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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本幻灯片资料仅供参考，不能作为科学依据，如有不当之处，请参考专业资料。谢谢,食源性致病微生物是指以食物为载体，造成人类发生疾病一大类微生物（古菌、细菌、真菌、病毒等）。近年来，全球食品安全事件频频发生，如美国“李斯特氏杆菌事件”、日本“大肠杆菌0l57流行事件”等，对人类健康带来很大危害，引发各国政府全力关注。,传统检测方法(如分离培养、生化判定等)无法对难培养或不可培养致病微生物进行检测，而且特异性不高、灵敏度低、操作烦琐耗时，不能实现有效监测、预防作用。,所以，发展新快速检测与判定食源性致病微生物方法是及时有效地控制和预防致病微生物传输前提。,I.,国内外食源性致病微生物检测新技术研究与应用进展,第1页,国内外食源性致病微生物检测新技术,免疫学检测技术,聚合酶链反应(PCR)等技术,生物芯片技术,代谢学技术,其它技术,第2页,一 免疫学检测技术,免疫荧光技术,免疫磁性分离技术,免疫胶体金技术,酶联免疫吸附检测(ELISA),酶联荧光免疫分析技术(VIDAS),免疫学检测技术将抗原,-,抗体反应特异性与标识技术,(,荧光素、放射性同位素和酶,),相结合，是一个能够定位、定性和定量综合技术，具高专一性和高敏感度,。,第3页,1.免疫荧光技术,原理与特点：,免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性荧光色素标识在抗体(或抗原)上，与其对应抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下展现一个特异性荧光反应。此技术主要特点有特异性强、敏感性高、速度快。,应用：,此技术可用来对沙门氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、EColiO157和单核细胞增生李斯特氏菌等进行快速检测。王军等建立了养殖大黄鱼病原溶藻弧菌荧光抗体免疫快速检测技术。,第4页,2.免疫磁性分离技术,原理与特点：,免疫磁性分离技术是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，与样品中被检致病菌发生特异性结合，载有致病菌磁性颗粒在外加磁场作用下，向磁极方向聚集，弃去检样混合液，使致病菌不停得到分离、浓缩。免疫磁性分离技术代替了常规选择性增菌培养过程，可特异有效地将目标微生物从样品中快速分离出来。,应用：,Skjerve等报道了采取免疫磁性分离技术，从乳及乳制品、肉类和蔬菜中分离沙门氏菌，其检测灵敏度为100CFUg。在英国，此法主要应用于牛奶中大肠杆菌O157：H7监测和食品中单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、小肠结肠耶尔森氏菌)等检测。在实际应用中，还能够与直接镜检技术、阳抗技术、酶联免疫试验、PCR等技术相结合应用。另外，以免疫磁性分离技术为基础免疫胶体金技术已成功应用于O l群霍乱弧菌检测。,第5页,3.免疫胶体金技术,原理与特点：,免疫胶体金技术起源于1971年Faulk等应用电镜免疫胶体金染色法(IGS)观察沙门菌。其基本原理是以微孔滤膜为载体包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜毛细管作用或渗滤作用使标本中抗原或抗体与膜上包被抗体或抗原结合，再用胶体金结合物标识而到达检测目标。其特点是单份测定、简单快速、特异敏感，几分钟就可用肉眼观察到颜色鲜明试验结果，并可保留试验结果。,第6页,4.酶联免疫吸附检测(ELISA),原理：,1971年Engvall建立了ELISA方法，它以酶或者辅酶作为标识物，标识抗原或者抗体，用酶促反应放大作用来显示初级免疫学反应，而且利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原或者抗体，使其固相化，在其中进行免疫反应和酶促反应。依据酶反应底物显色深浅进行定性或定量分析。,特点：,因为酶催化效率很高，间接地放大了免疫反应结果，使测定含有极高灵敏度。ELISA含有选择性好、结果判断客观准确、实用性强、检测速度快、样品处理量大、以及费用低等优点，填补了经典化学分析方法和其它仪器测试伎俩不足。