免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座.pptx

Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,内容提要,抗原和抗体,ELISA,Western blot,免疫组化（免疫荧光）,Real Time PCR,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第1页,抗原和抗体,抗原基本知识,抗体基本知识,多克隆抗体,单克隆抗体,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第2页,抗原和抗体,抗原基本知识,定义：抗原（,antigen,）是能够刺激机体产生免疫应答效应物质（抗体和致敏淋巴细胞），并能与之特异性结合物质。,两个基本特征：,免疫原性,（,immunogenicity,）：能够刺激机体产生抗体和效应,T,淋巴细胞免疫反应能力。,抗原性,（,antigenicity,）：与免疫反应最终产物（如抗体和,/,或,T,细胞表面受体）特异结合能力。,完全抗原与半抗原,抗原表位（,Epitopes,）：抗原决定簇。,存在于抗原分子中，决定抗原特异性基本结构,或化学基团。是与,TCR/BCR,及抗体结合基本单位。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第3页,抗原和抗体,抗体基本知识,定义：,antibody,。指机体免疫系统在抗原刺激下，由,B,淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成浆细胞所产生、可与抗原发生特异性结合免疫球蛋白。,结构与功效：,1,）重链轻链；,2,）超变区是抗原结合位，与抗原表位互补；,3,）抗体,Fc,片段上两结构域共同与细胞膜,Fc,受体结合，发挥不一样生物学效应。,应用,医学应用：,1.,诊疗：各类血清学检测，抗人球蛋白测试，早孕检测等。,2.,治疗：单克隆抗体疗法（类风湿性关节炎多发性硬化症等），肿瘤治疗。,科研应用：免疫共沉淀、免疫印迹、染色质免疫共沉淀、免疫荧光技术、,ELISA,等。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第4页,抗原和抗体,多克隆抗体,抗原多个表位诱导各种,B,细胞克隆增殖与分化，产生各种抗体混合物。,特点：,多抗是单抗混合物，群体综合性质。,更轻易捕捉抗原。,特异性相对较差：交叉反应,抗体纯化、标识难。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第5页,抗原和抗体,多克隆抗体制备,动物选择：,兔子（,rabbit,）：最惯用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰,大耳白）,小鼠（,mouse,）：可用于自制抗体，但抗体量极少。（,BALB/C,昆明鼠）,大鼠（,rat,）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（,Wistar,大鼠）,羊（,sheep,、,goat,）：惯用于较大批量地生产抗体（商品）。马（,horse,）：惯用于大批量生产治疗用抗体（商品）。,豚鼠（,guinea pig,）：国外试验室惯用。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第6页,抗原和抗体,多克隆抗体制备,延长抗原作用时间,增强吞噬作用,刺激抗原提呈,促进细胞因子分泌,诱导淋巴细胞分裂、增殖,影响,T,细胞“极化”,佐剂作用机理：,抗原制备：,商品化或自行表示,基础免疫：,首次，抗原用量大，用弗式完全佐剂（含矿物油,卡介苗等,),。,加强免疫：,第,2,次以后，抗原量减半，屡次，间隔,2-4,周，用,弗,式不完全佐剂,(,不含卡介苗,).,取血测效价：,加强免疫两次或三次以后第,7,天取血。,放血制备血清：,可一次放血,(,颈动脉,),也可屡次取血,(,耳静脉,),过程（简单了解）：,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第7页,抗原和抗体,单克隆抗体,单个抗原表位诱导单种,B,细胞克隆增生与分化，产生单克隆抗体。,什么情况下需要制备单克隆抗体,？,目标蛋白有结构类似物,抗原不纯，无法分开,多抗效果不好（已排除非特异性反应）,希望将抗体用于治疗，研制成药品,希望将抗体用于诊疗，研制成诊疗试剂,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第8页,ELISA,基本原理,方法种类,试验操作,应用,常见问题分析,写作实例,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第9页,ELISA,基本原理,全称：酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,原理：,（,1,）固相抗原或抗体，即“免疫吸附剂”；,（,2,）酶标识抗原或抗体，称为“结合物”；,辣根过氧化物酶（,HRP,）、碱性磷酸酶（,AP,）,（,3,）酶反应底物。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第10页,ELISA,方法种类,直接法,检测,Ag,将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标识一级抗体，即可测定抗原总量。,优势,：操作手续简短，因无须使用二抗可防止交互反应。,缺点,：试验中一抗都得用酶标识，但不是每种抗体都适合做标识，费用相对提升。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第11页,ELISA,方法种类,间接法,检测,Ab,用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标二抗，加底物显色。,优势,：二抗能够加强信号，而且有各种选择能做不一样测定分析。