支原体的清除.ppt

按一下以編輯母片標題樣式,按一下以編輯母片,第二層,第三層,第四層,第五層,*,*,支原体的检测与清除,1,30-50%,的细胞培养物中存在支原体污染。,支原体是细胞培养的一大顽敌,2,支原体（,mycoplasma,）：又称霉形体，是目前发现的最小的最简单的细胞，介于病毒和细菌之间。,支原体在自然界的分布非常广泛，种类繁多。,支原体分为两个属：一为支原体属（,Mycoplasma,），有几十个种；另一为脲原体属,(Ureaplasma),，仅有一种。,与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。,与细胞污染有关的支原体则有好多种。,支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体（支原体是原核细胞，原核细胞的细胞器只有核糖体）。,支原体的特征,资料来源：生物通,3,支原体是,1898,年发现的，其是简单的原核细胞，大小介于细菌和病毒之间。结构比较简单，多数成球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。,支原体的发现,资料来源：生物通,4,支原体与衣原体的区别,衣原体（,chlamydia,）是一类严格在真核细胞内寄生，有独特的发育周期，能通过,0.45mm,滤菌器的原核细胞型微生物。,过去曾一直被认为是病毒，,1956,年我国学者汤飞凡教授等分离沙眼衣原体成功，证明沙眼病原体不是病毒。,由于它具有一些与细菌类似的生物学特性，现归属于广义的细菌范畴。,主要是通过性接触传播，进入生殖道后，喜欢进入粘膜细胞内生长繁殖，在女性引起子宫内膜炎、输卵管炎、盆腔炎、尿道炎等。在男性可引起尿道炎、附睾炎、直肠炎等炎症。女性感染沙眼衣原体，会引起不孕、异位妊娠,(,宫外孕,),、流产、死胎、胎膜早破、早产。,资料来源：生物通,5,支原体种类举例,1 A.laidlawii,莱氏无胆甾原体,2 A.granularum,颗粒无胆甾原体,3 Mesoplasma pleciae,玉米蛆虫中间原体,4Mycoplasma arginini,精氨酸支原体,5M.hyosynoviae,猪滑液支原体,6M.gateae,猫支原体,7M.faucium,咽支原体,8M.canadense,加拿大支原体,9M.buccale,上颌支原体,10M.orale,口腔支原体,11M.salivarium,唾液支原体,12M.auris,耳支原体,13 M.cloacale,泄殖腔支原体,14M.anseris,鹅支原体,15M.phocicerebrale,16M.falconis,猎鹰支原体,17M.spumans,泡沫支原体,18M.sphenisci,19M.timone,20M.subdolum,疑误支原体,21 M.alkalescens,产碱支原体,22 M.phocirhinis,23 M.maculosum,斑状支原体,24 M.arthritidis,关节炎支原体,25 M.bovis,牛支原体,26 M.spermatophilum,嗜精支原体,27 M.mustelae,水貂支原体,28 M.caviae,豚鼠支原体,29 M.columbinasale,鸽鼻支原体,30M.canis,犬支原体,31 M.hyopharyngis,猪喉支原体,32M.fermentans,发酵支原体,33 M.hyopneumoniae,猪肺炎支原体,34 M.edwardii,爱德华氏支原体,35 M.primatum,类人猿支原体,36 M.opalescens,乳白色支原体,37 M.zalophi,38 M.pulmonis,肺支原体,39 M.collis,希尔氏支原体,40 M.mobile,运动支原体,41 M.indiense,印第支原体,42 M.verecundum,不活泼支原体,43 M.hyorhinis,猪鼻支原体,44 M.gallopavonis,吐绶鸡支原体,45 M.anatis,鸭支原体,46 M.corogypsi,黑秃鹫支原体,47 M.bovirhinis,牛鼻支原体,48 M.alkalescens,产碱支原体,6,支原体的体形多样，基本为球形，亦可呈球杆状或丝状，其菌落呈针尖大小，故又称之为微小支原体。结构比较简单，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。,支原体的大小为,0.2,0.3um,可通过滤菌器。革兰氏染色不易着色，故常用,Giemsa,染色法将其染成淡紫色。