生物分离工程-第七章-色谱技术-亲和色谱省名师优质课赛课获奖课件市赛课一等奖课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,第七章 亲和色谱,在众多亲和分离技术中，亲和色谱是应用最多，分离效果最好技术。,第1页,概述,生物分子能够区分结构和性质非常靠近其它分子，选择性地与其中某一个分子相结合，生物分子间这种,特异性相互作用,称为亲和作用。,静电作用、氢键等各种作用力对亲和作用含有影响。,生物分子间,亲和识别,包含抗体-抗原、酶-底物、激素-受体等亲和作用。,第2页,常见亲合作用体系,特异性,亲和体系,高特异性,抗原-单克隆抗体,荷尔蒙受体蛋白,核酸互补碱基链段、核酸结合蛋白,酶底物、产物、抑制剂,群特异性,免疫球蛋白A蛋白、G蛋白,酶辅酶,凝集素糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体,酶、蛋白质-肝素,酶、蛋白质-活性色素（染料）,酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等）,酶、蛋白质氨基酸（组氨酸等）,第3页,第4页,1、离子强度：普通来说，提升离子强度，亲和作用减弱或完成破坏。,2、PH：在适当PH下，亲和结合作用较高，在其它PH下，亲和作用减弱或完成破坏。,3、抑制氢键形成物质：脲和盐酸胍存在可减弱亲和作用,4、温度：提升温度，静电作用、氢键、配位键减弱；不过，疏水性相互作用增强,5、液体离子：SCN,-,、I,-,、CIO,4,-,存在，疏水性相互作用减弱,6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失,影响亲和作用原因,第5页,利用生物分子之间专一性识别或特定相互作用进行分离技术为,亲和分离技术,亲和配基,是对生物分子含有专一性识别或特定相互作用物质,第6页,7,找与底物专一可逆结合配基；,将配基经过共价键偶联到基质；,配基与底物吸附；,洗脱目标物。,第7页,8,亲和纯化技术,亲和层析(Affinity chromatography),亲和过滤（膜分离）,亲和分配（双水相萃取）,亲和反胶团萃取（反胶团萃取）,亲和沉淀（沉淀）,亲和电泳（电泳）,第8页,第9页,配基,生物特异性配基,拟生物亲和配基,亲和配基必须具备条件：,1、专一性识别或特异性作用必须是可逆,2、结合常数要适当,3、稳定性好，可进行化学改性,第10页,专一性和特异性,决定着分离纯化产品纯度,相互作用强弱,决定着吸附和解吸难易程度,第11页,亲和配基分类,单专一性小分子配基,基团专一性小分子亲和配基,专一性大分子亲和配基,免疫亲和配基,基团专一性大分子亲和配基,第12页,亲和配基选择,组合化学肽库选择亲和配基,目标肽反义肽组合合成亲和筛选优选序列,噬菌体展示技术,目标蛋白可结合噬菌体扩增多轮筛选单克隆群体氨基酸序列,SELEX技术,随机序列,PCR扩增特异性结合重复筛选,第13页,亲和洗脱,目标产物洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。,特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物含有亲和结合作用小分子化合物，经过与亲和配基或目标产物,竞争性结合,，洗脱目标产物。,非特异性洗脱经过调整洗脱液pH、离子强度、离子种类或温度等降低目标产物亲和吸附作用。,第14页,亲和色谱,亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用生物大分子含有对一类生物大分子特异识别和可逆结合特征而建立起来一个分离色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。,是亲和分离技术中最具优势方法,第15页,含配体溶液,搜集目标蛋白,洗下未结合蛋白,混合蛋白样品,平衡液,带有配体树脂珠（或胶粒）,第16页,第17页,亲和层析基本特点,1、纯化过程简单、快速，且分离效率高,2、尤其适合用于分离纯化一些含量低、稳定性差生物大分子,3、纯化倍数大，产物纯度高,4、必须针对某一分离对象制备专一配基及寻求稳定层析条件,5、价格相对较昂贵；,6、在洗脱中，交联在层析介质上配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。,第18页,基质选择,理想基质应符合下面要求：,1极低非特异性吸附。,2高度亲水性。,3很好理化稳定性。,4大量化学基团能被有效地活化，而且轻易和配体结合。,5适当多孔性。,普通亲和吸附剂采取基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。,亲和色谱介质制备,第19页,配基选择,依据配体对待分离物质亲和性不一样，能够将其分为两类：,特异性配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。