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新型金属蛋白酶ADAMTS家族研究进展

  摘要 含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶 ADAMTSs ( a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs)是一类新的Zn2+ 依赖的金属蛋白酶家族 , 广泛存在于哺乳动物和无脊椎动物体内 。从1997年发现第一个ADAMTSs家族成员以来 , 迄今共有19个成员被发现 ,在保持凝血系统的稳态 、 器官生成 、 炎症 、 生育等方面有重要作用 。尽管其中大部分酶的功能尚不清楚 , 但已有研究显示该家族成员与多种疾病密切相关 。ADAMTSs与基质金属蛋白酶MMPs、解聚蛋白样金属蛋白酶 ADAM s同属金属蛋白酶家族 , 但在结构组成 、 组织细胞分布 、 底物作用的特异性 、 酶活性的调节等方面有明显差别 。本文综述了其在结构功能及与疾病关系的研究进展 。
关键词 　 细胞外基质 ；金属蛋白酶 ; ADAM TS 。　　
基质的合成和降解参与了一系列生理和病理生理过程 ,包括血管生成 、 细胞凋亡 、 肿瘤转移 、 炎症发生等 ,而降解基质的蛋白酶在其中起着关键性的作用 。目前已知的参与基质重构的蛋白水解酶包括丝氨酸蛋白酶﹑酪氨酸蛋白酶﹑半胱氨酸蛋白酶﹑金属蛋白酶等 。ADAMTS ( a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS) 意为 含Ⅰ 型血小板结合蛋白基序( TSP )的解聚蛋白样金属蛋白酶 ,是继基质金属蛋白酶MMPs后新发现的一类Zn2+依赖的分泌型金属蛋白酶 。ADAMTSs家族与解聚蛋白样金属蛋白酶ADAMs及基质金属蛋白酶 MM Ps同属于金属蛋白酶家族 , 但对它的了解远不如后两者清晰 。ADAMTSs区别于MMPs和其他金属蛋白酶的主要结构特点是羧基端含有至少一个TSP基序 。与MM Ps相比 , ADAMTSs 底物谱相对狭窄 ; 与锚定在细胞膜上的ADAMs 相比 , ADAMTSs 属于分泌型蛋白酶 , 可由巨噬细胞 、 血管内皮细胞 、 平滑肌细胞 、 成纤维细胞等多种细胞合成和分泌 ，通常结合于基质上 。目前在人类已找到19个ADAMTSs成员 ,部分成员的特异性底物及重要功能正逐步被人们认识 ,但仍有一些新基因被陆续克隆并等待功能的揭晓 。ADAMTS家族与疾病有着密切的关系 , 如ADAMTS-2 基因突变可以导致羊和牛的皮肤脆性综合征 ,而在人类则可以导致 V IIc 型 Ehlers-Danlos 综合征 ( EDS) ; ADAM TS-13 的功能缺失则导致血栓性血小板减少性紫癜 ( TTP ) ; 在关节炎病人的关节滑液中则可以发现ADAMTS-4和ADAM TS-5 的明显升高等等 ,这些证据表明ADAMTS家族可能在体内多种疾病中发挥着关键性作用 , 也为疾病的诊断和治疗提供了新的靶点 。以下将对ADAMTSs 家族的主要成员就其结构 、 作用底物 、 生理功能及与疾病关系的研究进展作一综述 。