,第7页,应用：,ELISA,技术自二十世纪,70,年代出现开始，在临床和生物疾病诊疗与控制等领域中倍受重视。尤其是伴随蛋白质分离纯化技术和基因工程技术不停发展，各种高纯度抗体、抗原和抗体复合物得以制备，单克隆抗体技术应用，使得该诊疗检测技术在特异性、灵敏度和客观性方面都有了大幅度提升，而且在自动化免疫技术推进之下深入含有了准确定量分析能力。,因为,ELISA,技术条件要求低、适用范围宽、携带方便、且易商品化、操作简便和经济实惠，它已成为一个应用最为广泛和发展最为成熟生物检测与分析技术，常以试剂盒形式出现。,第8页,完整,ELISA,试剂盒包含以下各组分：,(1),包被抗原或抗体固相载体,(,免疫吸附剂,),；,(2),酶标识抗原或抗体；,(3),酶底物：,(4),阴性和阳性对照品,(,定性测定,),，参考标准品和控制血清,(,定量测定,),；,(5),结合物及标本稀释液；,(6),洗涤液；,(7),酶反应终止液。结合物为酶标识抗体,(,或抗原,),，是,ELISA,中最关键试剂。良好结合物既保持了酶催化活性，也保持了抗体,(,或抗原,),免疫活性。在,ELISA,中，惯用酶为辣根过氧化物酶,(Horseradish peroxidase,，,HRP),和碱性磷酸酶,(Alkalinephosphatase,，,AP),。国产,ELISA,试剂普通都用,HRP,制各结合物。国外很多,ELISA,试剂采取碱性磷酸酶,(AP),作为标识酶。,第9页,近年来，该项技术在食品安全性检测中正逐步得以推广应用，如微生物污染、天然毒性物、人兽共患疾病病原体检测等方面检测分析。,微生物污染：,Kryinskiand Heimsch,等,(1977),首次将,ELISA,用于食品沙门氏菌,(,Salmonella,spp,),检测，并在应用中不停得以发展。当前有许各种方法，其中经过制备单克隆抗体分析食品中细菌,ELISA,技术研究最多，检测结果准确可靠。比如对沙门氏菌最低检测量可达,500CFU,g,，仅需,22h,，比常规方法缩短了,3,4d,，与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。另外以,ELISA,技术为基础全自动沙门氏菌 检测系统，实现了整个过程自动化，全程耗时仅为,45min,。,毒素检测：真菌毒素,(mycotoxin),是真菌产生次级代谢产物，其中十几个对人类危害较大，它们普通同时含有毒性强和污染频率高特点。其中毒性最大、致癌能力最强是黄曲霉毒素,(AFT),。它在自然界中分布十分广泛，黄曲霉经常和其它各种微生物在一起，生长在粮食、油料作物种子、各种食品和饲料中。自,1977,年抗黄曲霉素,B1,单克隆问世，至今，几乎全部主要真菌毒素,(,如伏马毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯酮、展青霉素等,)ELISA,检测方法均已建立。,第10页,人兽共患疾病病原体检测：海绵状病毒,(BSE),是牛一个致死性神经系统疾病，它与人群发生变异型克雅氏病,(VCJD),相关。对于该病病原，普遍认为是由一个蛋白质性感染颗粒也称朊蛋白，是一个病理性细胞朊蛋白,(PrPSc),，由正常细胞朊蛋白,(PrPc),转变而来。蛋白酶关键位点抗体应用于检测正常及,BSE,动物脑组织,PrPc,含量，对于天然组织，两组差异很小，但经加热及异硫氰酸胍处理后，,ELISA,可将牛脑匀浆物中,BSE,特异性,PrPSc,与,PrPc,区分开来，无显著临床症状,BSE,感染动物可被检出，经对朊蛋白,Western,印迹法,检测牛及羊朊病毒蛋白灵敏度、特异性及可靠性进行分析，证实该方法是有效。另外，在禽流感病毒检测方面，我国已完成了禽流感流行株分离和判定、禽流感重组核蛋白诊疗抗原研制及应用，建立了禽流感免疫酶诊疗方法和技术，已形成试剂盒生产能力。,第11页,ELISA技术发展趋势,高度免疫原性重组抗原：经过基因工程技术能够快速、批量地生产出含有高度免疫原性重组抗原，用来替换一些无法从天然材料中分离抗原物质，深入地扩大了ELISA检测分析范围。重组抗原在纯度上要高于经过裂解病原体所提取抗原。用于检测重组抗原有可能最终到达以下两个标准：(1)包含全部能引发机体强免疫应答病原体抗原决定簇：(2)不含或尽可能少含非特异性抗原或共同抗原。,多项标志物快速测定：利用酶联免疫技术同时对待检样本中多项标志物进行快速测定。这对于一些常需同时测定标志物来说，可节约测定时间。