,特异性配体普通是指只与单一或极少种类蛋白质等生物大分子结合配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它抑制剂、激素受体等，它们结合都含有很高特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体特异性是确保亲和层析高分辨率主要原因，但寻找特异性配体普通是比较困难，尤其对于一些性质不很了解生物大分子，要找到适当特异性配体通常需要大量试验。,第20页,通用性配体,普通是指特异性不是很强，能和某一类蛋白质等生物大分子结合配体，如各种凝集素（lectine）能够结合各种糖蛋白，核酸能够结合RNA、结合RNA蛋白质等。通用性配体对生物大分子专一性即使不如特异性配体，但经过选择适当洗脱条件也能够得到很高分辨率。而且这些配体还含有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格廉价等优点，所以在试验中得到了广泛应用。,第21页,22,配基浓度,对亲和势比较低时候（K,L,10,-4,mol/L），增加配基浓度有利于吸附。,增加亲和柱长度来提升吸附率。,配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。,理想配基浓度为1-10mol/L。,第22页,23,配基偶联位置,配基固定化时，其不参加亲和结合部位与载体进行偶联。,腺嘌呤N,6,-氨基接到载体上，对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。,磷酸基接到载体上，对甘油醛-3-磷酸脱氢酶有吸附力。,第23页,24,配基分子大小,选取大分子配基。,小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个“手臂”以消除空间障碍。,第24页,亲和吸附介质配基,（1）酶抑制剂,一些物质，它们并不引发酶蛋白变性，但能使酶分子上一些必需基团（主要是指酶活性中心上一些基团）发生改变，因而引发酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速度降低，能引发这类抑制作用物质称为,酶抑制剂（inhibitor）。,在生物体内蛋白酶抑制剂可与蛋白酶活性部位结合，抑制酶活性，必要时保护生物组织不受蛋白酶损害。酶抑制剂在分子大小和形态上分布较广，有天然生物大分子，也有小分子化合物。,第25页,（2）抗体,利用抗体为配基亲和层析又称为,免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography）。,抗体与抗原之间含有高度特异性结合能力，结合常数普通为10,7,10,12,L/mol。所以，利用免疫亲和层析法，尤其是以单抗为配基免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子有效伎俩。,第26页,（3）A蛋白,A蛋白（protein A）为分子量约42KD蛋白质，存在于黄色葡萄球菌（,Staphylococcusaureus,）细胞壁中，占该细胞壁组成成份约5。A蛋白在确定其为蛋白质之前称A抗原，与动物免疫球蛋白G(immunogloblin G，IgG)含有很强亲和结合作用，结合部位IgG分子Fc片断（Y字型IgG分子主干部分）,A蛋白不与抗体（IgG）抗原结合部位结合，而且任何抗体Fc片断结构都非常相同，,所以A蛋白可作为各种抗体亲和配基，,但不一样抗体结合常数有所不一样。,第27页,（4）凝集素,凝集素(lectin),是与糖特异性结合蛋白质（酶和抗体除外）总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上糖结合部位，不一样凝集素与糖结合特异性不一样。比如，惯用做亲和配基,伴刀豆球蛋白A(concanavalin A，con A),与葡聚糖和甘露糖亲和结合作用较强，而麦芽糖凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）与N-乙酰葡糖胺（N-acetyl-glucosamine）亲和结合作用较强。,第28页,（5）辅酶和磷酸酰苷,各种脱氢酶和激酶需要在辅酶（coenzyme）存在下表现其生物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间含有亲和作用。辅酶主要有辅酶（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadenine dinucleotide，NAD）、辅酶（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NAD phosophate，NADP）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶亲和配基。