品处于不完全相同的基质中，故应考虑气液平衡过程中的基质效应。由于标准加入法可以消除供试品溶液基质与对照品溶液基质不同所致的基质效应的影响，故通常采用标准加入法验证定量方法的准确性。当标准加入法与其他定量方法的结果不一致时，应以标准加入法的结果为准。,干扰峰的排除,供试品中的未知杂质或其挥发性热降解物易对残留溶剂的测定产生干扰。干扰作用包括在测定的色谱系统中未知杂质或其挥发性热降解物与待测物的保留值相同（共出峰）；或热降解产物与待测物的结构相同（如甲氧基热裂解产生甲醇）。,当测定的有机溶剂残留量超出限度，但未能确定供试品中是否有未知杂质或其挥发性热降解物对测定有干扰作用时，应通过试验排除干扰作用的存在。对第一类干扰作用，通常采用在另一种极性相反的色谱柱系统中对相同样品再进行测定，比较不同色谱系统中测定结果的方法。如二者结果一致，则可以排除测定中有共出峰的干扰；如二者结果不一致，则表明测定中有共出峰的干扰。对第二类干扰作用，通常要通过测定已知不含该溶剂的对照样品来加以判断。,含氮碱性化合物的测定,普通气相色谱的不锈钢管路、进样器的衬管等对有机胺等含氮碱性化合物具有较强的吸附作用，致使其检出灵敏度降低。当采用顶空进行系统测定此类化合物时，应采用惰性的硅钢材料或镍钢材料管路；或采用溶液直接进样法测定。供试品溶液应不呈酸性，以免待测物与酸反应后不易气化。,通常采用弱极性的色谱柱或经碱处理过的色谱柱分析含氮碱性化合物，如果采用胺分析专用柱进行分析，效果更好。,对不宜采用气相色谱法测定含氮碱性化合物，如,N-,甲基吡咯烷酮等可采用其他方法如离子色谱法等测定。,检测器的选择,对含卤素元素的残留溶剂如氯仿等，采用,ECD,检测器，易得到高的灵敏度。,由于不同的实验室在测定同一药品时可能采用了不同的实验方法，当测定结果处于合格不合格边缘时，以采用内标及标准加入法为准。,甲酰胺、,2-,甲氧基乙醇、,2-,乙氧基乙醇、乙二醇、,N-,甲基吡咯烷酮等不宜用顶空进样方式测定。,原料药中有机溶剂残留量测定,以下简单介绍在新药质量标准研究中开发的一些测定实例。,辛伐他汀原料残留溶剂的检测,对照溶液和供试品溶液的制备,内标溶液的制备：精密量取丁酮适量，加,80%DMSO,溶液稀释制成,1ml,含,80g,的溶液。,对照品溶液的制备：取上述溶剂适量用内标溶液稀释制成每,1ml,中含甲醇,79g,、乙醇,79g,、丙酮,79g,、乙醚,36g,、二氯甲烷,40g,、正己烷,13g,、四氢呋喃,44g,、苯,0.35g,、环己烷,38g,、甲苯,17g,的溶液作为对照溶液。,供试品溶液的制备：取样品约,0.5g,，精密称定，置顶空瓶中，精密加内标溶液,5ml,，加盖封密，即得。,顶空进样器条件,顶空炉温：,80,，热平衡时间：,30,分钟，充样时间：,0.2,分钟，进样时间：,1,分钟。,辛伐他汀原料残留溶剂的检测,1.,甲醇,2.,乙醇,3.,丙酮,4.,乙醚,5.,二氯甲烷,6.,正己烷,7.,四氢呋喃,8.,苯,9.,环己烷,10.甲苯,混合对照溶液,四川某公司（,Y-01-050801,）,四川某公司（,Y01-051101,）,浙江某公司（,050302,）,样品名：替米沙坦 色谱柱：,HP-624,柱温：,50,分流比：,1,：,1,溶剂：稀硫酸 平衡温度：,80,替米沙坦样品测定色谱图,抗爱滋病新药司他夫定（色谱柱：,HP-INNOWAX,柱温：,45,）,司他夫定样品测定色谱图,注意：样品分解产物对测定的影响,样品名：佐米曲普坦 色谱柱：,HP-50,柱温：,50,（,10min,），,15/min,至,180,（,5min,）,溶剂：,50%DMF,平衡温度：,95,佐米曲普坦样品测定色谱图,盐酸阿扎司琼溶剂残留量测定：对照溶液 依次为氯仿、二氯乙烷、甲苯,盐酸阿扎司琼样品溶液：,RT4.287min,为氯仿,残留溶剂研究基本内容,1,、确定被测残留溶剂,2,、确定残留溶剂类别,3,、限度确立,4,、确定测定方法,5,、选择色谱柱和检测器,6,、制备供试品和对照品溶液,7,、测定条件的优化,8,、方法学验证,9,、质量标准建立,10,、其他,1,确定被测残留溶剂,一般原则,(1),工艺中使用二类以上和重结晶用溶剂，及根,据工艺特点要求其它溶剂进行残留量研究。,(2),建议对合成最后三步使用的三类溶剂也进行,研究。,建议原则,仔细分析,，别落下,(1),申报资料合成工艺中用到所有有机溶剂,(2),液态催化剂等,(3),趋势,:,胺类和羧酸,类,2,确定残留溶剂类别,盐酸克林霉素棕榈酸酯举例,使用溶剂,(,种,):,乙醇、丙酮,(,精制,),、二氯甲烷、,三氯甲烷、吡啶与,DMF,。,分类,:,测定方法确认：考虑,DMF,沸点较高，吡啶顶空条,件下检测灵敏度较低，故上述两种溶剂采用直接,进测定，其余溶剂采用顶空进样测定。,标准制定：按照,ICH,规定将二类有机溶剂二氯甲,烷、三氯甲烷、吡啶与,DMF,订入质量标准中，限,度参照,ICH,规定。同时将精制溶剂丙酮列入质量,标准中，限度为不得过,0.1%,。,4,确定定量方法,选择定量方法,外标法,内标法,标准加入法,:,利用加入该组分前后色谱峰响应,信号的变化而计算被测组分含量的方法,操作,:,测定供试品,测定供试品对照品,使用,:,边缘产品以标准加入法结果为准,;,顶空方式基质效应。,5,选择色谱柱和检测器,色谱柱分类,填充柱和毛细管柱,毛细管柱,WCOT,或,PLOT,极性大小（按固定液极性分类）,按内径分,液膜厚度,填充柱,大口径毛细管柱,常用毛细管柱,5%OV101,on 80/100 Chromosorb,30m 0.53mm 0.88,m,30m 0.32mm 0.25,m,不同色谱柱类型分离效果的比较,5,选择色谱柱和检测器,填充柱和毛细管柱,填充柱,柱效低，分离复杂样品的能力差。,以直径为,0.25,0.18mm