能够经过以下两种方法来到达这一目标：(1)经过基因工程技术表示特定融合蛋白质将各种不一样蛋白质功效构建在一起，能够快速方便地同时检测多项标志物；(2)采取几个能够催化各自底物产生不一样颜色反应酶，分别标识含有不一样特异性抗体或抗原，反应后用其各自酶底物显色，从而到达了同时检测多项标志物目标。,第12页,天然酶定向改造和体外分子进化：利用天然酶定向改造和体外分子进化伎俩，研究开发免疫测定标识用酶融合蛋白(一个同时含有催化底物显色反应酶活性和特异性抗体或抗原性质融合蛋白)能够作为结合物(酶标识抗原或抗体)直接用于ELIAS试剂盒。这使得ELIAS试剂盒在其生产过程中不但防止了繁琐且低效率酶与特异性抗体或抗原化学交联过程，而且无需得到纯化酶和抗体或抗原，从而大大地提升了ELIAS试剂盒产品稳定性，使其结果含有更加好重复性。,自动化酶联免疫测定技术 .近年来所出现全自动酶标测定分析仪，不但减轻了试验室人员劳动强度，而且大大提升了测定准确性和重复性。这么有利于ELISA技术在检测分析中深入商品化推广。,第13页,5酶联荧光免疫分析技术(VIDAS),原理与特点：酶联荧光免疫分析技术将酶系统与荧光免疫分析结合起来，在普通酶免疫分析基础上用理想荧光底物代替生色底物，就可提升分析灵敏度和增宽测量范围，降低试剂用量。酶放大技术、固相分离及荧光检测三者联合将成为荧光免疫分析中最灵敏方法。,应用：陈思强等采取自动酶联荧光免疫分析系统检测冻肉中沙门氏菌。,第14页,二 聚合酶链反应(PCR)技术,rRNA 序列分析法,依赖PCRDNA指纹图谱技术,多重PCR检测技术(m-PCR),实时荧光定量PCR检测技术,聚合酶链反应,(PCR),是近十多年来应用最广分子生物学方法，在食源性致病微生物检测中均是以其遗传物质高度保守核酸序列设计特异引物进行扩增，进而用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察扩增结果。,第15页,PCR 原理,PCR技术类似于DNA天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补寡核苷酸引物。PCR由,变性-退火-延伸,三个基本反应步骤组成：模板DNA变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成双链DNA解离，使之成为单链，方便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链互补序列配对结合；引物延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新与模板DNA 链互补半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可取得更多“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目标基因扩增放大几百万倍。抵达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板拷贝。,第16页,2依赖PCRDNA指纹图谱技术,1)随机引物扩增DNA多态性(RAPD)。,随机引物扩增DNA多态性主要用于不考虑微生物核酸准确序列情况下，比较微生物间DNA指纹图谱差异，用于细菌种问判定，Black等将毛细管热循环仪及RAPD技术用于李斯特氏菌(Listeria Pirie)判定，3h即可出结果。依赖,PCRDNA,指纹图谱技术是经过各种改进,PCR,技术，使目标微生物核酸经扩增后，产生多条,DNA,扩增片段,(,特异性和非特异性,),，经过统计分析，找出某种微生物特有条带，进行区分判定。,第17页,2),基因内重复性一致序列,(ERIC),扩增,.,ERIC,片段是存在于肠道细菌核酸中重复,DNA,序列，含有一段高度保守中心反转重复序列，分布在细菌染色体不一样位点上且以不一样距离分隔，所以，以这些重复,DNA,片段作为,PCR,扩增时引物结合位点，使其被分隔片段大量扩增，在凝胶电泳上形成一系列条带，从而区分不一样肠道细菌。,Versalovio,等曾用与,ERIC,重复序列互补寡核苷酸片段作为引物及斑点杂交,DNA,探针来检测包含大肠杆菌,(,E,coli,),、沙门氏菌,(,Salmonella,),、志贺氏菌,(,Shigella,),等不一样菌种间存在特异,DNA,指纹图谱。与,RAPD,相比，此法引用引物序列固定，结果重复性更加好。