不加酶标识一级抗体则能保留它最多免疫反应性。,缺点,：交互反应发生机率较高。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第12页,ELISA,方法种类,双抗体夹心法,检测,Ag,将已知抗体连接在固相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶标二抗结合，形成抗体,-,待测抗原,-,酶标二抗复合物，复合物形成量与待测抗原成正比。,适合用于一些大分子含有最少双表位抗原，而不能用于小分子半抗原检测。,优势,：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。,缺点,：抗原一定得拥有两个以上抗体结合部位。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第13页,ELISA,方法种类,其它方法,双抗原夹心法、竞争法、捕捉法、,基于细胞法,酶,底物,颜色,HRP,3,3,5,5-,四甲基联苯胺,(TMB)+H,2,O,2,黄色,(450nm),邻苯二胺,(OPD)+H,2,O,2,橙红,(429nm),5-,氨基水杨酸,(5-ASA)+H,2,O,2,棕色,(550nm),鲁咪诺,+H2O2,荧光,AP,对硝基苯磷酸酯,(P-NPP),黄色,(405nm),4-,甲基伞基磷酸酯,(4-MuP),荧光,-,半乳糖苷酶,4-,甲基伞基,-,半乳糖苷,荧光,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第14页,ELISA,试验操作,包被,：,聚苯乙烯板,封闭,：,0.12%BSA，5%脱脂奶粉，1%明胶，10%小牛血清,孵育,：,加抗原,/,抗体,洗涤,：,PBST,、,TBST,、,PBS,等,显色,：,避光发色,结果测定：,吸光值,待测孔（,P,）与阴性对照孔（,N,）比值（,P,：,N,）大于,1.5,或,2,者为阳性。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第15页,ELISA,应用,ELISA,应用范围很广，而且正在不停地扩大，标准上,ELISA,可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，能够直接定量测定体液中可溶性抗原。,检验抗原和半抗原方面,：在,内分泌方面,已经用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等；在,血液学,方面可用于检验凝固因子（如第,凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（,Hapto Globin,）等；在,肿瘤方面,已试用检验甲胎蛋白（,AFP,）癌胚抗原（,CEA,）。,检验抗体方面,：用,ELISA,间接法检验抗体，已取得对各种传染病和寄生虫病血清学诊疗，亦开始广泛用于现场流行病学调查。在,寄生虫病,方面，它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、囊虫、弓浆虫、肺吸虫、肝吸虫、血丝虫、旋毛虫病等血清学诊疗；在,免疫性疾病,方面有试用作本身疫病抗体测定以及对过敏诊疗，比如检测各种过敏原抗体DNA,抗体及甲状腺球蛋白抗体，红斑性痕疮抗体等等；在,卫生学方面,，可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第16页,ELISA,常见问题分析,阴性对照出现阳性结果,试剂或样品可能被污染，或者因为孔之间溅洒出现交叉污染。,酶标板洗板不彻底。,抗体量过多造成非特异结合。,夹心法、捕捉法中检测抗体与包被抗体/抗原交互反应。,酶标板整体背景高,抗体非特异性结合。,底物结合浓度过高或反应时间过长。,底物溶液不新鲜或被污染。,底物孵育过程没有避光。,吸光度数值偏高或偏低,样品中待检抗原含量太低会造成测试结果偏低。,加入抗体量不适当也会造成结果偏低或偏高,孵育时间不够长会造成检测结果偏低,孵育温度不适合。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第17页,ELISA,写作实例,详细描述,IF=3.534,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第18页,ELISA,写作实例,抗体浓度,抗原种类,Abs,IF=3.534,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第19页,ELISA,写作实例,引用文件,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第20页,ELISA,写作实例,浓度,时间,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第21页,ELISA,写作实例,操作手册,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第22页,ELISA,写作实例,浓度,组别,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第23页,Western blot,定义及原理,应用,试验操作,常见问题分析,半定量分析,写作实例,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第24页,定义及原理,定义：又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后 利用对应抗体来检测目标蛋白一个方法。,原理：,Western blot,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第25页,应用,Western blot,Western Blot,被广泛地应用于蛋白质研究，基础医学和临床医学研究。