核酸凝胶电泳终专家讲座.pptx

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结构。分子质量较小,DNA,分子比分子质量较大,DNA,分子，含有较紧密构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子质量涣散型开环,DNA,分子或线性分子要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离,DNA,片段基本原理。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第5页,常见电泳仪,水平电泳仪,垂直电泳仪,核酸凝胶电泳终专家讲座,第6页,脉冲电泳,核酸凝胶电泳终专家讲座,第7页,电泳梳子,电泳槽,核酸凝胶电泳终专家讲座,第8页,电泳仪,核酸凝胶电泳终专家讲座,第9页,一,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质一个电泳方法。对于分子量较大样品，如大分子核酸、病毒等，普通可采取孔径较大琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶含有网络结构，物质分子经过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到阻力大，所以在凝胶电泳中，带电颗粒分离不但取决于净,电荷,性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提升了分辨能力。凝胶分辨能力 同凝胶类型和浓度相关。,分辨,DNA,片段范围,0.250kb,；而要分辨较小分子质量,DNA,片段，则要用聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为,11000bp,。凝胶浓度高低影响凝胶介质孔隙大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度越低，孔隙就增大，其分辨能力也就越弱。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第10页,DNA,分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。,DNA,分子在高于等电点,pH,溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。因为糖,-,磷酸骨架在结构上重复性质，相同数量双链,DNA,几乎含有等量净电荷，所以它们能以一样速率向正极方向移动。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第11页,琼脂糖凝胶电泳操作,操作步骤：,配胶,EB,染色 点样,胶图分析 成像拍照 电泳,核酸凝胶电泳终专家讲座,第12页,1,、配胶,按所要分离,DNA,分子大小，称取适量,琼脂糖粉末,，放入锥形瓶，加适量,1TAE,电泳缓冲液；,然后置,微波炉,内加热摇匀至完全溶化成透明状，适当冷却后,倒入胶托,；胶完全冷凝后放入电泳槽，,电泳槽里缓冲液必须没过胶面。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第13页,铺 胶,核酸凝胶电泳终专家讲座,第14页,凝胶凝固后取出梳子,核酸凝胶电泳终专家讲座,第15页,加缓冲液,核酸凝胶电泳终专家讲座,第16页,2,、,EB,染色,溴化乙锭是一个扁平分子，能够嵌入核酸双链配对碱基之间。在在紫外照射,EB-DNA,复合物时，出现不一样效应。,注意：严格区分污染区和非污染区,，不把污染区物品拿到非污染区碰过,EB,手套要及时丢弃！,核酸凝胶电泳终专家讲座,第17页,3,、点样,依据样品不一样可分两种点样体系：,A,、样品,+6Xloading buffer,B,、样品能够直接点样,核酸凝胶电泳终专家讲座,第18页,4,、电泳,点完样后连接电源，设置好电源参数，开始电泳。当溴酚蓝带（蓝色）移动至一定长度即可停顿电泳。,电压要求：,20V/CM,胶，在样品出孔用低压（,3V/CM,，,15min,）,然后调回标准电压，跑出条带很好。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第19页,成像拍照,核酸凝胶电泳终专家讲座,第20页,胶图分析,核酸凝胶电泳终专家讲座,第21页,注意事项,核酸凝胶电泳终专家讲座,第22页,一、配胶,1.,电子称使用，要时刻注意保持电子称,准确性,，保持清洁，依据不一样浓度胶称取琼脂糖。,2.,加,TAE,量要适当,，以防止配出来胶太薄造成胶孔太浅或浓度太低。,3.,倒胶前,胶托一定要洗洁净,，并檫干。倒胶时要待胶冷到一定温度摇匀尽可能不要产生气泡。