,第18页,3）食品中致病菌靶基因PCR检测,第19页,沙门菌可致各种感染轻者为自愈性胃肠炎，重可引发致死性伤寒。沙门菌主要含有3种抗原结构，即菌体(0)抗原，鞭毛(H)抗原及表面抗原(Vi抗原等)。沙门菌有较强内毒素，引发发烧，白细胞改变，中毒性休克，并能激活补体系统一些沙门菌能产生类似大肠埃希菌肠毒素，有Vi抗原沙门菌含有侵袭力，而且被细胞吞噬后，不被破坏。,31 invA gene 是编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白基因，是一段只存在于致病性沙门菌中独特保守基因序列】。它是毒力岛SP11基因之一。,32伤寒沙门茵鞭毛抗原基因 即使鞭毛抗原Hd也存在于其它沙门菌中，但其高变区10721089区域为伤寒沙门菌所独有】，还能够用sefA 基因(编码鞭毛抗原)设计引物用PCR方法检出沙门菌。,33 ViaB gene 致病伤寒沙门菌都含有Vi抗原，vi多糖抗原为N一乙酰半乳糖胺糖醛酸多聚物，Vi抗原产物由染色体中ViaA和ViaB两组基因所控制，其中ViaB基因被认为是Vi抗原表示特异结构基因。,34 hjlA gene 编码沙门菌侵袭基因正调整蛋白，与沙门菌对肠道上皮细胞侵袭力相关。,35 rfb gene 革兰阴性菌外膜主要成份为脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，其多糖部分(含0一特异性多糖和关键多糖)参加了细菌对宿主细胞黏附，侵袭和在细胞间扩散过程，是细菌致病因子之一，而LPS0抗原部分由rfb基因编码。,36 ompC gene 编码沙门菌外膜蛋白基因。,第20页,3多重PCR检测技术(m-PCR),原理与特点：PCR技术已经利用于食品中单一致病菌检测，并得到一定程度推广，但食品中往往含有各种致病菌。多重PCR建立，实现了各种食源性致病菌同时检测。m-PCR是指在同一个反应体系中，加入多对特异性引物，假如存在与各引物对特异性互补模板，即可同时在同一反应管中扩增出一条以上目标DNA片段，实现了一次性检测各种致病菌目标。M-PCR既保留了常规PCR特异性、敏感性，又降低了操作步骤及试剂。但也存在较显著不足：扩增效率不高、敏感性偏低；扩增条件需探索与协调；可能出现引物间干扰等。,应用：1999年，RYCKong等利用m-PCR技术，用六对引物分别对产毒素性大肠杆菌(ETEC)不耐热肠毒素LT1、LT2和ST1基因、肠道出血性大肠杆菌(EHEC)VT1、VT2基因及肠道致病性大肠杆菌(EPEC)EAE毒素基因同时进行扩增，对88株从水环境中分离菌株进行筛查，监测了水样受粪便污染程度检测灵敏度到达100CFU，100u 1。年又经过多重PCR实现了海水中气单胞菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌六种病原细菌同时快速检测。我国学者严笠等应用m-PCR，在同一扩增体系中同时扩增了大肠埃希氏菌O157：、沙门氏菌和志贺氏菌特征性基因，最终经过凝胶电泳实现了这三种致病菌同时快速检测，取得理想结果。,第21页,4实时荧光定量PCR检测技术,原理与特点,：实时荧光定量PCR技术是在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终经过标准曲线对未知模板进行定量分析方法，有效地处理了内标定量PCR只能终点检测局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号强度，并统计在电脑软件之中，经过对每个样品Ct值(每个反应内荧光信号抵达设定域值所经历循环数，Cycle threshold)计算，依据标准曲线得定量结果，定量根本原理是Ct值与样品中起始模板拷贝数对数成线性反比关系。,第22页,Ct,值是怎样得到？,在实时荧光定量,PCR,过程中，靶序列扩增与荧光信号检测同时进行，定量,PCR,仪全程采集荧光信号，试验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品,Ct,值。,第23页,Ct,值定义,Ct,值中“,C”,代表,Cycle,（循环），“,t”,代表检测,threshhold,（阈值），其含义是,PCR,扩增过程中荧光信号强度到达阈值所需要循环数；也能够了解为扩增曲线与阈值线交点所对应横坐标。