细胞膜中胆固醇含量较多，约占,36%,，对保持细胞膜的完整性具有一定作用。凡能作用于胆固醇的物质（如二性霉素,B,、皂素等）均可引起支原体膜的破坏而使支原体死亡。,支原体的形态结构,资料来源：生物通,7,支原体基因组为一环状双链,DNA,，分子量小，,1700kb,（仅有大肠杆菌的,1/5,），,500,个基因，自我复制，合成与代谢很有限。,在细胞外生殖，采用精氨酸、葡萄糖、脲代谢途径；需要胆固醇、氨基酸、脂肪酸、维生素、其它分解代谢物等；对渗透压不稳定。,支原体的代谢特点,红霉素,四环素,卡那霉素,链霉素,氯霉素,核糖体资料来源：生物通,8,支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长。用培养基培养时，营养要求比一般细菌高，除基础营养物质外还需加入,10,20%,人或动物血清以提供支原体所需的胆固醇。最适,pH7.8,8.0,之间，低于,7.0,则死亡，但解脲脲原体最适,pH6.0,6.5,。,大多数兼性厌氧，有些菌株在初分离时加入,5%CO,2,生长更好。生长缓慢，在琼脂含量较少的固体培养基上孵育,2,3,天出现典型的“荷包蛋样”菌落：圆形（直径,10,16um,），核心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区。,繁殖方式多样，主要为二分裂繁殖，还有断裂、分枝、出芽等方式，分裂时二个子细胞大小均匀另外，支原体分裂和其,DNA,复制不同步，可形成多核长丝体。,由于没有细胞壁，因此对影响细胞壁合成的抗生素，如青霉素等不敏感，但红霉素、四环素、卡那霉素、链霉素、氯霉素等作用于核蛋白体的抗生素，可抑制或影响支原体的蛋白质合成，有杀伤支原体作用。在培养基中置入脲素并以硫酸锰作指示剂极易与其他支原体作出鉴别。,支原体的培养特性,资料来源：生物通,9,一般能分解葡萄糖的支原体则不能利用精氨酸，能利用精氨酸的则不能分解葡萄糖，据此可将支原体分为两类。解脲脲原体不能利用葡萄糖或精氨酸，但可利用尿素作能源。,各种支原体都有特异的表面抗原结构，很少有交叉反应，具有型特异性。应用生长抑制试验（,Growth inhibition test,GIT,）、代谢抑制试验,(Metabolic inhibition test,MIT),等可鉴定支原抗原，进行分型。,支原体的生化特性与分型,资料来源：生物通,10,支原体对环境渗透压敏感，渗透压的突变可致细胞破裂。对重金属盐、石炭酸、来苏尔和一些表面活性剂较细菌敏感，但对醋酸铊、结晶紫和亚锑酸盐的抵抗力比细菌大。石碳酸，来苏儿易将其杀死。,对影响壁合成的抗生素如青霉素不敏感，但红霉素、四环素、链霉素及氯霉素等作用于支原体核蛋白体的抗生素，可抑制或影响蛋白质合成，有杀灭支原体的作用。,支原体对热抵抗力差，与细菌相似，通常,55,经,15,分钟处理可使之灭活。支原体的抵抗力,资料来源：生物通,11,很多支原体能够致病。,肺炎：肺炎支原体（,M.Pneumonia,）。,泌尿生殖道感染：人型支原体（,M.humenis,，,MH,）、解脲支原体（,Ureaplasma urealyticum,，,UU,）和生殖器支原体（,M.genitalium,，,MG,）。,关节炎：,M.fementans,M.arthritidis,中枢神经：肺炎支原体（,M.Pneumonia,）,心脏：肺炎支原体（,M.Pneumonia,）,支原体的致病性,12,支原体致病机理,支原体引起细胞损害：,粘附于宿主细胞表面的支原体从细胞吸收营养，从细胞膜获得脂质和胆固醇，引起细胞损伤；,支原体代谢产生的有毒物质，如溶神经支原体能产生神经毒素，引起细胞膜损伤；,脲原体含有尿素酶，可以水解尿素产生大量氨，对细胞有毒害作用。,支原体可以粘附于精子表面，从而阻止精子运动，其产生神经氨酸酶样物质可干扰精子与卵子的结合。这就是支原体感染引起不育不孕的原因之一。,资料来源：生物通,13,1.,抑制细胞增殖：,50%,，竞争营养，分泌有害代谢产物,迅速降低培养液中葡萄糖，形成酸，改变,Ph,值；,消耗精氨酸,抑制蛋白合成,细胞分裂减慢,停止生长,2.,改变细胞特性,改变细菌细胞壁的完整性,改变基因表达谱,消耗,50%,的总蛋白,降低转染效率,产生染色质凝聚,几乎影响宿主细胞所有的功能！