小量全血基因组DNA快速提取(离心柱型)操作方法及步骤说明书.doc

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◆ TRIpure Reagent 抽提指南
◆ 目录号 RP02
◆ 使用手册
◆ 实验室使用，仅用于体外
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小量全血基因组DNA快速提取试剂盒
目录号：DN01
目录编号
包装单位
DN0101
50次
DN0102
100次
DN0103
200次
DN0111
50次(带蛋白酶K粉)
DN0112
100次(带蛋白酶K粉)
DN0113
200次(带蛋白酶K粉)
v 适用范围：
适用于快速提取全血基因组DNA
v 试剂盒组成、储存、稳定性：
试剂盒组成
保存
50次
100次
200次
平衡液
室温
5 ml
10 ml
20 ml
缓冲液BB
室温
10 ml
20 ml
40 ml
结合液CB
室温
15 ml
30 ml
60 ml
抑制物去除液IR
室温
25 ml
50 ml
100 ml
漂洗液WB
室温
15 ml 25 ml 50 ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
洗脱缓冲液EB
室温
15 ml
15 ml
15 ml x 2
蛋白酶K粉
（可选）20mg/ml
-20℃
20mg
20mg×2
20mg×4
吸附柱AC
室温
50个
100个
200个
收集管（2ml）
室温
50个
100个
200个
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:
1. 结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2. 为避免降低活性，方便常温运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解。因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存，－20℃保存。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

v 产品介绍：
独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤， 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

v 产品特点：
1. 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
2. 快速，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成。
3. 多次柱漂洗确保高纯度，典型的产量200µl全血可提取出3-12µg，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达30 kb -50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。
4. 从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方，裂解快速完全，客户可根据需要选择购买。
5. 典型的产量200µl全血可提取出3-12µg 基因组DNA。
v 注意事项：
1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2. 不同样品尤其疾病样品中白细胞数量差异可能非常大，因此产量的个体差异也可能非常大。
3. 需要自备异丙醇。
4. 开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。
5. 为了最佳效果，最好使用新鲜血液标本或者4℃存放少于3天的标本，不要使用反复冻融超过3次的标本，否则会严重降低产量。
6. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保批pH大于7.5， pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在－20℃。DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

v 关于平衡液的使用
1. 介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至37℃使沉淀完全消失。
2. 使用方法：取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

v 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
1. 取200ul新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，放入1.5ml离心管。
如果全血起始量小于200μl，则用缓冲液BB补足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之间，则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于300μl-1ml之间，则需要先进行红细胞裂解操作（见本说明书后附录）。
如果处理血样为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液，其红细胞为有核细胞，因此处理量5-20μl，可加缓冲液BB补足到200μl后进行后续步骤。
2. 加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入200μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10分钟。溶液应变清亮（但颜色偏黑色）。
可选步骤，一般不需要: 如果RNA残留较多，需要去除RNA，可以在加入200μl 结合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。
平衡液预处理吸附柱备用：
使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前文“关于平衡液的使用”
3. 冷却后加入100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。
4. 将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。
5. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000 rpm 离心30秒，弃废液。
6. 加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。
7. 加入600μl漂洗液WB，12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。
8. 将吸附柱AC放回空收集管中13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
9. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热效果更好）， 室温放置3-5分钟，12,000 rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000 rpm离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
10. DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃
v 附录（以300μl，1ml全血举例红细胞裂解操作）：
1. 吸取900μl红细胞裂解液到一个1.5ml离心管或者3ml红细胞裂解液到一个15ml离心管。（红细胞裂解液可向本公司购买）
2. 将抗凝全血（使用前回复到室温）颠倒混匀后，吸取300μl全血和1ml全血分别加到上述1.5ml和15ml离心管中，颠倒6-8次，并倒置轻弹管壁，确保充分混匀。
3. 室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次，帮助裂解红细胞）。
4. 12,000 rpm离心20秒（对于1.5ml离心管）或2,000-3,000 rpm离心5分钟（对于15ml离心管），倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团和大约10μl的残留上清。
离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3，4。
5. 加入200μl缓冲液BB涡旋振荡重悬白细胞团，充分分散白细胞团。
其中由于肝素抗凝血的白细胞沉淀团很难打散重悬，影响后续实验裂解效果，建议选用非肝素的抗凝剂收集血液标本。
6. 现在可以按照操作步骤提取全血基因组DNA了。
v 问题与解决方法
问题
评论与建议
标本中
含有血凝块
*不恰当的存放标本，未充分混匀，未使用合适的抗凝剂-建议：丢弃有血凝块的标本，重新用EDTA，肝素，柠檬酸剂收集血液。
红细胞裂解
不完全
*血液标本裂解前没有回复到室温-建议：处理前先把血液标本回复到室温。
*裂解时间不够-建议：可延长裂解时间至15分钟以上。
*裂解过程中没有混匀-建议：裂解过程中可以更多次颠倒混匀，或者轻弹管壁帮助裂解。
DNA产量低
*血液标本中本身含有的白细胞数量低-建议：增加起始血液处理量。
*血液标本存放时间太长-建议：存放在4℃的血液标本超过5天的产量可能大大降低，因此不要存放太久。
*蛋白酶K失效了-建议：收到蛋白酶K后，按照每次使用量分装冻存，避免反复冻融。

*裂解不完全或者和异丙醇没有充分混匀-建议：加入结合液后，和加入蛋白酶K后立即吹打或者涡旋混匀；加入异丙醇后立即吹打或者涡旋混匀才加入吸附柱，如果太粘稠必须涡旋振荡15秒充分混匀。
*洗脱效率不高-建议：确保做了步骤8，否则残留乙醇会影响洗脱效率，仔细阅读仔细阅读注意事项6和步骤9和只使用洗脱缓冲液EB洗脱。

问题
评论与建议
DNA下游酶切
不能切开或者
酶切不完全
*忘记做步骤8，乙醇抑制了酶切反应-建议：做步骤8，然后空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应-建议：将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟，小心取上清使用。
DNA长度
小于15kb
*血液样品太老或者不正确的存放，造成DNA降解-建议：选用新鲜的血液样品
*操作不当，造成对基因组DNA的剪切-建议：混匀时不可太剧烈，不可以用手剧烈振荡离心管，选用大口径的枪头转移或者混匀DNA。
A260吸光值
异常偏高
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来，干扰了吸光值-建议：将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟，小心取上清使用。
洗脱下来的
DNA溶液还带有轻微的颜色
*漂洗不完全-建议：1. 漂洗，直到离心下来的液体没有颜色；2. 将洗脱液当成起始材料，再重复一遍实验，注意略去蛋白酶K消化和70℃孵育步骤。

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