,Ct,值与样品中模板对应关系,Ct,值与样品中起始模板拷贝数对数成线性反比关系（,y=ax+b,，,x,代表起始模板拷贝数对数，,y,代表,Ct,值）。,因为,Ct,值是反应实际,PCR,反应过程中扩增即将进入指数期参数，该参数几乎不受试剂消耗等原因影响，所以利用,Ct,值判断起始模板拷贝数愈加准确，重复性也愈加好。另外，采取实时荧光定量,PCR,还能从方法学上有效预防,PCR,试验中交叉污染问题。因为荧光定量,PCR,中模板扩增与检测是同时进行，当试验完成后即可取得定量结果，直接丢弃含有大量扩增产物反应管，彻底防止了传统方法中取出扩增产物进行电泳判定时扩增产物对试验室造成二次污染可能性。提升了检测灵敏度和特异性。,第24页,荧光定量PCR2类方法,1.染料法（SYBR Green法）,染料法即利用SYBR Green分子产生荧光信号来进行样品定量。该方法与常规PCR类似，唯一区分是在反应体系中加入了SYBR Green染料分子。该染料分子激发波长为497nm，发射波长为520nm。与EB性能类似，SYBR Green也是一个扁平状分子，处于游离状态时含有很低荧光本底，当反应体系中存在dsDNA时，SYBR Green能特异性与之结合并在497nm激发下。,染料法优点：1，无需设计、合成探针，试验成本低；2，使用方便，与常规PCR操作几乎相同。,染料法缺点：1，因为SYBR Green与dsDNA结合只含有结构特异性而不含有序列特异性，除了与特异性靶序列扩增产物结合外，还能与在PCR扩增过程中形成引物二聚体、非特异性扩增产物结合，从而造成扩增效率降低、结果不准确。所以采取该方法对于引物设计及试验条件优化要求很高，确保反应过程中没有非特异性产物扩增；2，因为SYBR Green上述特点，该方法不能应用于Multiplex QPCR技术。（在一个反应管中同时检测多个目标基因表示情况）,第25页,2.,探针法（以,TaqMan,探针为例）,探针法荧光定量,PCR,与常规,PCR,不一样之处于于,：在上、下游引物外还加入了含有序列特异性探针（探针本身含有荧光标识），该探针依据需要扩增靶序列设计所以只能与待检测序列结合，与染料法相比提升了试验特异性。当前市场上探针主要种类有：,TaqMan,、,Molecular Beacon,、,Scorpions,、,Hybirdization,等，其中以,TaqMan,探针应用最广泛。,TaqMan,探针结构,：长度与普通,PCR,引物类似，大约,20bp,左右。在,5,与,3,端各标识有一个荧光基团，,5,荧光基团称为汇报基团（,Report,），,3,荧光基团称为淬灭基团（,Quencher,）。,TaqMan,探针性能：,在探针结构完整情况下用特定波长激发汇报基团，因为汇报基团与淬灭基团空间位置很近，所以汇报基团能够经过,FRET,（,Fluorescence Resonance Energy Transfer,）将接收能量转移到淬灭基团，使后者以发射荧光或热量方式释放能量，而汇报基团并不发射特定波长荧光信号。,与染料法相比,TaqMan,探针法优点：,1,，试验特异性得到了提升；,2,，对探针,5,端采取不一样荧光标识就能够进行,Multiplex QPCR,。,与染料法相比,TaqMan,探针法缺点：,1,，探针使用提升了试验成本；,2,，探针使用需要设计及优化。,第26页,TaqMan,探针法工作原理：,1,、变性（,95C,）：模板,dsDNA,充分解链；,2,、复性、延伸、酶切降解（,60C,）：,1,）探针与靶序列结合；,2,）上、下游引物与靶序列结合；,3,）上、下游引物在,Taq,酶作用下合成互补链（,53,聚合功效）；,4,）当上游引物延伸到,TaqMan,探针,5,端时，延伸不能继续，此时,Taq,酶发挥,53,外切功效将探针逐一水解并继续向前延伸直至完成互补链合成；,3,、荧光信号检测：因为,TaqMan,探针被水解，汇报基团在受到激发后不能再经过,FRET,作用将接收能量转移给淬灭基团，所以能够检测到汇报基团特定波长荧光信号，起始模板浓度越高荧光信号越强。,第27页,三、生物芯片技术,近几年来，人们普遍较为关注“生物芯片”和“微芯片”在食源性致病菌等微生物检测。在设计生物芯片时，能够在芯片上加上不一样种类抗体或者DNA 分子，方便在同一个 片上同时完成对沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌、葡萄球菌等检测。据Heron报道，生物芯片在本世纪会有举足轻重作用，其市场价值可达50亿美元之高。,1.