另外，磷酸腺苷（adenosine 5-monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷（adenosine2，5-diphosphate，ADP）腺苷部分与上述辅酶结构类似，与脱氢酶和激酶一样含有亲和结合作用，可用做这些酶亲和配基。,第29页,（6）过渡金属离子,Cu,2+,、Ni,2+,、Zn,2+,、Co,2+,等过渡金属离子可与N、S和O等供电原子（electron donor atom）产生配位键，所以可与蛋白质表面组氨酸（His）咪唑基、半胱氨酸（Cys）巯基和色氨酸（Trp）吲哚基发生亲和结合作用，其中以His咪唑基结合作用最强。过渡金属离子与咪唑基结合强弱次序是Cu,2+,Ni,2+,Zn,2+,Co,2+,。,第30页,（7）组氨酸,在各种氨基酸中，组氨酸性质比较独特：含有弱疏水性、咪唑环为弱电性。所以组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用。即使这种亲和作用机理尚不十分清楚，但利用固定化组氨酸吸附蛋白质以及吸附蛋白洗脱试验结果表明，静电和疏水性相互作用都有可能参加亲和结合。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点溶液中，固定化组氨酸亲和吸附作用最强，伴随盐浓度增大，亲和吸附作用降低。所以利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大蛋白质，洗脱则可采取增大盐浓度梯度洗脱法。,第31页,（8）肝素,肝素（heparin）,是存在于哺乳动物肝、肺、肠等脏器中酸性多糖类物质，分子量普通为530KD，含有抗凝血作用。肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等含有亲和作用，可用作这些物质亲和配基。肝素亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，伴随盐浓度增大结合作用降低,第32页,活化,基质活化是指经过对基质进行一定化学处理，使基质表面上一些化学基团转变为易于和特定配体结合活性基团。,溴化氰活化法,溴化氰活化法是最惯用活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它能够和伯氨(NH2)反应，主要生成异脲衍生物。反应以下：,介质活化与耦联,第33页,活化耦联过程,20ml、2mol/L碳酸氢钠+20g湿琼脂糖，冰浴4-5min,搅拌过程中加入溴化氰，4-510min,过滤，冷蒸馏水和缓冲液洗涤,加入溶于缓冲液中配基，搅拌2h，4保留,第34页,这种方法,缺点,是溴化氰活化法基质和配体偶联后生成异脲衍生物中氨基pKa10.4，所以通常会带一定正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，,增大了非特异性吸附，,影响亲和层析分辨率。另外溴化氰活化基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现,配体脱落,现象。另外溴化氰有,剧毒、易挥发，,所以操作不便。,第35页,环氧基活化法,在热浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物；,在碱性条件下，其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。,第36页,这种活化方法优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成NC、OC 和SC 键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈洗脱伎俩，另外这种处理方法没有溴化氰毒性。它缺点是用,环氧氯丙烷,活化基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH 为9-13，温度为20-40,。这么条件对于一些比较敏感配体可能不适用。,上面两种方法是比较惯用方法。另外还有甲苯磺酰氯法、双功效试剂法。,第37页,亲和配基耦联密度测定,耦联密度决定了介质,吸附容量,分光光度法,量差法分析,水解作用分析,元素分析法,第38页,间臂分子,当配基分子量较小时，将其直接固定在载体上，会因为载体,空间位阻,，配基与生物大分子不能发生有效亲和吸附作用。,假如在配基与载体之间连接间隔臂，能够增大配基与载体之间距离，使其与生物大分子发生有效亲和结合。,第39页,加入间臂长度要恰当，太短则效果不显著；太长则轻易由疏水性非特异吸附造成弯曲，反而降低吸附效率。