,目标蛋白表示特征分析,目标蛋白与其它蛋白互作,目标蛋白组织定位,目标蛋白半定量分析,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第26页,试验操作,Western blot,转膜,免疫反应,显色或发光,蛋白定量,SDS-PAGE,蛋白提取,封闭,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第27页,试验操作,Western blot,步骤一、蛋白提取,WB,过程中最主要一点就是确定目标蛋白在组织、细胞中,定位,，选择适当提取方法把目标蛋白提取出来才能进行后续试验。,预防蛋白质降解,冰上操作,加入蛋白酶抑制剂,Bac-,细菌蛋白抽提试剂,Mam-,哺乳动物蛋白抽提试剂,Yea-,酵母蛋白抽提试剂,Tis-,组织蛋白抽提试剂,Nc-,细胞核,/,浆蛋白抽提试剂,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第28页,试验操作,Western blot,步骤二、蛋白定量,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第29页,试验操作,Western blot,步骤三、,SDS-PAGE,E,SDS,是一个离子性表面活性剂,它有强离子性硫酸根离子也带有疏水性长碳链。,当,SDS,与蛋白质混合时，它会以其碳链与蛋白质疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以磺酸根离子外露与水分子作用。大多数蛋白质和,SDS,平均结合量是,1:1.4(,以重量为单位,),，而蛋白质结合固定百分比,SDS,后，因为,SDS,带强负电荷，使蛋白质原先所带电荷显得微不足道,且每单位重量蛋白质所带电荷一致，所以不一样蛋白质迁移率大小就主要由蛋白分子大小这一主要原因决定。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第30页,试验操作,Western blot,步骤三、,SDS-PAGE,凝胶浓度与蛋白分离范围,凝胶浓度（）,线性分离范围（,KD),15,12-43,10,16-68,7.5,36-94,5.0,57-212,Staking gel,Separating gel,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第31页,试验操作,Western blot,步骤四、转膜,膜选择：,NC,、,PVDF,、尼龙膜,转膜方法：,半干转、湿转,转膜确认：,立春红染色、蛋白预染,Marker,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第32页,试验操作,Western blot,步骤四、转膜,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第33页,试验操作,Western blot,步骤四、转膜,半干转,用滤纸吸,B,uffer来做转移体系转移方法；,适合转移小分子量蛋白；,半干转电流大小是按照面积来算，时间是依据,蛋白分子大小定；,56mA/膜 1h,湿转,将膜、胶、滤纸整个浸泡在,B,ufferTank里转移,方法；,适合转移大分子量（100KD以上）蛋白；,湿转电流是恒定，时间也是依据分子量而定；,300mA,1h,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第34页,试验操作,Western blot,步骤四、转膜,丽春红,可逆染色，检测转膜效率。,与下游,WB,检测完全兼容，无任何干扰。,蛋白预染,Marker,实时监测,分子量参考,与目标蛋白同时转移至印迹膜上，检测转膜效率。,对转膜后凝胶进行考染,转膜确认,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第35页,试验操作,Western blot,步骤五、封闭,为预防一抗或,/,和二抗与膜非特异性结合产生高背景，所以需要进行膜封闭，去除非特异结合位点。,惯用封闭液：,Blocking Buffer：3,%BSA,5%Milk,Room Temperature 1 h,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第36页,试验操作,Western blot,步骤六、抗体孵育,一抗,选择,：,单,克隆,抗,体,或者,多,克隆,抗,体,直接标识抗体,或者,未标识抗体,抗体所检测种属,：,人、小鼠、大鼠等,注意,：抗体稀释倍数是由底物和待检测蛋白质丰度决定，,为了取得最正确试验结果，强烈推荐进行,预试验,，以确定详细试验参数.,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第37页,试验操作,Western blot,步骤六、抗体孵育,二抗选择：,抗小鼠,抗兔,抗大鼠,抗人,抗山羊,抗鸡,抗豚鼠,抗马,标识物,HRP、AP、Biotin、荧光标识、无标识,荧光标识抗体,红色,Cy3,、,TRITC,、,RRX,、,Texas Red X,、,Dylight549,、Dylight 594、Dylight 649,绿色,FITC、Cy2、Dylight488,蓝色,AMCA,近红外线,Cy5,依据一抗物种：,依据标识物：,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第38页,试验操作,Western blot,步骤七、检测方法,化学发光法：,惯用,HRP,酶标系统,显色底物为,ECL,鲁米诺（,Luminol,）,特点：,无毒害、灵敏度高、速度快；特异性好、节约抗体、线性宽；,可重新剥离检测。,化学显色法：,惯用,酶标系统,HRP,显色底物为,TMB,和,DAB,酶标系统,AP,显色底物为,BCIP,和,NBT,特点：,方便、廉价；,含有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢；,检测后膜不可重新剥离检测。