 一、 ADAMTSs的结构 ADAMTSs家族一共有19个成员 , 大多以无活性的酶原形式存在 。ADAMTS的结构域依次为信号肽 、 前结构域 、 金属蛋白酶催化结构域 、解素样结构域 、 半胱氨酸富集区域 、 间隔区域和 TSP 重复序列。 ADAMTS家族成员根据其结构又可分为一些小的亚群 , 如 ADAMTS- 7 和 ADAMTS- 12 在 C 末端的TSP重复序列中都有一个粘蛋白结构域 ; 而 ADAMTS -9 和 ADAMTS -20 则包含GON结构域 ; ADAMTS- 13 包含两个CUB 结构域等 。结构的相似性决定了功能的重叠 , 如ADAMTS -7 和 ADAMTS -12 ( 均可切割软骨基质蛋白COMP cartilage oligomeric matrix protein ) 。
二、 ADAMTS-1 ADAMTS- 1 是在对小鼠结肠腺癌基因差异显示的筛选中发现的。ADAMTS -1 定位于人染色体21q21-22，编码含 951 个氨基酸的蛋白质 , 分子量约为 100kD。 ADAMTS- 1 属于分泌型蛋白 , 在分泌过程中 , 无活性的 ADAMTS- 1 前体可以经过两个连续的步骤剪切为 87kD 和 65kD 两种活性形式 。ADAMTS- 1 分泌后大多通过 C-末端3个TSP 重复序列和间隔区锚定在细胞外基质中 。正常情况下 , ADAMTS- 1 高表达在许多组织 , 如心脏 、 肺、 肝脏 、 骨骼肌和肾中。 ADAMTS- 1 可以通过降解细胞外基质蛋白 , 如 Versican、 Brevican、 Aggrecan 参与多种生理和病理生理过程 。例如 ADAMTS- 1 能够从多个位点切开血管基质蛋白 Versican,从而促进平滑肌的增殖和移位 ; 免疫组化染色人的动脉粥样斑块发现 ADAMTS -1 高表达 ; ApoE 敲除背景上的ADAMTS- 1转基因小鼠比单纯 ApoE 敲除小鼠内膜明显增厚 , 提示 ADAMTS- 1 可促进动脉粥样硬化的发展 ; 此外 , ADAMTS -1 可能也参与了胸主动脉血管瘤的形成。 Brevican 是主要表达在中枢系统中的基质蛋白 ,TNF- α刺激下脑星形胶质细胞ADAMTS -1 的表达增高 ,通过降解 brevican 可能参与了神经元损伤 。最近 , 经DIGE 蛋白质组学和酵母双杂交研究新发现了几种 ADAMTS- 1 的可能底物 , 包括基底膜蛋白质nidogen-1和-2, desmosomal protein desmocollin-3和 细胞外基质糖蛋白 dystroglycan 1, Mac-2 结合蛋白以及 TFPI -2,有趣的是重组的 ADAMTS -1 还可以降解 I型胶原 ,发挥了类似 MM Ps的作用 。
ADAMTS-1 的另一重要功能是抑制血管新生。 ADAMTS-1 通过 C -末端结合到血管内皮生长因子VEGF165 的肝素结合区 , 从而阻断了VEGF受体VEGFR2 的磷酸化 ,进而抑制内皮增殖和血管生成 。
最近的研究表明 , ADAMTS-1 还可以通过活化有抗血管再生作用的基质糖蛋白 Thrombospondin( TSP )TSP 1 和 TSP 2,达到抗血管再生的作用 。血管新生在肿瘤转移中起着关键作用 。ADAMTS-1 通过抑制血管的生成 ,可能参与了抑制肿瘤的发生发展 。在非小细胞肺癌中 , ADAMTS-1 无论在 mRNA 水平还是蛋白水平 ,表达均显著下降 ,从而失去对血管生成的抑制作用 , 推动肿瘤的发展 ; ADAMTS-1 的过表达可以明显抑制肿瘤的生长 , 使肿瘤中心出现坏死区域 , 提示 ADAMTS-1 的抗肿瘤作用 。但在胰腺癌中 , 虽然 ADAM TS- 1 的表达比正常组织是下降的 ,然而在肿瘤组织中 ADAMTS- 1 相对高表达，不仅不能抑制肿瘤生长 , 反而与胰腺癌的腹膜后侵润和淋巴结转移相关 , 提示 ADAMTS- 1 作用的复杂性 , 在不同来源的肿瘤发生中起到不同的作用 。 ADAMTS- 1 的抑制血管生长的作用与它的金属蛋白酶活性区及剪切形式有关 。最近 , 在皮肤损伤愈合的过程中 , ADMATS- 1 被发现有双重功能 ,低水平时可以通过降解基质蛋白促进内皮和成纤维细胞的迁移 ,而高表达时则结合到成纤维细胞生长因子 FGF - 2,抑制内皮细胞和成纤维细胞的迁移 。
