非酒精性脂肪肝C57BL-6小鼠模型的建立.doc

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潘磊，等. 非酒精性脂肪肝C57BL/6小鼠模型的建立

非酒精性脂肪肝C57BL/6小鼠模型的建立

潘 磊 1，张金彪1，崔荣岗1，赵保辉1，李 华2，张忠勇1，王旭初1(1河北省沧州中西医结合医院，河北省沧州市 061001； 2河间市人民医院，河北省沧州市 061001)

引用本文：潘磊 ，张金彪，崔荣岗，赵保辉，李华，张忠勇，王旭初. 非酒精性脂肪肝C57BL/6小鼠模型的建立[J].中国组织工程研究，2016，20(40):6054-6059.
DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.019 ORCID: 0000-0002-5426-375X(潘磊 )

文章快速阅读：
高脂饲料喂养建立非酒精性脂肪肝小鼠模型

潘磊，男，1982年生，河南省郑州市人，汉族，2005年北京中医药大学毕业，主治中医师，主要从事临床内科疾病方面的研究。

中图分类号:R318
文献标识码:B
文章编号:2095-4344
(2016)40-06054-06
稿件接受：2016-07-09

第8周测定指标：
(1)检测体质量、肝指数、肝组织匀浆超氧化物歧化酶活性；
(2)观察血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、三酰甘油、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇等生化指标变化；
(3)进行病理学检查
模型组30只采用高脂饲料喂养，建立非酒精性脂肪肝模型
对照组30只采用普通饲料喂养
选用健康雄性C57BL/6小鼠60只，随机分为2组
实验结果：
通过高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠模型是理想的动物模型，方法简单，重复性强，可为非酒精性脂肪肝的机制研究及药物治疗提供稳定的动物模型

病理切片示：
模型组小鼠肝组织见大油滴和微小脂滴，并散布全肝，肝细胞肿胀，胞质易见脂肪空泡，肝细胞呈明显炎性改变，说明造模成功

文题释义：
非酒精性脂肪肝：是无过量饮酒史、肝细胞内脂肪堆积以致肝细胞变性为主要特征的临床病理综合征。如不及时控制进一步发展可演变为脂肪性肝炎、肝硬化，甚至有转化为肝癌的潜在可能性。目前，探讨非酒精性脂肪肝的发病机制以及针对性治疗已成为临床热点话题。
C57BL/6小鼠模型：建立与人类非酒精性脂肪肝发病相近的动物模型，探其发病机制，寻找有效的治疗药物逐渐引起重视。文章立足高脂饲料调配，优选C57BL/6小鼠进行建模，方法容易重复。实验通过高脂饲料喂养的方法成功建立了C57BL/6小鼠非酒精性脂肪性肝病模型。

摘要
背景：建立安全可靠、容易重复的非酒精性脂肪肝小鼠模型是研究该病诊治方案的前提条件。
目的：建立C57BL/6非酒精性脂肪性肝病小鼠模型并观察其生化指标的变化特点，为其发病机制及药物治疗提供理论依据。
方法 选用健康雄性C57BL/6小鼠60只，随机分组，对照组30只采用普通饲料喂养，模型组30只采用高脂饲料喂养，建立非酒精性脂肪肝模型。在第8周进行体质量、肝指数、肝组织匀浆超氧化物歧化酶活性检测，观察血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、三酰甘油、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇等生化指标变化，并进行病理学检查。
结果与结论：①病理切片示模型组小鼠肝组织见大油滴和微小脂滴，并散布全肝，肝细胞肿胀，胞质易见脂肪空泡，肝细胞明显炎性改变；②模型组小鼠体质量和肝指数明显高于对照组小鼠，差异有显著性意义(P < 0.05)；但肝组织匀浆超氧化物歧化酶活性明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；③与对照组小鼠相比，模型组小鼠血脂指标中三酰甘油、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇均有明显增高，但高密度脂蛋白胆固醇明显减低，差异有显著性意义(P < 0.05)；④结果提示通过高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠模型是理想的动物模型，方法简单，重复性强，可为非酒精性脂肪肝的机制研究及药物治疗提供稳定的动物模型。
关键词：
实验动物；消化系统损伤与修复动物模型；非酒精性脂肪肝；小鼠模型；高脂饲料；生化指标；三酰甘油；胆固醇；低密度脂蛋白胆固醇；高密度脂蛋白胆固醇
主题词：
模型，动物；脂肪肝；胆固醇；组织工程
基金资助：
河北省中医药管理局科研计划项目(2015290)