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第39页,试验操作,Western blot,步骤七、检测方法,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第40页,常见问题分析,Western blot,没有阳性条带或很弱,可能原因,一抗、二抗等不匹配,一抗或,/,和二抗浓度低,转膜不充分,或洗膜过分,过分封闭,二抗受叠氮钠抑制,曝光时间过短,封闭剂与一抗或二抗有交叉反应,验证或处理方法,认真选取一抗与组织种属,可设置内参以验证二级检测系统有效性。,使用温和去污剂，如,TWEEN20,，或更换封闭剂（惯用脱脂奶、,BSA,、血清或明胶,延长曝光时间,所用溶液和容器中防止含有叠氮钠,(HRP,抑制剂,),更换适当封闭剂、降低封闭剂浓度或降低封闭时间,使用丽春红,S,检测转膜效果,PVDF,膜需浸透，需正确转膜操作,勿过分洗膜,增加抗体浓度，延长孵育时间,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第41页,常见问题分析,Western blot,背景高,一抗或二抗与封闭剂,有交叉反应,可能原因,封闭不充分,一抗浓度过高,抗体孵育温度过高,二抗非特异性结合,洗膜不充分,膜干燥,验证或处理方法,延长封闭时间，更换适当封闭剂（脱脂奶粉，,BSA,，血清等）,增加一抗稀释倍数,低温孵育（如,4),设置二抗对照,(,不加一抗,),降低二抗浓度,在孵育和洗涤液中加入,Tween-20,以降低交叉反应,.,增加洗涤次数,确保充分反应液，防止出现干膜现象,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第42页,常见问题分析,Western blot,条带位置不对,可能原因,表示蛋白含有各种修饰形式（乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、等）,蛋白样本降解,一抗浓度过高,二抗浓度过高，产生非特异性结合,抗体未纯化,蛋白存在二聚体或多聚体,验证或处理方法,查文件，使用去修饰试剂使蛋白恢复其正确大小,使用新鲜制备标本，并使用蛋白酶抑制剂,降低抗体浓度，能够降低非特异性条带,降低抗体浓度，增加二抗对照，选择特异性更强，只针对重链二抗,使用单克隆或亲和纯化抗体，降低非特异条带,SDS-PAGE,电泳上样前，煮沸,10min,，以增强蛋白质解聚变性,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第43页,Western blot,半定量分析,灰度分析软件：,Quantity One,、,BandScan,、,BandLeader,、,Sigma Gel,、,Image J,等,惯用蛋白质内参有,GAPDH,和细胞骨架蛋白,beta-actin,或,beta-tubulin,。,内参,：普通是指由管家基因编码表示蛋白。,在各组织和细胞中表示相对恒定，借助检测每个样品内参量就能够用于校正蛋白质定量、上样过程中存在试验误差，确保试验结果准确性。,目标蛋白灰度值除以内参灰度值以校正误差，所得结果代表某样品目标蛋白相对含量。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第44页,ELISA,与,Western blot,比较,Western blot,能够看到特异性条带，不过定量比较麻烦；,ELISA,能够直接读出浓度，不过假如抗体有非特异性结合，那得到数值就不可信；,WB,只能半定量，不过能够检测细胞膜蛋白，这点,ELISA,做不到；,WB,所检测普通是抗原，而,ELISA,抗原抗体都能够检测；,WB,所检测抗原能够知道其分子量大小，或是否是多聚体、降解产物等，,WB,能够确定所用抗体是与哪种蛋白起作用，而,ELISA,无能为力；,WB,一次处理量就是一块胶板，最多,10-20,个样品。,ELISA,一块,96,孔板一次能够处理,96,个样本，能够设置多个复孔、对照、梯度样等来提升检测可信度。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第45页,写作实例,Western blot,详细描述,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第46页,写作实例,Western blot,显影结果,+,定量分析,DEDD:Death Effector Domain-containing DNA binding protein,相对表示量,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第47页,写作实例,Western blot,IF=9.284,愈加详细,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座第48页,写作实例,Western blot,IF=9.284,Metformin,：二甲双胍（抗糖尿病药、降血糖药）,人乳腺癌细胞株,MCF-7,mTOR signaling pathway,显影结果差异显著,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第49页,写作实例,Western blot,不作方法描述,IF=31.477,细胞因子刺激,磷酸化水平,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第50页,免疫组化,定义及原理,应用,分类及试验方法,结果分析,常见问题分析,写作实例,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第51页,定义及原理,免疫组化,定义,：用标识特异性抗体对组织切片或细胞标本中一些化学成份分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（,immunohistochemistry,）技术或免疫细胞化学（,immunocytochemistry,）技术。