若,胶液温度太高胶托轻易变形。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第23页,二、,EB,染色,1.,碰到,EB,手套要及时丢弃。,2.,加量要适当，加,EB,至,终浓度,0.5,g/ml,3,抹布要严格区分，,不可交叉使用,。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第24页,三、点样电泳,1.,加样时，枪头要,上紧,，吸样,均一准确,，排液时吸头,不要有残留,。,2.,点完样后,及时,盖上胶垫，,注意不要盖反,。,3.,点电泳前最好检验待用胶是否合格，点电泳时要对准胶孔，尽可能,点完全部样,。,4.,点完样勿忘,marker,并,摆正胶位,，电泳仪,正负极不要插反,，电泳槽盖子要盖紧。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第25页,二,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺,(,简称,Acr),和交联剂,N,，,N,一亚甲基双丙烯酰胺,(,简称,Bis),在催化剂过硫酸铵,(AP),，,N,N,，,N,，,N,四甲基乙二胺,(TEMED),作用下，聚合交联向成含有网状立体结构凝胶，并以此为支持物进行电泳。,聚丙烯酰胺凝胶电泳可依据不一样分子所带电荷差异及分子大小不一样所产生不一样迁移率将,DNA,或蛋白质分离成若干条区带，假如分离纯化样品中只含有同一个,DNA,蛋白质，样品电泳后，就应只分离出一条区带。,SDS,是一个阴离子表面活性剂能打断蛋白质氢键和疏水键，并按一定百分比和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷量远远超出其本身原有电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然电荷差异。所以，各种蛋白质,SDS,复合物在电泳时迁移率，不再受原有电荷和分子形状影响，只是棒长函数。这种电泳方法称为,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,(,简称,SDSPAGE),。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第26页,聚丙烯酰胺凝胶电泳种类,1.,变性聚丙烯酰胺凝胶（,SDS-PAGE,）,变性聚丙烯酰胺凝胶是分子生物学惯用技术之一，是依据寡核苷酸大小来分离，所以可将全长产物与不完整短分子分开。电泳时通常每一泳道最少加,1mg,合成寡核苷酸，电泳后在紫外灯下定位寡核苷酸条带，将长度正确寡核苷酸从凝胶上切下。主要用于,单链,DNA,片段分离或纯化。,用途；放射性,DNA,探针分离，,DNA,测序等。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第27页,2.,非变性聚丙烯酰胺凝胶（,native-PAGE,）,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,(Native-PAGE),或称为活性电泳是在不加入,SDS,和疏基乙醇等变性剂条件下，对保持活性蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，惯用于酶判定、同工酶分析和提纯。使生物大分子在电泳过程中保持其天然形状和电荷，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子生物活性，对于生物大分子判定有主要意义，用于,双链,DNA,片段分离于纯化。,用途；制备高纯度,DNA,片段。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第28页,操作步骤,制板,制浓缩胶,电泳槽安装,加样,制分离胶,染色,电泳,固定,剥胶,脱色,观察结果,核酸凝胶电泳终专家讲座,第29页,1.,制胶,1,）在聚合分离胶上直接灌注浓缩胶，并马上在浓缩胶溶液中插入洁净梳子。小心防止混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间空隙，将凝胶垂直放置于室温下。,2,）浓缩胶聚合完成后（,30,分钟）小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入,Tris-,甘氨酸电极缓冲液。,2.,样品制备,取样品加入,0.5ml2SDS,凝胶加样缓冲液混匀。,3.,加样及电泳,用吸嘴吸收,50,l,，从加样孔底部迟缓加样。,注意：加样时不得插伤凝胶孔面，不得产生气泡、样品不得溢出加样孔。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第30页,4.,接电源与电泳,上槽接负极，下槽接正极。