免疫组织化学技术专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫组织化学（,Immunohistochemistry,）又称,免疫细胞化学,。它是,组织化学,分支，它是用标识特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）分布进行组织和细胞原位检测技术。,免疫组织化学技术专家讲座,第1页,基本原理,抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合原理，经过化学反应使,标识抗体,显色剂,(,荧光素、酶、金属离子、同位素,),显色来确定组织细胞内抗原,(,多肽和蛋白质,),，对其进行定位、定性及定量研究。,免疫组织化学技术专家讲座,第2页,免疫组化特点,特异性强,敏感性高,定位准确、形态与功效相结合,免疫组织化学技术专家讲座,第3页,免疫组化作用,凡是组织细胞内含有抗原性物质，如,肽类,、,激素,、,神经递质,、,细胞因子,、,受体,、,表面抗原,等等均可用免疫组织化学方法显示,。,免疫组织化学技术专家讲座,第4页,试验所用标本,石蜡切片,是制作组织标本最惯用、最基本方法，对于组织形态保留好，且能作,连续切片,，有利于各种染色对照观察；还能长久存档，供回顾性研究。,免疫组织化学技术专家讲座,第5页,试验设备,恒温冰冻切片机、脱水机、石蜡包埋机、切片机、摊片机、烤片机、冰箱、电磁炉、高压锅、染色架以及离心机和免疫组化试剂等,免疫组织化学技术专家讲座,第6页,免疫组织化学技术专家讲座,第7页,免疫组织化学技术专家讲座,第8页,脱水机、石蜡包埋机,免疫组织化学技术专家讲座,第9页,免疫组化技术分类,1,、免疫荧光方法,2,、,免疫酶标方法,3,、免疫胶体金技术,4,、免疫铁蛋白法,5,、放射免疫自显影法,免疫组织化学技术专家讲座,第10页,酶联免疫组织化学,ABC,法,S-P,法,免疫组织化学技术专家讲座,第11页,免疫组化操作步骤,免疫组织化学技术专家讲座,第12页,一,.,石蜡切片制作,1,、,固定,：取组织，用,PBS,冲洗，放入,4%,多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定,12h,2,、,脱水,：倒去固定液，用蒸馏水冲洗,3,次，再用,50%,酒精冲洗,2,次，用酒精逐层脱水，,70%,酒精,1,天，,80%,酒精过夜，,95%,酒精,3h,，无水酒精（,）、（,）各,2h,3,、,透明,：,1:1,无水酒精二甲苯,45min,，二甲苯（,）、（,）各,30min,4,、,包埋,：（恒温箱内进行）浸入石蜡，,1:1,二甲苯石蜡（,58,）,45min,，石蜡（,）、（,）、（,）共,2.5h,，用石蜡（,）包埋组织,免疫组织化学技术专家讲座,第13页,5,、,切片,：包埋后组织块经修整后，用切片机切成,5-7m,，石蜡带,6,、,贴片,：将组织石蜡块在,50,温水中展片，然后用处理洁净载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上,（洗片：,1%HCl,浸泡过夜、蒸馏水冲洗95%,酒精浸泡,2h,后擦干 涂胶：防脱剂多聚赖氨酸）,7,、,烤片,：,68,恒温箱内烤片,2h,免疫组织化学技术专家讲座,第14页,二,.SP,（链霉菌抗生物素蛋白,-,过氧化物酶连结）三步法染色步骤,1,、脱蜡、水化,6020,分钟二甲苯,2 10,分钟,100%,绝对乙醇,:25,分钟,;,95%ethanol 2 minutes,；,95%,乙醇,2,分钟,80%ethanol 2 minutes,；,70%ethanol 2 minutes,；,distilled water,:,5 min,；蒸馏水,:5,分钟,PBS,洗,3,次,3 min,。