,原理,：依据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中抗原先和一抗结合，再利用一抗与标识生物素、荧光素等二抗进行反应，最终经过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成份，在光学显微镜或荧光显微镜下可清楚看见细胞内发生抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定一些化学成份分布和含量。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第52页,应用,免疫组化,用途,:,对目标蛋白进行定性、定位和定量分析。,优点：能够明确目标蛋白细胞定位、亚细胞定位及各种蛋 白之间相互位置关系,不足：敏感性差，蛋白定量效果差。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第53页,分类,免疫组化,按标识物质种类,如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为,免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法,等。,按染色步骤,可分为,直接法,（又称一步法）和,间接法,（二步、三步或多步法）。,按结合方式,分为,抗原,-,抗体结合,，如过氧化物酶,-,抗过氧化物酶（,PAP,）法；,亲和连接,，如卵白素,-,生物素,-,过氧化物酶复合物（,ABC,）法、链霉菌抗生物素蛋白,-,过氧化物酶连结（,SP,）法等；,聚合物链接,，如即用型二步法。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第54页,免疫荧光法,免疫组化,免疫荧光法,:,最早建立免疫组织化学技术。,基本原理：它利用抗原抗体特异性结合原理，先将已知抗体标上,荧光素,，以此作为探针检验细胞或组织内对应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中荧光素受激发光照射后即会发出一定波长荧光，从而可确定组织中某种抗原定位，进而还可进行定量分析。,优点：因为免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊疗、检验中应用较广。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第55页,免疫荧光法免疫组化,固定,：,醛类（惯用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）,、,醇类（惯用乙醇）,、,其它（丙,酮）,，,4,固定过夜或室温固定,0.5h,通透化,：,0.1%TritonX-100,，置于冰上,15min,。,封闭,：,1,BSA 37,封闭,1h,。,一抗孵育,：,4,孵育过夜或室温孵育,2h,。,二抗孵育,：放上玻片，室温孵育,1h,。,染核,：加入,DAPI,，室温避光染色。,封片,：甘油封片。,镜检,：,4,避光保留,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第56页,免疫荧光法,免疫组化,Fluorochrome,Excitation(nm),Emission(nm),Color,DAPI,365,420,Blue,Fluorescein,495,525,Green,Hoechts 33258,360,470,Blue,R-phycocyanin,555,618,634,Red,B-phycoerythrin,545,565,575,Orange,red,R-phycoerythrin,480,545,565,578,Orange,red,Rhodamine,552,570,Red,Texas red,596,620,Red,惯用荧光素,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第57页,免疫荧光法,免疫组化,3T3 Line,PtK1 Line,NBL-6 Line,RK13 Line,Longitudinal Fissure,大脑纵裂,Blood Vessels,Cerebellum,小脑,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第58页,即用型二步法,免疫组化,惯用标识酶及其显色底物,辣根过氧化物酶,(horseradish peroxidase,HRP),：,DAB,或,AEC,显色系统,（结果染为棕黄色）,碱性磷酸酶,(alkaline phosphatase,AP),：,NBT/BCIP,（结果染为蓝黑色）,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第59页,ABC,法,免疫组化,一抗、生物素化二抗、,ABC,复合物（亲和素,+,酶标生物素）,产生多级放大，从而提升生物反应敏感性和特异性。,生物素和亲和素有很强亲和力，比抗原,-,抗体亲和力要高一万倍以上。,卵白素,-,生物素,-,过氧化物酶复合物,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第60页,SP,三步法,免疫组化,脱蜡与水化,2.,细胞通透、封闭内源性过氧化物酶,抗原修复、暴露抗原决定簇,封闭非特异性蛋白,一抗孵育,生物素标识二抗二抗孵育,SP(,链霉亲和素,-,过氧化物酶,),反应,显色,复染、脱水、透明、封片,细胞通透、封闭内源性过氧化物酶,ABC,法基础上深入改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合。,灵敏特异性低，成本低。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第61页,结果分析,免疫组化,阳性着色细胞计数法：在,40*,光镜下，随机选择不重合,10,个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组,36,张不一样动物组织切片，然后进行组间比较即可。