调整电压至,80V,电泳至样品前沿刚好进入分离胶后，把电压提升到,120V,（凝胶上所加电压为,8V/cm,），继续电泳直至溴酚蓝抵达分离胶底部上方约,1cm,（约,23,小时），然后关闭电源，取出插头。,5.,剥胶,从电泳装置上卸下玻璃，用水果刀撬开玻璃板。并用刀在紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶方位。,6.,染色与脱色,用考马氏亮蓝染色液对,SDS,聚丙烯酰胺凝胶进行室温染色,12,小时后，用脱色液在脱色摇床上与脱色,34,次，每次,2030,分钟。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第31页,注意事项,1.,丙烯酰胺和双丙烯酰胺含有很强神经毒性并轻易吸附于皮肤，操作时应防止沾在脸、手等皮肤上。最好戴一次性手套进行操作。,2.,过硫酸铵主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合反应，故一定要新鲜，贮存过久过硫酸铵商品不能使用。另外，,10,过硫酸铵必须现配现用。,3.,灌制凝胶时，应防止产生气泡，因为气泡会影响电泳分离效果。,4.,刚灌制注分离胶混合溶液后，应在分离胶液面上加,12cm,高得水层，以阻隔空气。胶液面上加水层时要尤其小心，缓缓叠加，以免冲坏凝胶胶面。,5.,聚丙烯酰胺凝胶电泳耗时长，电泳过程中产热多，尤其是夏天产热更多。顾电泳过程中应安装循环冷却水以带走热量，或在,4,冰箱中电泳。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第32页,核酸凝胶电泳终专家讲座,第33页,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,核酸凝胶电泳终专家讲座,第34页,三,脉冲电场凝胶电泳（,PFGE,）,在脉冲电场中，,DNA,分子迁移方向伴随电场方向周期性改变而不停改变。在标准,PFGE,中，第一个脉冲电场方向在另一侧成,45,夹角。由,于琼脂糖,凝胶电场方向、电流大小及作用时间都在交替改变，使得,DNA,分子能够随时调整其游动方向，以适应凝胶孔隙无规则改变。与相对分子质量较小,DNA,相比，相对分子质量较大,DNA,需要更多脉冲次数来更换其,构型,和方位，使其按新方向游动。应用脉冲电场凝胶电泳技术，可成功,分离到高达,107bp,DNA,大分子,。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第35页,倒转电场系统,垂直交变电场,箝位匀强电场系统,反转电场系统,脉冲电场凝胶电泳类型,核酸凝胶电泳终专家讲座,第36页,脉冲电泳操作步骤,DNA,样品制备,限制酶消化,脉冲,分离、纯化大,DNA,片段,EB,染色，拍照,紫外递质监测,DNA,搜集目标,DNA,核酸凝胶电泳终专家讲座,第37页,1.,脉冲电泳凝胶电泳,DNA,样品制备（以金黄色葡萄球菌为例）,（,1,）取,100ml,对数生长久金黄色葡萄球菌细胞于,4,，,5000g,离心,5,分钟,（,2,）用,20ml TEN,缓冲液冲洗沉淀，一样条件离心,5,分钟。在用,10ml EC,缓冲液使细胞悬浮。,（,3,）取,1.5ml,细胞样品与相同体积含,2%SeaPLaque,琼脂糖,EC,缓冲液快速混合均匀并等分流溶液至封闭模块中于,4凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至,50,。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第38页,（,4,）对于每一个菌株，需要,15-20,个凝胶块，将它们放至含有,30-45ug/ml RNase,10ml EC,缓冲液中，于,37,振荡过夜。,（,5,）去掉裂解缓冲液，换为,10ml ESP,缓冲液于,50,轻度摇温育,48h,。,（,6,）将凝胶块放在,10ml,含有,174ug/ml,苯甲基磺酰氟（,PMSF,）,TE,缓冲液中，室温温育,4h,以灭活,ESP,中蛋白酶,K,。,（,7,）用,TE,清洗琼脂块,6h,，至于,TE,中,4,保留。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第39页,2.,限制酶消化,1,）,25ul 10 x,反应缓冲液，,30U,限制酶，加双蒸馏水至,250ul,混匀。,（,2,）取一个凝胶块置其中，适当温度下过夜后，用,TE,缓冲液洗涤并贮存。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第40页,3.,应用,PFGE,对样品,DNA,进行分析,（,1,）用,0.5xTBE,缓冲液制备一个,0.8%SeakemHGT,琼脂糖凝胶，胶厚度尽可能与样品凝胶块相符。