,免疫组织化学技术专家讲座,第15页,2,、阻断,：,3%H2O2,去离子水（或,80%,甲醇）孵育,10min,，以灭活内源性过氧化物酶活性,3,、,PBS,冲洗,2-3,次，每次,5min,4,、抗原修复,：置,0.01M,枸橼酸缓冲液（,PH 6.0,）中用煮沸（,95,，,15-20min,），自然冷却,20min,以上，再用冷水冲洗缸子，加紧冷却至室温,5,、,PBS,冲洗,2-3,次，每次,5min,6,、封闭,：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育,20min,，甩去多出液体,7,、滴加,抗,50l,，室温静置,1h,，或者,371h,，或者,4,过夜（需在,37,复温,45min,）,8,、,PBS,冲洗,23,次，每次,5min,免疫组织化学技术专家讲座,第16页,9,、滴加辣根过氧化物酶标识,抗,40,50l,，室温静置,1h,，或,371h,10,、,PBS,冲洗,2-3,次，每次,5min,11,、滴加,SP,（链霉亲和素,-,过氧化物酶），室温或,37,孵育,30min-1h,12,、,PBS,冲洗,2-3,次，每次,5min,13,、显色,：,DAB,显色,5-10min,，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞）,（显色剂配置：在,1ml,水中加,1,滴显色剂,A,，摇匀，然后加,1,滴显色剂,B,，摇匀，再加,1,滴显色剂,C,，摇匀）,（,A,：,DAB B,：,H2O2 C,：磷酸缓冲液）,免疫组织化学技术专家讲座,第17页,14,、自来水冲洗,10,分钟终止反应,15,、复染：苏木精复染,2min,，盐酸酒精分化,16,、自来水冲洗,10-15min,17,、常规脱水,50%ethanol 1-2 min,，,70%ethanol 1-2 min,95%ethanol 1-2 min,；,95%ethanol 1-2 min,；,100%absolute ethanol:(1-2)min,。,透明：,Xylene 1(1-2)minXylene 2(1-2)min,封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检,免疫组织化学技术专家讲座,第18页,三,.,二步法,免疫,组化染色步骤,二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯,PBS,冲洗3次，每次3分钟,依据每一个抗体要求，对组织抗原进行对应修复,0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶活性,PBS,冲洗、浸泡5分钟，3次,正常山羊血清室温封闭10分钟,免疫组织化学技术专家讲座,第19页,甩去血清，加入适当稀释一抗，37孵育60分钟或4过夜,PBS,冲洗，浸泡5分钟，3次,滴加多聚螯合物，37孵育30分钟,PBS,冲洗，浸泡5分钟，3次,新鲜配置酶底物显色液,DAB,显色310分钟,流水冲洗,苏木素复染，脱水，透明，封片。,显微镜观察拍照,IPP,软件分析光密度,免疫组织化学技术专家讲座,第20页,几个抗原修复方法,真空负压抗原修复法：,切片脱蜡至水。,0.3%H2O2,甲醇真空负压处理,5,分钟。自来水洗，蒸馏水洗。,0.01M,柠檬酸盐缓冲液（,PH6.0,），真空负压干燥箱预先调至,95,，真空负压处理,10,分钟。待修复注降至室温一，,PBS,洗,3,次，随即按选好免疫组化染色方法进行染色。,免疫组织化学技术专家讲座,第21页,微波辐射抗原修复法：,切片脱蜡至水。,0.3%H2O2,甲醇处理,10,分钟。自来水洗，蒸馏水洗。,0.01M,柠檬酸盐缓冲液（,PH6.0,），于微波炉内微波辐射,10,分钟，如检测,Er,和,Pr,则需要,20,辐射分钟左右。待修复液降至室温后，,PBS,洗,3,次，随即按选好免疫组织化学染色方法进行染色。,免疫组织化学技术专家讲座,第22页,高压抗原修复法：,切片脱蜡至水。,0.3%H2O2,甲醇处理切片,10,分钟。自来水洗，蒸馏水洗。切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后连续,1,4,分钟。待修复液恢复至室温后，,PBS,洗,3,次，随即按选好免疫组织化学染色方法进行染色。,免疫组织化学技术专家讲座,第23页,电炉加热抗原修复法,：,切片脱蜡至水。,0.3%H2O2,甲醇处理切片,10,分钟。自来水洗，蒸馏水洗。将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达,92,后，即可拔离电源，当温度低于,92,时，再插上电源，如此重复连续至,10,分钟左右。待抗原修复液降至室温后，,PBS,洗,3,次，随即按选定免疫组化染色方法进行染色。,免疫组织化学技术专家讲座,第24页,胰蛋白酶消化法：,切片脱蜡至水。,0.3%H2O2,甲醇处理切片,10,分钟。自来水洗，蒸馏水洗。