,Melatonin,：褪黑素,Hy:hypoxia,缺氧,Nestlin:,巢蛋白，特异性表示在神经上皮干细胞,神经干细胞增殖分化,Journal of Pineal Research IF=7.812,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第62页,结果分析,免疫组化,灰密度分析法：经过在不一样组别和不一样动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用,Image pro plus,进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第63页,结果分析,免疫组化,评分法：经过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（,03,分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（,14,分为,025%,、,2650%,、,5175%,、,76100%,），最终能够分数相加，再进行比较。,相同曝光时间、相同显色时间,大致分为阴性、弱阳性、阳性,B,D,C,A,E,F,G,H,Normal,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第64页,常见问题分析,免疫组化,原因,处理方法,抗体浓度过高或抗体孵育时间过长,降低抗体滴度（普通指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或4过夜,孵育温度过高，孵育温度超出37,普通室温20-28,DAB,显色时间过长或,DAB,浓度过高,显色时间不能超出5-10分钟，以显微镜下观察为准,染色过强,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第65页,常见问题分析,免疫组化,染色,弱,原因,处理方法,抗体浓度过低，孵育时间过短,提升抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟,试剂超出有效使用期,及时更换试剂,操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释,每步滴加试剂前沥干切片中多出缓冲液（但预防切片干燥）,室温太低，低于,15,若室温低于,15,度，要改放在,37,孵育箱孵育,30-60,分钟（或,4,冰箱过夜）,蛋白封闭过分,封闭时间不要超出10分钟,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第66页,常见问题分析,免疫组化,染色,阴性,原因,处理方法,操作步骤错误,重新试验，设置阳性对照,组织中无抗原,设置阳性对照片，以验证试验结果,一抗与二抗种属连接错误,仔细确定一抗与二抗种属无误,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第67页,常见问题分析,免疫组化,非特异性背景染色,原因,处理方法,操作过程中冲洗不充分,每步冲洗,35,组织中含过氧化物酶未阻断,可再配置新鲜,3%H2O2,封闭，孵育时间延长,组织中含内源性生物素,正常非免疫动物血清再封闭,血清蛋白封闭不充分,延长血清蛋白封闭时间,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第68页,写作实例,免疫组化,IF=1.959,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第69页,写作实例,免疫组化,IF=5.006,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第70页,写作实例,免疫组化,IF=3.534,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第71页,写作实例,免疫组化,IF=3.534,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第72页,Real Time PCR,几个概念,Real Time PCR,定义,应用,原理,结果分析,写作实例,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第73页,Real Time PCR,几个概念,PCR,，,RT-PCR,，,Real Time PCR,，,qPCRPCR,：,P,olymerase,C,hain,R,eaction,。,RT-PCR,：,R,everse,T,ranscription,PCR,，,首先经反转录酶作用从,RNA,合成,cDNA,，再以,cDNA,为模板，扩增合成目标片段。可对基因表示进行相对定量；也有称,Real time PCR,为,RT-PCR,。,Real Time PCR,：实时聚合酶链反应。,qPCR,：,Real time,Q,uantitative,PCR,Detecting System,（,Real Time PCR,），实时荧光定量,PCR,。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第74页,Real Time PCR,定义,荧光定量,PCR,是经过荧光染料或荧光标识特异性探针，对,PCR,产物进行标识跟踪，实时在线监控反应过程，结合对应软件对结果进行分析，计算待测样品初始模板量。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第75页,Real Time PCR,应用,Real Time PCR,用途,定性分析,定量分析,病毒及病原菌定量分析,导入基因拷贝数解析,GMO,定量检测,差异显示结果验证,基因芯片结果验证,siRNA,效果确认,mRNA,表示量分析,病毒及病原菌检测,物种判定,基因分型,绝对定量,相对定量,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第76页,Real Time PCR原理,使用,Real Time PCR,扩增装置实时监测,PCR,扩增产物并进行分析方法。