,支原体对细胞培养的危害,14,1.,抑制病毒扩增：竞争蛋白,(50%),与核酸,(15-30%),2.,改变细胞特性：导致病毒扩增受阻,3.,影响病毒感染效率：影响病毒疫苗效价,4.,影响疫苗对动物的免疫效果,5.,提高疫苗生产成本,6.,对畜牧业生产带来隐患,支原体对病毒疫苗生产的危害,15,支原体对细胞培养污染的频率,莱氏无胆甾原体,精氨酸支原体,猪鼻支原体,口腔支原体,人型支原体,发酵支原体,唾液支原体,修改自,VenorGeM,公司,16,支原体污染源,口腔支原体（,M.orale,）,精氨酸支原体（,M.arginini,）,猪鼻支原体（,M.hyorhinis,）,莱氏无胆甾原体（,A.l aidlawii,）,工作环境,操作者本身,培养基,细胞交叉污染,实验器材,原始组织或器官,大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。,95,污染源,支原体污染的来源,17,支原体污染的检测,定期检测支原体污染的必要性：,1.,细胞培养条件是支原体生长的最佳环境，污染随时可能发生；,2.,即使支原体含量达,10,7,10,8,个,/ml,，亦无明显征兆；,3.,普通光学显微镜不能发现污染；,4.,普通抗生素使污染在检测值之下，稍有变化就会爆发。青霉素不能够防止污染。,18,支原体污检测的立法及对象,美国,FDA,：,21CFR610.30,法案,美国,USDA,：联邦法,#9CFR113.28,欧洲药典,2.6.7,附则,5.8,ICH,生物技术及生物产品指南,各种生产性细胞培养，贮存的病毒株,来源于细胞培养的产品（抗生素，激素，免疫激活剂，血液产品）,人用及兽用疫苗,International Conference on Harmonisation,国际立法,对象：,European Pharmacopoeia,19,中华人民共和国兽用生物制品规程,和,中华人民共和国兽用生物制品质量标准,规定：,兽用疫苗半成品或成品必须检测支原体合格！,支原体污检测的立法及对象,20,病毒疫苗生产管理及质量控制要点规定：,生产管理要点：,原料及辅料,生产用器具,生产用动物,生产用细胞株,生产用种毒,质量控制要点：,种子批,原代,/,传代细胞,病毒收获,病毒原液,半成品,/,成品,资料来源,动物生物疫苗,冯忠武主编,21,支原体污染检测的方法,荧光染色法：,简单，活支原体,操作稍复杂，费时,不能断定种类，,需要有经验,资料来源：生物通,22,荧光染色法,处理,未处理,清华资料,23,支原体污染检测的方法,培养法：,培养基及培养条件要求严格；,不同种类的培养条件不一致；,特别费时（,14,周）；,分析困难；,肉汤培养和平皿培养均行；,优点：仅检查活支原体；,敏感度：,1 CFU-30 GU,。,What are the differences between Genomic Units and Colony Forming Units?,There is a difference between GU and CFU as they define different properties of the cells.CFU is a measure unit of the ability of a cell to form a colony.GU is a measure of DNA present in a single cell.GU values are often higher because it detects stressed cells or intra-organelle cells which wouldnt normally be detected by culture methods.,修改自,VenorGeM,公司,24,支原体污染检测的方法,（,1,）肺炎支原体培养基,基础培养基,70ml,牛血清（灭活）,20ml,25,的酵母浸液,10ml,50,葡萄糖,1,2ml 0.4,酚红,0.5ml,制霉素,0.001g,青霉素,10,万,IU,pH 7.8,基础培养基：,Hayflick,培养基（,PPLO,培养基），牛心粉,50g,蛋白胨,10g,氯化钠,5g,加,14g,琼脂,粉为固体培养基,（,2,）人型支原体培养基,基础培养基,70ml,马血清,20ml,25,的酵母浸液,10ml,30,L,精氨酸,0.33ml,0.4,酚红,0.5ml,制霉素,0.001g,青霉素,10,万,IU,pH 6.3,（,3,）解脲支原体培养基,基础培养基,70ml,马血清,20ml,25,的酵母浸液,10ml,30,尿素,0.33ml,0.4,酚红,0.5ml,制霉素,0.001g,青霉素,10,万,IU,pH 6.0,注：由于支原体能在人工培养基上生长，但是营养要求较高，需要提供胆 固醇和酵母才能生长。以上配方中，马（牛,),血清提供胆固醇，酵母浸液提供酵母。