若用,Wide Mini-Sub Cell,进行电泳话，,50ml,该溶液即可。,（,2,）凝胶后，小心移去样品梳。将凝胶块用小刀切成与样孔一致大小，将样心插入加样孔，防止产生气泡。,（,3,）把胶放入电泳槽内，,加缓冲液，刚好覆盖胶表面即可，缓冲液事先,14,冷却。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第41页,（,4),将电泳槽和一个连着稳压电源程序性开关设备相连。打开电源，调整蠕动泵到适当流速,(5,10mL/rain),或打开变速泵至,40,。,（,5),经过计算机开启极性转换程序。大于,50kb,限制性片段在,1.2s,和,0.4s,正向和反向电脉冲下得以分离，时间普通为,3.5h,或更长。小于,50kb,限制性片段在,0.4s,正向和,0.2s,反向电脉冲,(,比率为,2:1),下得以分离，时间为,3,5h,。,（,6),在,0.5g/mL,溴化乙锭中进行染色并拍照。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第42页,4.,分离、纯化大,DNA,片段,（,1),凝胶染色、分析后，在目标带前,(,靠近正极处,),切一个,0.25cm2,左右槽，注入,0.8%Seaplaque,琼脂糖，使之凝固。（,2),重新打开极性转换开关，用紫外递质检测,DNA,迁移，当目标带进入,Seaplaque,凝胶中时，关闭开关，切下目标带，移至,1.5mL EP,管中。（,3),加入,2L,tRNA,，,30L 5mol/L NACl,，,370L,蒸馏水，在,65,70,之间，化胶并保温,10min,。（,4),苯酚,/,氯仿,500L,抽提两次。（,5),用,2.5,倍体积,95%,乙醇和,1/10,体积,NaAc3mol/L,，,pH52),于,-7010min,沉淀水相。再用,70%,乙醇洗两次并将沉淀溶于,TE,缓冲液中,。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第43页,脉冲电场凝胶电泳图,核酸凝胶电泳终专家讲座,第44页,注意事项,1.,换缓冲掖时尽可能小心不要碰坏琼脂凝胶。,2.PMSF,是一个强烈蛋白酶共价抑制剂，即有毒又挥发，操作时应在通风橱中进行。,3.,用蛋白酶,K,包埋材料时,50,温育时间很长,(24,48h),，有些学者提出如此长时间无须要,(Mortimer etal.1990),，且可能造成高分子质量,DNA,降解。在试验中可视情况而定。,4.,琼脂糖凝胶块在,TE(pH7.6),中,4,可存放多年，如在,05mol/L EDTA,中可存放更长时间。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第45页,5.,一些高压电源并不适合脉冲电场凝胶电泳，因为这些电源设计时均带有保护电路，它能够检测到负载突然降低而且引发外加电源自动关闭。,6.,因为电压较高，就会产生热量，为了确保温度为,14,，需要一些冷却设备,(,缓冲液冷却循环器或,MiniChiller),。另外，把电泳系统放在一个敞口冰盒中也可保持恒温。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第46页,影响电泳迁移率原因,1.DNA,分子大小,双链,DNA,分子迁移速率与其碱基对数惯用对数近似成反比。,2.,琼脂糖浓度,浓度越低，相同核酸分子迁移速度越快，反之则慢。,3.DNA构象,普通同一分子：超螺旋环状,线状,切口环状。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第47页,4.,凝胶和电泳缓冲液中溴化乙锭,溴化乙锭（,EB,）插入双链,DNA,造成其负电荷降低、刚性和长度增加。,5.,所用电压,低电压时,DNA,片段迁移速率与所用电压成正比。,6.,琼脂糖种类,常见有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖。,核酸凝胶电泳终专家讲座,第48页,7.,所用电泳缓冲液,惯用缓冲液有,TAE,、,TPE,及,TBE,电泳缓冲液,三者比较：,1,）,TAE,缓冲液容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶阳极一侧会发生酸化。,2,）,TPE,和,TBE,比,TAE,花费稍贵，但有高得多缓冲容量。,3,）双链线状,DNA,片段在,TAE,中比在,TBE,或,TPE,中迁移快,10,4,）对高分子质量,DNA,，,TAE,分辨率略高于,TPE,和,TBE,，对于低分子质量,DNA,，,TAE,要差些。超螺旋,DNA,在,TAE,中电泳分辨率要好于,TBE,核酸凝胶电泳终专家讲座,第49页,