6055
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
Establishment of nonalcoholic fatty liver C57BL/6 mouse models

Pan Lei1, Zhang Jin-biao1, Cui Rong-gang1, Zhao Bao-hui1 Li Hua2, Zhang Zhong-yong1, Wang Xu-chu1 (1Cangzhou Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine, Cangzhou 061001, Hebei Province, China; 2Hejian People’s Hospital, Cangzhou 061001, Hebei Province, China)

Abstract
BACKGROUND: The establishment of a safe, reliable and easily repeatable mouse model of nonalcoholic fatty liver disease is the prerequisite for the study of the diagnosis and treatment of the disease.
OBJECTIVE: To establish a C57BL/6 mouse model of nonalcoholic fatty liver disease and observe changes of biochemical indicators, which can provide a theoretical basis for its pathogenesis and drug treatment.
METHODS: Sixty healthy male C57BL/6 mice were randomly divided into a control group of 30 cases (normal diet), and a model group of 30 cases (high fat diet). Models of nonalcoholic fatty liver were established. At 8 weeks, body mass, liver index, and homogenate superoxide dismutase activity in the liver were detected. Changes in serum alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, triglyceride glycerol, cholesterol, high-density lipoprotein cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol were observed. Pathological examination was performed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Pathological sections showed that large droplets and small lipid droplets in the mouse liver and spread the whole liver. Swelling of the liver cells, visible cytoplasmic vacuoles and obviously inflammatory changes in liver cells were observed in the model group. (2) Body weight and liver index were significantly higher in the model group than in the control group (P < 0.05). Superoxide dismutase activity was significantly reduced in the liver (P < 0.05). (3) Triglycerides, cholesterol, and low-density lipoprotein cholesterol levels were significantly higher, but high-density lipoprotein cholesterol levels were significantly lower in the model group than in the control group (P < 0.05). (4) Nonalcoholic fatty liver mouse model is ideal for high-fat diet-induced animal model. The method is simple, repetitive, and can provide a stable animal model for the study on the mechanism of nonalcoholic fatty liver disease and drug treatment.
Subject headings: Models, Animal; Fatty Liver; Cholesterol; Tissue Engineering
Funding: the Scientific Research Plan Project of Hebei Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine, No. 2015290

Cite this article: Pan L, Zhang JB, Cui RG, Zhao BH, Li H, Zhang ZY, Wang XC. Establishment of nonalcoholic fatty liver C57BL/6 mouse models. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(40):6054-6059.

Pan Lei, Attending physician of traditional Chinese medicine, Cangzhou Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine, Cangzhou 061001, Hebei Province, China