转基因动物的出现为确切认识 ADAMTS- 1的生理与病理作用提供了强有力的工具 。ADAMTS-1 的基因敲除小鼠呈现出生长迟缓 ,脂肪形成异常 ,子宫卵巢发育异常及受精障碍 , 泌尿生殖系统的发育异常 ,阻塞性肾病等 , 说明 ADAMTS-1 对生长 、 受精、 维持泌尿生殖系统正常的器官形态和功能至关重要 。此外 , ADAMTS-1 还参与了正常的卵泡发育和排卵过程 、 子宫的正常发育和大鼠的发情周期的调节等过程 。 ADAMTS-1 的表达受到多种因素的影响 。致炎细胞因子TNF- α、 I L-1-β和内毒素均可诱导其表达 ; 转化生长因子TGF- β则可下调其表达 。激素类如：甲状旁腺激素 、 绒毛膜促性腺激素 、 雌激素 、 雄激素 、 孕酮等均可调节其表达 。血管内皮生长因子 VEGF 可刺激 ADAMTS-1 的表达 , 对血管生长起到负反馈调节的作用 。此外 , 细胞外基质蛋白 Fibulin, 尽管 不是 ADAMTS-1 的底物 , 但通过与之结合 , 可增强 ADAM TS-1 对 aggrencan 的切割能力 。目前尚未发现体内 ADAM TS-1 天然的抑制剂 ,合成的 ADAMTS-1 的抑制剂包括 EDTA , 1, 10-phenanthroline , BB-94和MMP 抑制剂。
三 ADAMTS-2 ADAMTS-2 是原胶原变为胶原过程中的剪切酶 。只有经过剪切 (去掉氨基端的前体肽) 的胶原才能形成正常的单体并组装成长圆柱形胶原纤维 。 ADAMTS-2 可以切割原胶原 Ⅰ、 Ⅱ 和 Ⅲ。ADAMTS-2基因突变可以导致羊和牛的皮肤脆性综合征 , 而在人类则可以导致 V IIc 型 Ehlers- Danlos 综合征 ( EDS) 。 EDS是一种常染色体隐性遗传病 , 典型症状是皮肤脆性增加 , 关节松弛和特征性的面容。 ADAM TS-2 的激活涉及多种剪切过程 , 包括前体蛋白转化酶 ( pro -protein convertases) 和 C -末端剪切 , 会产生7种不同的剪切产物 ,其中104kD氨基末端剪切产物活性最高 。ADAMTS-2除了对纤维原胶原Ⅰ~Ⅲ 型进行加工外 ,还可以对 αⅤ 胶原的氨基末端进行加工 ,且剪切部位不同于以往的ADAMTS-2的剪切部位。以往研究表明ADAMTS-2 对于原胶原N 端前导肽的切除是必须的 , 而且不能被其它蛋白酶所替代 ,但最新研究发现在ADAMTS-2 突变的小鼠中 ,并非所有胶原富集的组织都会受到如此严重的影响 ,提示 ADAMTS-2 的功能在某种程度上可以组织特异性的被其它同系蛋白酶所代偿 。事实上 ADAM TS-3 和 ADAMTS-14 后来也被证明能够分别剪切原胶原 I和 II, 从而发挥代偿作用 。 ADAMTS-2广泛分布于多种细胞 。细胞因子TNF-α和生长因子TGF-β 均可促进 ADAMTS-2 的分泌 。金属蛋白酶组织抑制物 TIMP-3, 能抑制 ADAMTS-2 的活性 , 而TIMP-1, 2, 4 则不能 。