,间臂疏水性也需要考虑，应尽可能减小对配基影响。如间臂和配基疏水性较强，则效果不显著。,第40页,第41页,常见亲和色谱,核苷酸及辅酶亲和色谱,固定化金属离子亲和色谱,染料亲和色谱,免疫亲和色谱,基团专一性大分子亲和色谱,第42页,核苷酸及辅酶亲和色谱,指将核苷酸（或辅酶）作为亲和配基固定在色谱介质上进行亲和色谱技术，主要利用核苷酸尤其是辅酶因子和蛋白质之间专一性识别到达分离纯化目标,第43页,第44页,介质制备,碳二亚胺直接法偶联,溴化氢活化琼脂糖连接氨基己酸加入核苷酸溶液,中保留洗涤偶联,间接偶联法,间臂分子和核苷酸活化介质,第45页,吸附和解吸,选择适当缓冲液条件下吸附,普通采取辅酶或盐溶液进行梯度洗脱,第46页,固定化金属离子亲和色谱,蛋白质上氨基酸残基，如,组氨酸咪唑基、半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚基，,有利于蛋白质与固定化金属离子结合，从而到达分离目标。,金属离子如,锌和铜,。,第47页,48,将活化介质与金属螯合剂偶联，再用金属离子溶液处理制成金属螯合亲和层析柱。,金属螯合剂：,亚氨二醋酸、氨基水杨酸、,8-,羟基喹啉、羧甲基氨基酸等,.,第48页,亲和作用机理,静电作用,配位键结合,共价键生产,键,第49页,吸附,采取50mmol/L金属盐溶液经过色谱柱，直至色谱介质吸附饱和。,平衡缓冲溶液洗去未螯合金属离子,加入适宜浓度NaCl和选择适当pH值有利于降低非特异性吸附。,第50页,解吸,吸附蛋白质解吸方法：,改变pH值,竞争性洗脱,采取50-100mmol/LEDTA洗脱，可将蛋白质和金属离子解吸，洗涤，重新上柱平衡，固定所需金属离子。,第51页,pH与氯化铵浓度影响,第52页,固定化亲和离子色谱应用,基因修饰蛋白质纯化,遗传修饰具亲和尾蛋白色谱分离亲和尾切除色谱分离,酶切位点,亲和尾大小,第53页,54,染料亲和色谱,有机染料含有类似于NAD,+,结构。,需核苷酸类物质为辅酶酶，对染料含有一定亲和力。,染料共价偶联到琼脂糖载体上，能制得亲和层析柱。,染料亲和层析已成功分离纯化了各种酶。,第54页,第55页,染料亲和色谱介质制备,配基性质、染料结构和染料取代度是制备过程中需要考虑主要原因。,以下路径能够实现制备：,采取琼脂糖凝胶，染料连接在-OH上，该过程可在一定条件下直接完成。,染料也可经过活性基团和基质偶联，该方法可引入高密度染料。,第56页,吸附蛋白质量增多,选择亲和作用力较小染料有利于解吸,第57页,吸附与解吸,采取磷酸盐缓冲液，在pH6.0-7.0条件下吸附,惯用解吸方法：,增加盐浓度,改变pH值,采取水溶性高聚物,亲和洗脱,最终对杂蛋白进行变性处理，洗涤、缓冲液平衡再生介质。,第58页,免疫亲和色谱,抗原和抗体作用含有高度专一性,而且它们结合亲和力极强。所以用适当方法将抗原或抗体结合到吸附剂上,便可有效地分离和纯化免疫物质。,特点：分离效率高，成本高，而且蛋白质亲和配基不稳定，轻易降解。,第59页,免疫亲和色谱过程,目标蛋白质,抗体制备,上样与洗脱,介质制备,第60页,单抗制备复杂，成本高，但也含有很多优点。,第61页,色谱介质制备：,将抗体经过化学方法结合在色谱介质上,抗体之间交联形成不溶性衍生物,第62页,单抗问世后,不少生物技术企业在研制适宜于培养杂交瘤细胞生物反应器及其培养基。这些大规模生产单抗技术建立和不停完善,将降低免疫亲和色谱吸附剂价格。,伴随新合成基质和偶联化合物出现以及对免疫亲和色谱研究深入,必将使免疫亲和色谱在工业性生产纯化蛋白质应用上逐步得到发展。,第63页,解吸,特异性解吸半抗原置换,非特异性解吸调整pH值、加入试剂破坏氢键、引入离子对、加入表面活性剂、冷蒸馏水洗涤。,第64页,应用,依据研究报道,用单克隆抗体亲和色谱从人血小板破碎液中纯化,血小板第4 因子,(PF4)。将单克隆抗体Sz-95-LgG 与溴化氰活化Spharose 4B 凝胶连接成亲和色谱柱,人血小板破碎液经此亲和色谱柱上样后,经洗脱取得PF4。结果表明,Sz-95-Sepharose 4B 亲和色谱柱偶联率为72%,每1mL血小板破碎液中能够纯化到PF4 18 g。,第65页,基团专一性大分子亲和色谱,指用对某一类结构相近物质有亲和性大分子作为亲和配基偶联在色谱介质上进行色谱技术。,蛋白A亲和色谱,伴刀豆球蛋白A亲和色谱,肝素亲和色谱,第66页,1）分离纯化大分子物质,如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳水化合物蛋白质），Lectin-Sepharose 4B,2)研究酶结构与功效：,分离有生物活性与失去生物活性蛋白质。,亲和色谱应用,第67页,样品,第68页,t-PA纯化酶抑制剂为亲和配基,第69页,干扰素纯化免疫亲和色谱,第70页,脱氢酶纯化色素亲和色谱,第71页,淀粉酶抑制剂纯化固定化金属离子亲和色谱,第72页,基因重组融合蛋白纯化,第73页,