6057
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
0 引言 Introduction
非酒精性脂肪性肝病，是一种无过量饮酒史，由各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积，以肝细胞脂肪变性和脂质蓄积为主要特征的临床病理综合征。其病理变化随病程的进展而表现有单纯性脂肪肝、高脂血症、高血压，并被认为是代谢综合征在肝脏的一种病理表现[1]。由于生活质量的提高和社会压力的增大，非酒精性脂肪性肝病越来越普遍，许多研究认为，非酒精性脂肪肝进一步发展可演变为脂肪性肝炎、肝硬化，甚至有转化为肝癌的潜在可能性，对人类健康带来严重的威胁[2]。高脂血症是形成非酒精性脂肪肝的基础，而肝脏的脂肪病变及影响脂质代谢，从而加重高脂血症形成恶性循环，高脂血症性脂肪肝发病机制至今尚未完全明确，理想的治疗药物亦处于迷茫状态。目前，探讨非酒精性脂肪肝的发病机制以及针对性治疗已成为临床热点话题。
为了研究非酒精性脂肪肝发病机制及药物治疗效果，国内外较多的报道了非酒精性脂肪肝动物模型，动物模型的建立主要有先天性、转基因动物、化学物质诱导、病毒诱导以及高脂饲料诱导这5种实验性动物模型[3]，其中利用高脂饲料诱导的脂肪肝动物模型，其病理特点与人类相似，病变有一定的发展过程，成功率高、死亡率低，方法简单易行，容易重复。目前，基本采用大鼠、小鼠、兔等动物来建立动物模型，大鼠和小鼠模型虽然容易建立，但不易长时间用药观察；兔模型抵抗力差，在建模过程中容易继发感染而死亡[4]。并且近几年研究建立的动物模型所采用的高脂饲料的配比、建模时长、给药时间和方式均不一致，这样在研究方面就有不同的参考价值。因此，建立与人类非酒精性脂肪肝发病相近的动物模型，探其发病机制，寻找有效的治疗药物逐渐引起重视。
实验立足高脂饲料调配，优选C57BL/6小鼠进行建模，方法容易重复。文章通过高脂饲料喂养的方法成功建立了C57BL/6小鼠非酒精性脂肪性肝病模型。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 材料 随机对照动物实验，于2015年3至12月在河北省沧州中西医结合医院科研实验室完成。
仪器与试剂：采用日立公司生产的全自动生化分析仪7600检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、三酰甘油、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇等生化指标。试剂盒与质控品均为配套原装试剂，试剂厂家和批号分别为：谷丙转氨酶试剂盒(和光纯药工业株式会社，批号：20140213)，谷草转氨酶试剂盒(和光纯药工业株式会社，批号：20140213)，三酰甘油试剂盒(和光纯药工业株式会社，批号：20140514)，胆固醇试剂盒(和光纯药工业株式会社，批号：20140514)，高密度脂蛋白胆固醇试剂盒(和光纯药工业株式会社，批号：20140320)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒(和光纯药工业株式会社，批号：20140320)。
1.2 实验动物 选择60只健康雄性C57BL/6小鼠，体质量31-45 g，均购于北京司倍福实验动物有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2009-0086。该公司实验室所有动物的饲养条件均为：4只/盒分配于IVC屏障系统中，温度(22±2) ℃，湿度50%-60%，12 h循环照明，小鼠自由摄取食、水。
1.3 造模方法
1.3.1 脂肪肝小鼠模型的建立 60只C57BL/6小鼠进行适应性喂养3 d后，按随机数字表法分组，对照组30只采用普通饲料喂养，模型组30只采用高脂饮食喂养。
肥胖抵抗型小鼠剔除标准[5]：①高脂饲养8周后，体质量无明显增长，体质量低于对照组小鼠平均体质量；②高脂饲养8周后，采血检测血脂指标无明显增长，与对照组小鼠血脂指标平均值差异无显著性意义。
1.3.2 饲料配方 ①普通饲料(%)：面粉25，玉米面30，麸皮15，鱼粉8，骨粉3，奶粉2，豆粕11，食盐0.5，鱼肝油0.5，鸡蛋4，维生素及无机盐1；②高脂饲料(%)：普通饲料80，猪油16，胆固醇2，猪胆盐2。
1.3.3 造模成功标准 喂养8周后，两组全部C57BL/6小鼠先采血，后处死，采血用于化验生化指标，将处死后的小鼠开腹取肝脏，观察肝脏的形状、大小、颜色，切取一块肝组织用甲醛水溶液固定标本，制成石蜡切片，采用苏木精-伊红染色。
光学显微镜下，肝细胞脂肪变性占1/3以上者视为脂肪肝。
1.4 生化指标测定 喂养第8周，检测生化指标，采血前小鼠应空腹不少于8 h，采用心脏穿刺采血方法。采血后，耳缘静脉注射麻醉，仰卧位置于动物实验台上，固定四肢，脱毛后暴漏胸腹部。取出肝脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干后称质量。然后冰浴下制成10%的组织匀浆，用来检测肝指数和肝组织匀浆超氧化物歧化酶活性，然后做病理组织切片。
肝指数=肝脏质量/体质量。
1.5 主要观察指标 所有小鼠均在上午8点采集空腹血，观察谷丙转氨酶、谷草转氨酶、三酰甘油、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇等生化指标变化。采血后处死小鼠，进行肝指数和肝组织匀浆超氧化物歧化酶活性指标检测。
1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件，计量资料采用x(_)±s表示，两组计量资料比较采用t 检验，用方差分析方法检验显著性意义，P < 0.05作为检验水准。