基因芯片(gene chip)技术,2.免疫芯片技术,第28页,1.基因芯片(gene chip)技术,原理：,基因芯片是二十世纪90年代中期诞生一项新型生物技术。将各种基因(16SrDNA、23SrDNA、ERIC等)寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA 经PCR扩增后制备荧光标识探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最终经过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在一些特定微生物。该技术可检测各种环境或媒介中微生物，研究复杂微生物群体基因表示。,特点:,与传统方法相比，基因芯片技术先进性主要表示在：(a)基因芯片能够对环境中微生物实现高通量和并行检测，一次试验即可得出全部结果；(b)操作简便快速，整个检测4h基本能够出结果，而传统方法普通需47d时间；(C)特异性强，敏感性高。,第29页,详细方法,PCR扩增引物、芯片探针设计与合成。,基因芯片制备。,样品采集制备和DNA分离纯化。,杂交检测和结果分析。,第30页,应用：,基因芯片技术理论上能够在一次试验中检出全部潜在致病原也能够用同一张芯片检测某一致病原各种遗传学指标；同时检测灵敏度、特异性和快速便捷性也很高，因而在致病原分析检测中有很好发展前景。近年来许多研究者对基因芯片分析检测食品中常见致病菌进行了一系列探讨。勒连群等采取合成后点样方法，把自行合成一系列寡核苷酸探针固定在经过醛基化修饰显微镜载玻片上，制成用于致病菌检测基因芯片。在相同条件下，扩增了包括,12,个菌属,151,株细菌,16SrDNA,基因片段并与基因芯片杂交，经,Scan Array3000,芯片阅读仪扫描得到特异性杂交图，得到一套属,(,种,),特异经典杂交图谱，然后将待检样品菌与基因芯片进行杂交，得到杂交结果与经典图谱比对即可判断出样品种类，准确率到达,96,2,。唐晓敏等利用此技术检测水中常见致病菌，与传统方法判定结果一致性为,95,，而且对于一个未知菌落，能够在,4h,之内完成菌种判断，为快速检测与判定常见致病菌提供了有效伎俩。,第31页,Functional Gene Arrays(FGA)for Microbial Cycling of C,S,N,and P,Calvin cycle:500,rTCA cycle,Acetyl-CoA,3-HP,Probes available for targeting,CO,2,fixation genes:,Nitrogen cycling:5089,Sulfur cycling:1006,Phosphorus utilization:438,Carbon degradation:1000,Probes available for targeting,other functional genes:,300,A,B,C,D,第32页,Fig.7,Hierarchical cluster analysis of,mcrA,gene relationships based on hybridization signal intensity.Representative genes versus depth water samples collected from MC118 and GC234 of GOM.The tree was generated using CLUSTER and was visualized with TREEVIEW.Black indicates no detectable hybridization above the background levels,while red indicates positive hybridization signals.The color intensities indicate differences in hybridization signal intensity.,第33页,2.免疫芯片技术,免疫芯片是指包被在固相载体上高密度抗原或抗体微点阵，是在载体上已设计好微阵列方式同定各种抗体或抗原，用标识物标识抗体或抗原，利用配体间特异相互作用方式进行反应、结合，然后经过特定扫描装置进行检测，结果由计算机分析处理。高志贤等已将该技术用于检测葡萄球菌肠毒素。,第34页,四.代谢学技术,电阻抗技术,微热量计技术,放射测量技术,接触酶测定技术,第35页,1.