四、ADAMTS-4 和 ADAMTS-5 ADAMTS-4 和 ADAMTS-5 是软骨基质蛋白聚蛋白多糖aggrecan的降解酶。关节软骨中含有大量的 aggrecan,它对于关节的抗压力和张力等物理属性起着重要的作用 。骨关节炎和类风湿性关节炎患者中发现存在着 aggrecan 的大量降解破坏 。在 aggrecan 的结构域中有两个主要的切割位点 , 其中一个是 MM Ps切割位点 , 位于 Asn341 和 Phe342; 而另一个则是聚蛋白多糖酶 aggrecanase 切割位点 , 位于Glu373 和 Ala374。经过鉴定和纯化 , 聚蛋白多糖酶-1 在 1999年被证实是ADAMTS- 4, 人ADAMTS-4 cDNA 全长包括 2511个碱基 ,编码 837 个氨基酸 ,定位于1q21-q23。继而聚蛋白多糖酶-2 又被发现是 ADAMTS-5, ADAMTS-5定位于人 21q21-q22。聚蛋白多糖酶是治疗关节炎的新靶点 , 它的发现使得关节炎的治疗有望取得新的突破 , 为能从根本上治疗和预防关节炎提供了基础 。后来的研究发现 , ADAMTS-4对 MMPs切割位点 Asn341 和 Phe342 也有延缓的切割作用 。在对人骨肉瘤细胞株的研究发现 , ADAMTS-4 以酶原形式存在 , 它的激活需要前蛋白转化酶furin 的参与 , 其在脑 、 肺和心脏组织中均有表达 , 在胎盘和骨骼肌中也有较弱表达 。尽管MMPs与聚蛋白多糖酶都可以参与 aggrecan 的降解 , 到底哪个成员在关节炎发病中起到更重要的作用还不太清楚 ,可能在疾病的不同阶段分别参与软骨基质的破坏 。虽然 ADAMTS-1, 8, 9 也有微弱的聚蛋白多糖酶的活性 , 但有人通过对小鼠关节炎动物模型的研究发现 , ADAMTS-5才是体内 aggrecan 的主要降解酶 ,这一发现是否适用于人类还有待证实 。 此外 , 脂肪组织也可以产生ADAMTS-4 和 ADAMTS-5。脂肪细胞的形成和分化中可见 ADAMTS-5及其底物 aggrecan 表达水平的变化 , aggrecan 在体外及体内均可以刺激脂肪细胞分化和成熟 , 提示 ADAMTS-4 和 ADAMTS-5 在脂肪的形成中起着重要的作用 。除了 aggrecan, ADAMTS-4 还可以切割细胞外基质 brivecan 和 versican。在恶性胶质瘤中 , ADAMTS-5 的表达水平明显升高 , 通过降解 brivecan, 介导了神经胶质瘤的侵袭与转移。
组织基质金属蛋白酶抑制剂 TIMP-3 是强有力的ADAMTS-4 活性抑制剂 , 其 I C50 = 7. 9nmol /L , 而TIMP- 1, 2, 4 的抑制作用不明显 。α2 巨球蛋白是另 一种内源性的ADAMTS-4、5 抑制剂 ; 绿茶中的成分catechingallate esters也可明显抑制 aggrecanase的活性 。
五、 ADAMTS-7和 ADAMTS- 12 ADAMTS-7 定位于人15号染色体 , 人和小鼠的 ADAMTS-7 蛋白分别包含 1686 和 1641个氨基酸 , 分子量大小大约为 181 和178kD。两者在氨基酸序列上有较高的同源性。 ADAMTS-7 可以经过多次的furin依赖的剪切过程 ,无论是全长还是剪切形式均表现出水解活性 。ADAMTS-7 在人心脏 、 胰腺 、 肾脏、 软骨 、 骨骼肌和肝脏中均有高表达 , 呈现分布的广泛性。ADAMTS-12 定位于人5q35, 全长5115个碱基 ,编码1543个氨基酸 ,其分子量约为177. 5kD。 ADAMTS-7 和 ADAMTS-12 有着极其相似的结构 ,两者的氨基酸序列同源性大约为 57% , 在 C 末端的 TSP重复序列中都有一个粘蛋白结构域 。