2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析 实验纳入60只小鼠，模型组和对照组各30只，2组小鼠经过8周喂养，2组均无死亡记录，故纳入结果分析的小鼠共60只。在整个造模过程中，对照组小鼠生长及生活习性很正常；模型组小鼠在喂养后期表现出反应迟钝，体型略大，毛色发黄，不精神，懒动。
2.2 模型创新性的改进 实验中模型组在对照组普通饲料基础上增加猪油含量，并且添加了猪胆盐促进食物消化，促进脂肪肝形成和保证小鼠的成活率。
2.3 模型稳定性 非酒精性脂肪肝模型小鼠的喂养方法接近人类非酒精性脂肪肝的形成过程，机制大致相同，可为下一步治疗研究奠定基础。另外，该模型建立方法易于操作和重复，便于模仿人类疾病的机制研究。

图1 两组小鼠的肝脏外观及苏木精-伊红染色组织学图片
Figure 1 Liver and histological images of hematoxylin-eosin staining of mice in both groups
图注：图A为对照组小鼠肝脏外观；B为模型组小鼠肝脏外观；C为对照组苏木精-伊红染色(×200)；D为模型组苏木精-伊红染色(×200)。

表2 两组小鼠生化指标水平比较 (x(_)±s，n=30)
Table 2 Comparison of biochemical indices of mice in both groups

组别
谷丙转氨酶
(U/L)
谷草转氨酶
(U/L)
三酰甘油
(mmol/L)
胆固醇
(mmol/L)
高密度脂蛋白胆固醇
(mmol/L)
低密度脂蛋白胆固醇
(mmol/L)
对照组
87.23±11.21
71.09±10.54
0.78±0.34
1.70±0.56
0.98±0.33
2.73±0.55
模型组
91.02±12.70
88.91±11.98
2.60±0.91
6.98±1.90
0.40±0.31
4.38±1.43
t
1.08
2.11
5.10
6.80
3.99
4.17
P
0.650 > 0.05
0.890 > 0.05
0.012 < 0.05
0.008 < 0.05
0.028 < 0.05
0.020 < 0.05

2.4 肝脏大体标本的观察 对照组小鼠肝脏鲜红色、质韧、边缘锐利(图1A)。
模型组小鼠肝脏体积增大、呈黄色、油腻感、边缘变钝(见图1B)。
2.5 肝组织切片病理结果 对照组C57BL/6小鼠肝细胞呈多边形，细胞质丰富，细胞核位于细胞中央，小叶结构清晰，肝细胞无脂肪变性，汇管区未见炎细胞浸润，余无其他病理改变(图1C)。模型组小鼠肝细胞明显肿胀细胞质内明显可见脂肪空泡，脂滴融合导致细胞核偏位，甚至细胞核消失，肝组织内可见弥漫分布的大油滴和微小脂滴，并散布全肝，肝细胞有明显的炎症变化(见图1D)。
2.6 两组小鼠体质量、肝指数及超氧化物歧化酶活性比较 见表1。
表1 两组小鼠体质量、肝指数、肝组织匀浆超氧化物歧化酶活性比较 (x(_)±s，n=30)
Table 1 Comparison of body mass, liver index, and homogenate superoxide dismutase activity in the liver of mice in both groups

组别
体质量(g)
肝指数(%)
超氧化物歧化酶(U/g)
对照组
33.12±2.45
5.19±3.70
51.20±6.11
模型组
45.09±5.11
7.13±4.86
30.90±3.18
t
6.15
7.24
6.88
P
0.022 < 0.05
0.010 < 0.05
0.013 < 0.05

通过8周的不同喂养方法，模型组小鼠体质量和肝指数明显高于对照组小鼠，而肝组织匀浆超氧化物歧化酶活性明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，该变化特点符合非酒精脂肪性肝病。
2.7 两组小鼠生化指标水平比较 见表2。
与对照组小鼠比较，模型组小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性虽有升高，但差异无显著性意义(P > 0.05)。通过高脂饲料喂养后，模型组小鼠血脂指标中三酰甘油、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平均有明显增高，与对照组小鼠比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)；但模型组小鼠高密度脂蛋白胆固醇相比对照组明显减低，差异有显著性意义(P < 0.05)。提示模型组小鼠已符合高脂血症。