,PBS,洗,3,次，,1,分钟,/,次。滴上自配或商品化胰蛋白酶，处理切片,20,分钟左右。,PBS,洗,3,次，,2,分钟,/,次。后按选好免疫组化染色方法进行染色。,免疫组织化学技术专家讲座,第25页,所用试剂,1.,PBS,：,0.01M,磷酸盐缓冲液,(pH7.4),配制,-,取,NaCl 8g,，,KCl 0.2g,，,Na2HPO412H2O 3.63g,或,Na2HPO4 1.44g,，,KH2PO4 0.24g,，溶于,900ml,双蒸水中，用盐酸调,pH,值至,7.4,，加水定容至,1L,，常温保留备用,2.,包埋剂,：石蜡,3.,防脱剂,：多聚赖氨酸（,PLL5g+,蒸馏水,1000ml,）,、,APES,（,3-,氨丙基,-3-,乙氧基甲硅烷）,免疫组织化学技术专家讲座,第26页,4.,固定液,：,4%,多聚甲醛磷酸盐缓冲液,(pH7.4),配制,a.0.1M,磷酸盐缓冲液：取,A,液,400ml,与,B,液,80ml,混合后，调,pH,于,7.4,，再定容至,500ml,A,液：,0.1mol/L Na2HPO4,（,Na2HPO412H2O 35.8g,加水定容至,1000ml,）,B,液：,0.1mol/L NaH2PO4,（,NaH2PO42H2O 15.6g,加水定容至,1000ml,）,b.4%,多聚甲醛磷酸盐缓冲液：取,20g,多聚甲醛溶于,500ml 0.1M,磷酸盐缓冲液中，加热并搅拌约,2-3h,后溶解,5.,细胞通透液,：由终浓度分别为,0.3%,双氧水和,0.3%Triton X-100,（,曲拉通,X-100,又称清洁剂,）混合而成。配制方法是先用微波加热,36 ml PBS,，再接着加,120 ul TritonX-100,，并加热一会儿，冷却至临用前加,0.4 ml 30,H2O2,。,免疫组织化学技术专家讲座,第27页,6.,抗原修复液,：,0.01M,枸橼酸缓冲液（,PH 6.0,）,，或,0.01M,柠檬酸盐缓冲液（,pH6.0,）,配制,-,取,A,液,8ml,与,B,液,42ml,混合后加水至,400ml,，调,pH,于,6.0,，再定容至,500ml,A,液：,0.1mol/L,柠檬酸（,C6H8O7H2O 21.01g,加水定容至,1000ml,）,B,液：,0.1mol/L,柠檬酸钠（,Na3C6H5O72H2O 29.41g,加水定容至,1000ml,）,7.,5,羊血清或封闭血清,，用PBS,稀释。,含,0.03,H2O2,0.05,DAB,二氨基联苯胺（避光）：用,20DAB,（,1,，,10 mg/ml,）,5 ul,0.1 ul 30%H2O2,95 ul PBS,。,8.,一抗,（特异结合底物,1:100,）,、二抗均用,PBS,稀释。,9.,二甲苯、梯度酒精,（,100,2,、,95,、,80,、,70,、,50,）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）。,10.,显色剂,：,DAB,试剂盒、苏木素染液,免疫组织化学技术专家讲座,第28页,免疫组化结果判断标准,1、每批染色都要有特异性阳性对照和阴性对照为基础，才能对染色结果做判断；,2、阳性表示必须在细胞和组织特定抗原部位才能视 为阳性；,3、阴性结果不能视为抗原不表示，即阴性结果无判断意义；阳性结果有强弱、多少之分，哪怕一个细胞阳性，只要是在抗原所表示部位，也有诊疗意义。,4、当免疫组化结果与,HE,切片诊疗有矛盾时，以,HE,切片诊疗为准。,5、应用“反正法”确保免疫组化在诊疗中准确性。,6、防止假阴性和假阳性发生。,免疫组织化学技术专家讲座,第29页,免疫组化应用范围,在常规病理诊疗中应用免疫组化主要有8个方面：,1、对肿瘤组织起源进行判别诊疗；,2、对肿瘤良恶性进行综合判断；,3、发觉微小转移灶；,4、激素受体检测以指导临床治疗；,5、激素类细胞定性和定位，以明确内分泌 细胞类型和功效状态。,6、指导肿瘤预后，如,PgP、CerbB-2、P53,等。,7、指导肿瘤分期；,8、免疫性疾病辅助诊疗，如肾小球肾炎、一些皮肤疾病等组织内免疫复合物检测。,免疫组织化学技术专家讲座,第30页,免疫组化染色中常见问题及对策,免疫组化操作方法比较简单，然而在实际工作中也会碰到一些麻烦，如,脱片、无特异性表示或表示较弱、染色过强、背景染色强、定位不好,等。引发上述问题原因较多，主要有组织固定、脱水不良或浸蜡温度过高造成抗原丢失；抗原未修复；抗体或工作液失效、抗体稀释不妥；在一定温度下抗原孵育时间不足、一抗和二抗不匹配；显色剂失效或配置方法失误等。