上海交通大学微生物实验实验十一血清学试验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验十一,凝集试验,（,Agglutination assay,）,酶联免疫吸附试验,(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA),实验要求,掌握凝集试验的原理、方法，结果判定和凝集效价的判定。,掌握,ELISA,的基本原理，操作步骤，和,ELISA,的应用。,了解血清学试验在病原微生物学中的应用,一、,抗原的基本概念,抗原：,凡能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与抗体和致敏淋巴细胞发生特异性结合的物质。,抗原决定簇（抗原表位,epitope,）,:,抗原分子上的免疫活性区，负责和免疫活性细胞上的抗原受体和抗体相结合。有的抗原分子上可能只有一个抗原决定簇（抗生素等小分子），有的抗原分子上可能有多个抗原决定簇（如病毒、细菌等）。,用病毒或细菌等抗原免疫动物机体后，机体所产生的抗体则为多克隆抗体，即通常所讲的抗血清。,二、,抗体的基本概念,机体在抗原物质的刺激下所形成一类与抗原特异性结合的血清活性成分为抗体（,Antibody,）。,抗体的化学本质是免疫球蛋白。,所有抗体的单体都由,4,条多肽链构成：两条重链和两条轻链。,轻链,N,端,1/2,和重链,N,端,1/4,的氨基酸组成和序列变化较大，称为可变区（,variable region,VL,VH,）,肽链的其余部分变化不大，称为恒定区（,constant region,CH,CL,）。,可变区是与抗原结合的区域，决定抗体的特异性。,检测抗原,检测抗体,实验步骤,：,所有,试剂回升到室温,：,标记好各自的反应孔（每组,2,人，每组,4,个孔）,：抗体包被，过夜，,洗涤（,该步骤试剂盒已完成,）,：每组,第,-3,孔各加,5,l,样品稀释液,，然后第一孔加提供的大肠杆菌菌液,5,l,，然后递减稀释至,第,2,孔,，从第,2,孔取出,50,l,丢弃。,第,3,孔不加其他物质,，第,4,孔加,50l,阳性标准对照物,作用,30-60min,5,：,倒掉孔中液体，并在吸水纸上拍干，每孔立即加,洗涤液,溶液,l,，室温静置分钟，拍打干净，按上述方法再重复洗涤各孔,3,次。,6,：,每孔加,5,l,已稀释的,酶标记物,，作用,30-60min,7,：洗涤,3,次，同步骤,5,洗涤,8,：加,显色试剂,A,5,l,再加,显色试剂,B,5,l,25,暗处作用分钟,9,：每孔加反应,终止液,l,特别注意安全,，观察颜色变化,.,10:,测定在,nm,处测定吸光度值。,所有的测试条都放回到板中统一测定以空白孔调零。,记录各孔的,OD,值，确定阴性和阳性值。,P/N,值大于,2.1,为阳性,P,为样本的,OD,值,N,为阴性对照的,OD,值,凝集试验的原理,细菌等,颗粒性抗原,与特异性抗体结合后，在,有电解质,的情况下，出现肉眼可见的凝集块，为凝集反应。,可用于快速,鉴定细菌和测定抗体的效价,凝集实验的应用,细菌凝集试验步骤,取一块干净的玻片，分成,2,个区，并在玻片的左上角做好标记,分别吸取,20l,生理盐水,在第一区和第二区,无菌操作，分别挑取适量的菌落，于第一区和第二区，混匀。（或先制备成菌液，再滴加到玻片）,在,第一区加入,20l,阳性血清,，混匀，晃动玻片观察结果。第二区没有凝集，第一区出现凝集块的判定为阳性，即细菌与所提供的抗体具有特异性结合。,实验结果,实验报告（所有的实验报告都要交）,复习做好考试的准备,确定,13,周周三下午考试？,