,激发光,发射光,Ct,值,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第77页,Real Time PCR,荧光定量,PCR,与普通,PCR,比较,实时在线监控,对样品扩增整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物增加，直观地看到反应对数期,降低反应非特异性,使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提升了,PCR,反应特异性,增加定量准确性,全程监控，准确定量,结果分析更加快捷方便，,无需电泳,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第78页,Real Time PCR,扩增曲线（,primary curve,）,伴随,PCR,反应进行，扩增产物不停累积，荧光信号强度不停增加。每经过一个循环，搜集一次荧光信号，经过荧光强度改变监测扩增产物量改变，从而得到扩增曲线图。,PCR,扩增曲线实际上并不是一条标准指数曲线，而是呈,S,型,曲线,。,纵坐标：,Rn,（荧光值）,横坐标：,cycle number,（循环数）,线性期,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第79页,Real Time PCR,荧光阈值（,threshold,）,基线,(baseline),：,普通把荧光,PCR,前,15,个循环信号作为荧光本底信号，即样本荧光背景值和阴性对照荧光值。,荧光阀值,(threshold),：,扩增曲线上人为设定一个值,-,缺省设置：,PCR,反应前,3-15,个循环荧光本底信号标准偏差,10,倍,（机器自动设置）。,-,手动设置：大于样本荧光背景值,手工调整荧光阈值示意图,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第80页,Real Time PCR,C,t,值,(Cycle Threshold),Ct,值,：,在荧光,PCR,扩增过程中，当扩增产物荧光信号到达设定阈值时所经过扩增循环次数,。,Ct,值特点,：,相同模板进行,96,次扩增，平台期,DNA,拷贝数波动很大，但,Ct,值相对固定；,Ct,值则极具重现性,起始拷贝数,越多,，经过循环数就,越少,，,Ct,值也就越小,，反之亦然。正常,CT,值范围在,18-30,之间，过大和过小都将影响试验数据精度。,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第81页,Real Time PCR,温度,荧光强度,熔解曲线分析,PCR,过程结束后，将温度迟缓升高，此时双链,DNA,解链成为单链，内掺染料会被释放出来，荧光信号逐步减弱。,将温度对荧光强度改变求导。,(-dI/dT),峰值代表斜率改变最大时温度值，即,Tm,，其值与双链,DNA,长度、,GC%,含量相关，可部分代表序列特异性,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第82页,Real Time PCR,熔解曲线分析,融解曲线分析，单一峰,无非特异性荧光,定量准确,融解曲线分析，出现杂峰,其它产物出现非特异性荧光，所以定量不准确,引物不特异（杂带或者二聚体）或者掺入,gDNA,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第83页,Real Time PCR,TaqManProbe,Cycling,Probe,Molecular,Beacon,etc.,SYBR,Green I,荧光染料嵌正当,荧光探针法,Real Time PCR,检测方法,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第84页,Real Time PCR,荧光染料嵌正当（,SYBR Green I,）,SYBR Green I,：是一个能结合于全部,dsDNA,双螺旋小沟区域,含有绿色激发波长染料。,SYBR Green I,只与双链,DNA,结合才能发出荧光。,荧光信号与双链,DNA,分子数成正比，伴随扩增产物增加而增加。,SYBR Green I,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第85页,Real Time PCR,荧光染料嵌正当（,SYBR Green I,）,Primer,退 火,F,F,F,F,Pol.,F,Primer,Pol.,延 伸,F,F,F,F,F,F,Primer,热变性,F,F,F,F,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第86页,Real Time PCR,结果分析,经过标准曲线对对照样品、检测样品目标基因及管家基因进行定量，然后以管家,基因定量结果为依据对目标基因进行比值校正，求得相对值即为相对表示量。,相对值,=,校正值,=,目标基因定量结果,管家基因定量结果,检测样品校正值,对照样品校正值,经过对照样品、检测样品目标基因及管家基因,Ct,值，然后以管家基因,Ct,值为,依据对目标基因进行差值校正，最终求得相对表示量。,双标准曲线法,Ct,法,相对值,=2,-,Ct,(,目检,-,管检,),-,Ct,(,目对,-,管对,),免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第87页,写作实例,Real Time PCR,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第88页,写作实例,Real Time PCR,IF=5.006,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第89页,谢谢,免疫学实验技术及荧光定量PCR专家讲座,第90页,