,资料来源：,美蓝,2.5g,天青,1.5g,麦芽糖,10g,碳酸钠,0.5g,蒸馏水,100ml,染色时，直接吸染色液覆盖菌落，,1min,后，用生理盐水洗去染色液，低倍镜下可见支原体菌落呈蓝色，而其他菌体菌落不着色。,培养条件：,培养温度,37,，,510,CO,2,。接种量,10,4,10,5,cfu,。,解脲支原体培养,1618 h,即可达到对数生长期。,人型，肺炎，,2448 h,即可达到对数生长期,（,2,）生化反应,特异代谢物反应：,解脲支原体分解尿素不分解精氨酸，生成,NH3,使培养基的,ph,升高，酚红指示剂变红。,人型支原体分解,L,精氨酸不分解尿素，生成,NH3,使,PH,值升高，酚红指示剂变红。肺炎和人型支原体分解葡萄糖，使,pH,降低，酚红指示剂由红变黄。,（,3,）特异性生长抑制试验,在含,0.002%,美蓝的培养基中肺炎支原体能生长且将美蓝还原而退色，其他口腔、唾液或发酵支原体均被抑制生长，此法可鉴定肺炎支原体。,资料来源：,PCR,仪的稳定性。,M,+,-,1,2,3,4,5,1,2,3,4,5,样本批,1,样本批,2,+,-,只阳不阴：千万以上；,半阳半阴：千级左右；,只阴不阳：一个以下。,29,支原体污染检测的其它方法,化学发光检测法：,嘌呤核苷磷酸化酶,(6-MPDR),实验：,酶联免疫检测法：,需要化学发光检测仪；,最低灵敏度为,10,5,CFU,；,样品质量要求高易使用,无需检测仪；,需要细胞系；灵敏度差；,易操作,需要,ELISA,检测仪；,对支原体的种类特异,灵敏度适中为,10,6,CFU/ml,；,集中测定,30,支原体污染的清除,支原体清除非常困难！,毛主席语录：,一个人做一件好事并不难，难的是一辈子做好事，不做坏事！,31,目前国内支原体污染的现状,资料来源：宁宜宝 冀锡霖,中国兽药杂志,1993,年,27,卷,1,期,1987-1990,32,目前国内支原体污染的现状,任杰，张绍芬，张映,中国畜牧兽医,2008,年,35,卷,10,期,2005,2008,33,目前国内支原体污染的现状,2009-2010,猪瘟弱毒苗,蓝耳弱毒苗,口蹄疫灭活苗,内部结果，不得外传,34,支原体污染清除刻不容缓！,支原体污染不清除，,后果很严重！,疫苗生产不合格！,35,支原体污染防止方法,.,严格操作！,.,定期对环境消毒！,.,定期做支原体检测！,.,避免互相交叉感染！,36,支原体污染清除方法,.,高压灭菌！,.,完全固定！,.,破坏,DNA,！,37,细胞培养中支原体污染清除方法,.,抗生素：,一般活性：,Ciprofloxacin(Ciprobay,Ciproxin),Doxycyclin,低活性：,Plasmocin,Chloramphenical,Clindamycin,Azithromycin,Clarithromycin,Tetracyclin,Tiamulin,无活性：,Penicillin,Streptomycin,Polymyxin,Vancomycin,Erythromycin(,对有些种有效,),Cephalosporine,Sulfametaxol,G418(Geneticin,Gentamycin-Analogon),Bacitracin,38,细胞培养中支原体污染清除方法,.,抗生素：,试剂盒,Roch,（罗氏）：,BM-Cyclin,泰妙菌素,+,二甲胺四环素,Biolnd,：,BIOMYC,泰妙菌素,+,二甲胺四环素,+,环丙沙星,Invivogen,：,Plasmocin,泰妙菌素,+,二甲胺四环素,MP Biomedicals(LCN),：,Mycoplasma Removal Agent(MRA),喹诺酮衍生物,价格昂贵,39,细胞培养中支原体污染清除方法,.,物理化学方法：,.,生物方法：,加热灭活：,4042,o,C,光灭活：,Hoechst 33258/5-Bromuracil,与巨噬细胞共培养,40,工业生产中支原体污染清除方法,清华大学与北京赛尔泰和生物有限公司,工业化生产支原体清除方案,试剂,A,试剂,B,试剂,C,接种细胞,传代细胞,传代细胞,传代细胞,传代细胞,传代细胞,传代细胞,传代细胞,生产细胞,收毒,接毒,PCR,检测,试剂,A,试剂,B,试剂,C,本方案因具体生产工艺而有变动！,清华资料,41,M,+,-,1,2,3,4,5,1,2,3,4,5,处理后,处理前,+,-,工业生产中支原体污染清除方法,清华大学与北京赛尔泰和生物有限公司,工业化生产支原体清除结果,清华资料,42,让我们一起努力,清除支原体污染,为,而奋斗！,43,谢谢大家！,44,常智杰,北京清华大学医学院,A307,电话：,62785076,手机：,13910739540,zhijiec,联系方式：,45,