与 ADAMTS-7 相比 , ADAMTS-12 在胎儿主要表达在肺 ,在正常成人骨关节组织中主要分布在滑膜 、 骨骼肌和软骨中 ,肌腱和脂肪组织也有表达 。在一些肿瘤和肿瘤细胞系中发现 ADAMTS-12 的高表达 , 提示它可能参与肿瘤的发生发展 。 软骨基质蛋白 COMP( Cartilage oligomeric m atrix protein )的降解片段可以作为临床关节炎病人的一个重要诊断指标 ,利用酵母双杂交的方法发现降解 COMP的蛋白酶是ADAMTS-7。 ADAMTS-7也是第一个被发现的直接与COMP 结合并降解 COMP 的蛋白酶。继而又发现 ADAMTS-12 也可以特异性的降解COMP , 在骨关节炎病人的软骨和滑膜中均有 ADAMTS-7 和 ADAMTS-12 mRNA 的升高 , 提示 ADAMTS-7 和 ADAMTS-12 可能在骨关节炎的发病中起着重要作用。COMP 还是正常人血管外基质成分 ,体外实验证明 COMP 促进平滑肌细胞的迁移 , 这些结果提示 ADAMTS-7 和 ADAMTS-12 有可能通过降解COMP, 破坏基质 ,参与了血管重塑和动脉粥样硬化等血管疾病发生和发展进程。最近的研究发现 , ADAMTS -7 高表达在人的斑块 ,过表达 ADAMTS-7 可以明显促进平滑肌细胞的迁移和增殖 ,可能参与了动脉粥样硬化的进程 (待发表资料)。
六、 ADAMTS13
vWF是一种存在于血浆 、 血小板和血管内皮细胞的多聚体糖蛋白 ,它是凝血因子 Ⅷ 的载体蛋白 ,支持血小板凝固 ,并且通过连接血小板表面的糖蛋白和损伤血管暴露的细胞外基质 , 使血小板黏附到损伤血管的表面 。这一生理过程依赖于成熟的vWF 的存在 ,而后者必须经过一系列的剪切才能从前体转化为成熟形式 ,否则就以异常大的多聚体形式存在 (UL -vWF ) , 并结合血小板聚集在小动脉和微血管中形成微血管血栓 。在人体内正常血流剪切力作用下 , ADAMTS-13可介导vWF 的这种剪切过程。它的活性缺乏将会导致UL-vWF的过多聚集及血栓性血小板减少性紫癜 ,表现为血小板减少 ,微血管内血栓 ,肾衰和发热等症状 。研究表明 ,有两种机制可能导致 ADAMTS-13 活性的缺乏 : ( 1 ) 纯合子或者杂合子的基因突变 (迄今为止已发现20 种与TTP 相关的突变 ,大多发生在羧基端 ) ; ( 2 ) 抗 ADAMTS-13自身抗体的形成。临床检测血中ADAMTS-13 的水平与活性可以反映血栓性血小板减少性紫癜的程度和转归。
七、 结语 ADAMTSs参与了极其复杂多样的生物学和疾病过程。关于ADAMTSs的研究方兴未艾 , 更多的成员陆续被发现 , 充分的证据表明 ADAMTSs 与疾病有着密切关系 。在研究 ADAMTSs与疾病的关系上我们要意识到问题的复杂性 , 表现在 : ( 1 ) ADAMTS家族和 MMPs 以及 ADAMs 家族同属于金属蛋白酶 ,虽然存在金属蛋白酶的共性 ,但三者在底物特异性 、 组织分布和体内抑制因子等方面表现出较大的差异 ,因而研究每一种酶在疾病中的作用和地位 ,设计特异性的金属蛋白酶抑制剂而不是广谱的抑制剂 ,则更为必要和有效 ; ( 2 ) ADAMTS可能在不同阶段 ,通过不同的机制 , 参与疾病的发生发展 , 如类似 MMPs, ADAMTSs在肿瘤的特定阶段起着不同的、 甚至是完全相反的作用 。从而更提示我们在选择治疗的靶点时要有针对性。ADAMTS基因家族作为一种重要的金属蛋白酶家族 , 对它的各种性质的了解还有待更进一步的研究 ,有关ADAMTS基因家族的发现和认识无疑为临床治疗提供了新的思路和新的靶点 。