电阻抗技术,电阻抗技术是指细菌在培养基内生长繁殖过程中，会使培养基中大分子电惰性物质如碳水化合物、蛋白质和脂类等，代谢为含有电活性小分子物质，如乳酸盐、醋酸盐等，这些离子态物质能增加培养基导电性，使培养基阻抗发生改变，经过检测培养基电阻抗改变情况，即可判定细菌在培养基中生长繁殖特征。该法已用于食品中细菌总数、大肠杆菌、沙门氏菌、酵母菌、霉菌和支原体检测，含有高敏感性、特异性、反应快和高度重复性等优点。李小燕应用此法来快速检测鲜奶中大肠菌群。,第36页,2.微热量计技术,微热量计技术(Microcalorimetry)是经过测定细菌生长时热量改变进行细菌检出和判别。微生物在生长过程中产生热量，用微量热计测量产热量等数据，均存放于计算机中，经过适当信号上数字模拟界面，在统计器上绘制成以产热量对比时间组成热曲线图。依据这些试验所得热曲线图，和已知细菌热曲线图直观比较，即对细菌进行判别。刘永军等采取该技术研究细菌抑制作用。,第37页,3.放射测量技术,放射测量技术是依据细菌在生长繁殖过程中代谢碳水化合物CO2 原理，把微量放射性14C标识引入碳水化合物或盐类等底物分子中进行检测。在细菌生长时，这些底物被利用并释放出含放射性14CO2，然后经过自动化放射测定仪Bactec测量 14CO2含量，从而依据。14CO2 含量多少来判断细菌数量。这一方法已用于测定食品中细菌，含有快速、准确度高和自动化等优点。减改华等应用放射测量技术对大肠杆菌进行定量检测。,第38页,4接触酶测定技术,接触酶测定技术是经过计算一个含有接触酶纸盘，在盛有H2O2试管中漂浮时间来预计菌数。接触酶与H2O2 之间产生生化反应，放出氧气，使纸盘由试管底部浮到表面。当样品中接触酶含量高时(表明接触酶阳性细菌含量高)，纸盘上浮时间短(以秒计)。大多数腐败微生物是嗜冷性细菌。而大多数嗜冷细菌接触酶呈阳性，故能够用接触酶反应来预计食品中嗜冷性菌群。,第39页,II.其它微生物研究技术,1、rRNA 序列分析法,2.,DNA碱基百分比测定（G+C mol%）,3.,DNA-DNA分子杂交,4.,全基因组测序,5.蛋白质分析,6.,双向电泳（2-DE）技术,7.,质谱（MS）技术,8.电镜观察,第40页,1、rRNA 序列分析法,rRNA 序列分析大大推进了微生物分类学发展。微生物含有3个rRNA分子：23S、16S和5S，它们序列长度分别约为29001540、120bp。其中16S rRNA分子量适中，含有较大信息量，碱基次序保守性强且稳定，是判别生物间进化关系主要分子，也是硕士物系统进化过程中分子钟，普通认为，16S rDNA序列同源性小于97%能够认为属于不一样种，同源性小于93-95%能够认为属于不一样属（崔宗均，；Dong et al，1997）。16S rRNA序列分析表明它在种以上微生物相关性含有很高分辨力，但在进化关系亲密微生物种内分辨力还是有限（Dong et al，1997；Mrabet et al，1992），所以16S rRNA对于划分种界限没有确切数值（Tamaoka，1994）。,第41页,BL1,菌株判定。,A,：,BL1,基因组，,B,：,16S rDNA PCR,结果，,C,：重组质粒酶切验证,第42页,9,株菌,遗传进化树,第43页,2.,DNA碱基百分比测定（G+C mol%）,G+C含量是应用最普遍分类指标之一，这个参数在种和属描述中通常是必须（Tamaoka，1994）。对其测定最惯用是热变性温度法（Tm法）、高效液相色谱法，其次是浮力密度法（Sandman and Reeve，）。在微生物中G+C含量介于20-80%之间（Melchior，1982）。两种生物之间G+C含量差异越大，它们进化关系就越远，理论上说DNA分子之间G+C含量差异超出20-30%时，它们序列是完全不一样（王顺民，）。普通地，G+C含量相差在5%以上能够认为是两个不一样种，若相差超出10%则属于不一样属。,第44页,3.,DNA-DNA分子杂交,DNA-DNA分子杂交依然是当前判定种属标准方法（Stackebrandt and Goebel，1994）。依据DNA分子解链可逆性和碱基配正确专一性，将不一样起源DNA在体外加热使其变性，并在适当条件下使互补碱基重新配对，然后测定杂交百分率。百分率越高，说明二者间碱基次序同源性越高，即其间亲缘关系越近。从试验得知，各菌株DNA同源性在70%以上属于种水平；在20%以上，则可能属于属水平（Sriprapundh et al，）。