免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,试验目标,了解双向琼脂扩散原理和用途。,掌握抗体效价测定方法。,观察抗原、抗体在琼脂板中形成沉淀线。,免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座,第1页,试验原理,双向双扩散简称双扩散，此法是一个定性试验。可溶性抗原与对应抗体在琼脂凝胶中各自向四面扩散，假如抗原和抗体相对应，则在二者百分比适当处形成白色沉淀线；若抗原和抗体无关就不会出现沉淀线。此试验能够检测抗原或抗体纯度，滴定抗体效价，以及用已知抗原（抗体）检测和分析未知抗体（抗原）。,免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座,第2页,试验材料,生理盐水、1%琼脂（用于制作琼脂扩散试验平板）,已知传染性法氏囊病毒抗原、待检血清,打孔器、微量加样器、枪头、酒精灯、搪瓷盒等,免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座,第3页,试验步骤,制板：称取1g琼脂粉，加入100ml生理盐水，煮沸使之溶解。待溶解琼脂温度降至60左右时倒入平皿中，厚度为2-3mm。注意勿产生气泡。,打孔：待琼脂凝固好后用打孔器打孔，孔径和孔距依不一样疫病检疫规程而定，普通孔径35mm，孔间距47mm。孔型多为7孔，中央1孔，周围6孔（如梅花孔）。用针头挑出孔内琼脂。,封底：将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手背感受微烫即可。,免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座,第4页,抗体效价测定：用微量加样器于中央孔加入已知抗原，于周围孔加倍比稀释血清，每个稀释度加1孔。加样时不要使样品外溢或在边缘残余小气泡，以免影响扩散结果。,扩散：加样完成后，将琼脂板放于湿盒内，保持一定湿度，置于37温箱中扩散2448小时观察结果。,免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座,第5页,图1,免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座,第6页,结果判定,用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中心孔，将待测抗原或需比较抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合，证实为同种抗原；若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不一样。,免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座,第7页,用梅花孔检测抗血清效价，操作时将抗原置于中心孔，抗血清倍比稀释后置于周围孔，以出现沉淀带血清最高稀释倍数为该血清,琼扩效价,。,若凝胶中抗原、抗体是特异性，则形成抗原抗体复合物，在两孔之间出现清楚致密白色沉淀线，为阳性反应。若在72小时内仍未出现沉淀线则为阴性反应。试验时最少要做一阳性对照。出现阳性对照与备检样品沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。,结果判定,免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座,第8页,双向免疫扩散凝胶染色图,免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座,第9页,免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座,第10页,注意事项,浇制琼脂板时要均匀、无气泡。,孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂。,加样时应尽可能防止气泡或加到孔外，以确保结果准确性。,注意微量进样器每加一个样品之后，更换枪头。,免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座,第11页,思索题,怎样进行血清琼扩效价测定？,免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座,第12页,