所以，良好组织固定和脱水及适当浸蜡温度是做好免疫组化前提。中性福尔马林固定有利于正确结果显示。,免疫组织化学技术专家讲座,第31页,1,、脱片可能原因与对策,整批切片脱片,可能是载玻片未处理，玻片上有油污未清洗或未涂抹防脱片胶，或烤片时间不足致粘片不牢靠。,单张切片及整块组织脱片,除了上述原因外，需考虑抗体热修复时液体温度过高和时间过长，或冲洗时用力过猛等原因。,免疫组织化学技术专家讲座,第32页,2,、无特异性表示原因,问 题,确认染色过程次序是否正确；是否忽略了某一过程；是否孵育了足够时间；是否使用了正确抗体，以及二抗是否和一抗一致匹配。,底物显色系统是否失效,。,解 决 方 法,重新试验，设置阳性对照，以验证试验结果；仔细确定一抗与二抗种属；,更换显色剂（,DAB,或,AEC）;,不得使用过期试剂盒，不一样批号试剂盒不能混用；,免疫组织化学技术专家讲座,第33页,3,、表示较弱,问 题,标本固定方式不妥或固定时温度过高，使部分组织抗原被破坏；,抗原修复方式不妥；,抗体浓度过低，或者孵育温度、时间不够；,冲洗后切片残留多出缓冲液。假如阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，应考虑查标本本身原因。,解 决 方 法,新鲜组织及时固定，预防自溶，固定时间不超出二十四小时；,封闭时间不超出10分钟，或参考产品说明；注意复染时间,提升抗体浓度，孵育时间不少于60分钟（室温低于15，改在37 温箱孵育或4 冰箱过夜）,免疫组织化学技术专家讲座,第34页,4,、染色过强,问 题,抗体浓度过高或孵育时间过长,孵育温度过高，37,显色速度过快或显色时间过长；,解 决 方 法,降低抗体浓度、孵育时间；,室温1小时或4过夜；,缩短显色时间；显色时间不超出510分钟，以显微镜下观察为准；,免疫组织化学技术专家讲座,第35页,5,、非特异性背景染色,问 题,操作过程中冲洗不充分；,加试剂后切片干燥；,组织切片折叠；,组织中含过氧化物酶未阻断；,组织中含内源性生物素；,组织抗原弥散；,切片粘附剂过厚；,血清蛋白封闭不充分；,解 决 方 法,每步冲洗35；,预防切片干燥（必要时重做）,勿以折叠处观察染色结果；,可配置新鲜3%双氧水封闭，孵育时间延长；,正常非免疫动物血清再封闭；,组织及时固定，固定液要合标准,重新配置粘附剂涂液；,延长血清封闭时间；,免疫组织化学技术专家讲座,第36页,6,、染色定位不好,除包括抗体原因外，应注意标本本身前,期处理及详细操作方法等。,免疫组织化学技术专家讲座,第37页,7,、封片时注意事项,封片时动作快,切片入二甲苯后起白雾，为脱水未尽,记住切片组织面,防脱片处理,盖片必须大于组织块,封固剂不要滴得太多，也不要太少，预防气 泡产生。,免疫组织化学技术专家讲座,第38页,注意事项,一、抗体保留,浓缩抗体：使用期内，只需放在,4 冰箱内，保留时间可达,1-3,年。,即用型抗体：理论上在4 冰箱内,可保留六个月左右。,PBS,或抗体稀释液稀释抗体：普通,只可放置1-,2,个月。,免疫组织化学技术专家讲座,第39页,二、出现假阳性原因,组织切片质量不佳，造成假象，如,刀痕裂缝边缘组织着色过深，不能作,为判断阳性依据。,出血和坏死：红细胞内源性过氧,化物酶，坏死细胞释放内源性过氧化,物酶均可出现假阳性反应。,抗体交叉反应。,免疫组织化学技术专家讲座,第40页,三、出现假阴性原因,固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，造成抗原丢失，无法补救。,固定液不适当或浓度不对，造成固定不佳。最好使用10%中性福尔马林。,抗体浓度过低。,孵育时间太短，或孵育温度太低。,缓冲液,pH,值不正确。,免疫组织化学技术专家讲座,第41页,免疫组织化学技术专家讲座,第42页,免疫组织化学技术专家讲座,第43页,免疫组织化学技术专家讲座,第44页,免疫组织化学技术专家讲座,第45页,免疫组织化学技术专家讲座,第46页,免疫组织化学技术专家讲座,第47页,免疫组织化学技术专家讲座,第48页,免疫组织化学技术专家讲座,第49页,免疫组织化学技术专家讲座,第50页,免疫组织化学技术专家讲座,第51页,免疫组织化学技术专家讲座,第52页,必须严格设置阳性对照和阴性对照。,DAB,有致癌性，用后不应随地倒弃。,免疫组织化学技术专家讲座,第53页,Thank You!,免疫组织化学技术专家讲座,第54页,