3 讨论 Discussion
非酒精性脂肪性肝病小鼠模型是模拟人类高脂饮食习惯，通过高脂饲料喂养小鼠成功建立的动物脂肪肝模型。文章纳入60只小鼠平均分配为2组，进行高脂饲料喂养比较。精细调整高脂饲料配比，两组小鼠经过8周喂养，均无死亡记录，成功建立了非酒精性脂肪性肝病小鼠模型：非酒精性脂肪性肝病小鼠表现出反应迟钝，体型略大，毛色发黄，不精神，懒动。肝脏体积增大、呈黄色、油腻感、边缘变钝。肝细胞明显肿胀，细胞质内明显可见脂肪空泡，脂滴融合导致细胞核偏位，甚至细胞核消失，肝组织内可见弥漫分布的大油滴和微小脂滴，并散布全肝，肝细胞有明显的炎症变化。本文造模规范，非酒精性脂肪肝模型国内外大部分采用的均为鼠模型[6-10]，具有一定的溯源性。
文章亦观察了生化指标和肝指数、肝组织匀浆超氧化物歧化酶活性变化，通过8周的不同喂养方法，模型组小鼠体质量和肝指数明显高于对照组小鼠，差异有显著性意义(P < 0.05)；而肝组织匀浆超氧化物歧化酶活性明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，该变化特点符合非酒精脂肪性肝病。模型组和对照组小鼠各血脂指标比较，模型组小鼠血脂指标中三酰甘油、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇均有明显增高，与对照组小鼠比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)；模型组小鼠高密度脂蛋白胆固醇相比对照组小鼠明显减低，差异有显著性意义(P < 0.05)，提示模型组小鼠已符合高脂血症的特点。研究结果与相关报道一致[11-12]，但本研究不同之处在于，选择了C57BL/6小鼠，耐活，有较高的抵抗高脂能力，再者采用高含量猪油加猪胆盐[13]，有利于高脂的吸收，不易导致小鼠腹泻死亡，故本实验动物选择和饲料成分的调配保证了动物实验的完整性和科学性。
建立非酒精性脂肪性肝病小鼠动物模型，结合本研究需要注意几点关键因素[14]：①猪油含量应该不能少于15%，较多研究发现第8周解剖小鼠发现肝脏已经脂肪变性，但肝细胞炎症不明显，影响了动物模型的质量。本研究猪油含量16%，动物模型建立良好。②饲养温度、湿度、照明等环境会影响小鼠体质量的增长，温度低、干燥、照明不够会导致小鼠体质量增长不明显，本研究建立小鼠模型的环境温度(22±2) ℃，湿度50%-60%，12 h循环照明，成功构建了小鼠动物模型③肥胖抵抗的产生会影响非酒精性脂肪性肝病小鼠动物模型的建立，有学者通过实验研究发现小鼠HSL和LPL基因表达的差异可能是肥胖和肥胖抵抗小鼠产生的原因[15]，故建立非酒精性脂肪性肝病小鼠动物模型需要剔除肥胖抵抗小鼠，此次研究入选小鼠已经过删选。
目前，国内外已经建立多种非酒精性脂肪性肝病模型[16-32]，大部分基于营养失调来制造小鼠的肝脏细胞脂肪变性，过于追求结果，缩短时间和增加胆固醇及三酰甘油含量，往往会导致小鼠死亡率高，影响了研究的准确度。此次作者实验控制高脂饲料中的猪油含量为16%，并在其中添加了猪胆盐等物质，一般小鼠对高脂肪性食物有抵抗作用，对胆固醇的吸收率为40%左右，所以添加入胆酸盐或甲基硫氧嘧啶等物质，可帮助高胆固醇或高脂的摄入和吸收。实验建立的小鼠动物模型在第8周成功形成了非酒精性脂肪肝模型，时间短，方法简单，容易重复，较为适合临床研究及药物选择、施治方面的科研工作，再者，小鼠模型的病理机制接近于人类，造模过程类似于人类非酒精性脂肪性肝病的形成机制，故本文建立的动物模型适于医学转化，为人类该病的诊治研究奠定了模型基础。

致谢：感谢河北省沧州中西医结合医院科研实验室和实验诊断科各位老师给予的帮助。
作者贡献：实验设计为潘磊、张金彪；实验实施为崔荣岗；实验评估为赵保辉、李华；实验数据收集为张忠勇、王旭初。
利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。
伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。
文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。
作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。
文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

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