,第45页,4.全基因组测序基因是生物体遗传信息关键载体，决定着生物体遗传特征和主要个体差异。自摩尔根提出这一概念后，一直有所争论。但在1949年发觉基因序列中单个碱基突变即可造成地中海贫血病后，科学界观点趋于一致。在20世纪下半叶，伴随相关研究伎俩改进，对人类基因及其与疾病关系研究成为生命科学中最主要领域之一。1990年10月，国际人类基因组计划在美国开启，美、英、日、德、法、中国相继参加了这一宏伟计划。年6月26日完成人类基因组工作框架图（Venter et al，）。,因为微生物含有结构简单，基因组小，多数为无性繁殖，可人工培养等特点，作为分子生物学及相关基础生物学研究材料，是一个良好模式生物。20世纪中，共有57名诺贝尔奖金取得者进行研究与微生物相关。相关研究不但开辟了对其致病机理研究、新型疫苗和药品研究新领域，也将为微生物及其产物利用开辟新天地，并将为揭示一系列诸如生命起源、生物发育和进化等生命活动重大问题提供极大帮助。,全基因组测序通常采取霰弹法（Shot-gun）和逐步克隆(Clone by clone)两种策略。全基因组霰弹法测序策略是直接将全部基因组DNA打成小片断进行随机测序，再利用高性能计算机拼接成完整基因组，省去了制作物理图谱繁杂过程。所以，它以经济、快速、高效优势逐步成为基因组测序主导策略。,第46页,GVE2,基因组。,A,，基因组,ApaI,酶切分析；,B,，,GVE2,基因组图谱。,第47页,5.蛋白质分析,蛋白质分析有某种特定蛋白和全细胞蛋白质分析之分。将蛋白图谱用于分类是基于以下假说，即关系亲密生物应有相同或一致类型细胞蛋白质。该法主要经过蛋白电泳，比较个体间蛋白图谱，是一个不需要价格昂贵设备、操作方便、又能快速取得试验结果方法，近年来在嗜热菌分类研究中常被采取（Baisong et al，1998）。其结果与DNA-DNA分子杂交结果基本一致（Sandman and Reeve，）。,第48页,菌体全蛋白,SDS-PAGE,凝胶电泳图谱,第49页,6.双向电泳（2-DE）技术,双向凝胶电泳是蛋白质组学研究中分离蛋白质主要技术之一（Klose and Kobalz，1995；Stanley et al，），它将等电聚焦和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳这两种技术结合起来。其原理是依据蛋白质等电点不一样在pH梯度胶内进行第一向等电聚焦分离，然后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术按蛋白质相对分子质量大小进行第二向分离，经染色后即可得到二维蛋白质分布图谱。将两组细胞或组织样品蛋白质成份在完全相同条件下进行双向电泳分离，比较胶上蛋白质分布，就能够找到差异表示蛋白质点，经质谱分析或氨基酸序列分析，然后与蛋白质组数据库比较，即可预测差异蛋白质特点和功效。,第50页,蛋白质组学,第51页,7.质谱（MS）技术,质谱技术是经过测定样品离子不一样质荷比(m/z)及其分布来进行结构与成份分析一个分析方法（罗治文，）。它与双向凝胶电泳（2-DE）及生物信息学是蛋白质组学研究支撑技术。而质谱是对分离蛋白质进行判定一个主要方法，也是蛋白质组研究中最关键一步。质谱仪主要包含进样器、离子化源、质量分析器、离子检测器、控制电脑及数据分析系统组成。其中离子化源及质量分析器发展，使得质谱技术在生物大分子等方面研究起着日益主要作用。当前惯用质谱仪器有气相色谱-质谱仪（GC-MS）；液质联用质谱仪(LC-MS）；电喷雾离子化质谱仪（ESI-MS)；液相色谱-电喷雾离子化质谱仪(LC-ESI MS）；基质辅助激光解吸离子化质谱仪（MALDI-TOF MS）；蛋白质芯片-飞行时间-质谱系统（SELDI-TOF MS)；四极杆-飞行时间-质谱质谱仪（Qq-TOF MS）等。其中气相色谱-质谱技术惯用于生化分析，其敏感性较差，在蛋白质等生物大分子研究中作用有限。MALDI-TOF MS是当前蛋白质组学研究中应用最广泛质谱仪，而SELDI-TOF MS被认为是比较有前途质谱技术。当前，质谱技术已经广泛应用于生物学、生物医学、生物化学、微生物学等学科研究。,第52页,Fig 2.Characterization of VP466 by mass spectrometry.,a,MALDI-TOF MS spectrum.,b,nano-ESI-MS spectrum.,第53页,8.电镜观察,第54页,Thanks,第55页,