免疫组化原理及流程介绍.ppt

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免疫组化的基本流程,免疫组化原理及流程简介,1.,脱蜡与水化,2.,细胞通透、封闭内源性过氧化物酶,3.,抗原修复、暴露抗原决定簇,4.,封闭非特异性蛋白,5.,一抗孵育,6.,二抗孵育,7.SP,反应,8.,显色,9.,复染、脱水、透明、封片,2.,细胞通透、封闭内源性过氧化物酶,免疫组化原理及流程简介,1.,脱蜡与水化,脱蜡与水化的目的是保证抗体等其他试剂可以充足与组织中抗原等结合发生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。,60 20 minXylene,：,2 10 minutes,；,100%absolute ethanol,：,2 5 minutes,；,95%ethanol 2 minutes,；,80%ethanol 2 minutes,；,70%ethanol 2 minutes,；,distilled water:5 min,；,PBS,洗,3 3 min,。,详细操作,免疫组化原理及流程简介,2.,细胞通透与封闭内源性过氧化酶,目的是使抗体可以充足地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。,(1),细胞通透,免疫组化原理及流程简介,(2),封闭内源性过氧化酶,其重要目的是减少内源性过氧化物酶的活性。在老式的ABC法和SP法中，免疫组化反应成果轻易受到内源性过氧化物酶的干扰，必须用过氧化氢等进行灭活。,1),用封闭通透液浸润切片,30 min,（,RT,避光）。,其配法是用预热,40 ml PBS,加,120ul TritonX-100,加热几分钟，在临用前加,400 ul,的,30,H2O2,。,2)PBS,溶液洗,3,次,3 min,。,免疫组化原理及流程简介,详细操作:,免疫组化原理及流程简介,3.,抗原修复 暴露抗原决定簇,由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。,免疫组化原理及流程简介,常用的修复措施从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。,抗原修复的重要措施:,酶消化措施一般用于细胞内抗原,应用高频电磁波打开蛋白质间的交联键,免疫组化原理及流程简介,将切片放入,001 M,柠檬酸钠缓冲 溶液（,pH6.0,）后，在微波炉里高火,4 min,至沸腾后，取出，冷却至室温，再加热，约,4,次，每次间隔补足液体，防止干片。,2)PBS,溶液洗,3,次,3 min,。,详细操作（微波修复）：,1),免疫组化原理及流程简介,4.,封闭特异性蛋白,组织切片上有些剩余的位点可以与一抗非特异性结合，导致后续成果的假阳性。,封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中有某些动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合。,免疫组化原理及流程简介,将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入,5%,羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温约,30),下,10,30min,。,详细操作：,大一点,免疫组化原理及流程简介,5.,一抗孵育,一抗,:,可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。,一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。,一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。详细条件还要探索。,免疫组化原理及流程简介,1.,防止脱片；,2.,使抗原抗体结合更稳定。,甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（,1,：,250,、,500,、,1000,）后，放入湿盒中室温,1,小时，然后,4,度过夜，冰箱中取出后需,37,复温,45 min,。,免疫组化原理及流程简介,详细做法：,免疫组化原理及流程简介,6.,二抗孵育,二抗:可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标识(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。,二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，详细时间需要探索。,但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去探索一抗浓度和孵育时间。,免疫组化原理及流程简介,1),将一抗倒掉并用,PBS,洗,5 min5,次；,2),用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入,37,恒温烤箱中,30 min,。,3),用,PBS,洗,5,次,5 min,免疫组化原理及流程简介,详细操作：,7.SP,反应,SP染色法即链霉素抗生物素蛋白 生物素过氧化酶连接法。,该法是ABC法基础上的深入改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO基。,免疫组化原理及流程简介,1,）加入,SP,复合液后放入,37,度烤箱中,30 min,。,2,）用,PBS,洗,5,次,5 min,。,详细操作：,SP染色法的特点:,敏捷特异性低，成本低。,免疫组化原理及流程简介,8.,显色,在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物自身没有颜色，不能直接观测，只能借助于其他某些化学基团的显色作用，是复合物显色，有助于显微镜下观测。,免疫组化原理及流程简介,一般在过氧化物酶（HRP）法中，显色剂为DAB。,DAB(3,3-,二氨基联苯胺显色液,),配法,:,DAB 50mg,0.05M TB 100ml,30%H2O2 30-40ul,ABC,法,SP,法,PAP,法,免疫组化原理及流程简介,9,、复染、脱水、透明、封片,复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目的蛋白进行定位，常常用的试剂为苏木素。,片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蓝即可。,1),用,PBS 3,次,3min,后，用双蒸水洗,5 min,；加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染,20 s,），自来水冲洗，双蒸水洗,5 min,，再用,PBS,返蓝,5 min,。,2),脱水,：,50%ethanol(1-2)min;70%ethanol(1-2)min;95%ethanol,（,1-2,）,min,；,95%ethanol,（,1-2,）,min,；,100%absolute ethanol:(1-2)min,；,100%absolute ethanol:(1-2)min,。,3),透明：,Xylene 1(1-2)minXylene 2(1-2)min,4),封片：中性树胶。,免疫组化原理及流程简介,免疫组化原理及流程简介,四 免疫组化成果分析,免疫组化成果的判断原则：,1.必须设对照。,2.抗原体现必须在特定部位。,3.阴性成果不能视为抗原不体现。,免疫组化原理及流程简介,试验分析的有关简介,阳性对照：,用已知抗原阳性的切片与待检标本同步进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性成果，标为阳性对照。,用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性成果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对照还应包括空白、替代、吸取和克制试验。,阴性对照：,免疫组化原理及流程简介,阳性对照,阴性对照,替代对照,实验 组,结论,1,操作错误,2,非特异性反应,3,阴性对照含定位,Ag,4,阴性对照不含定位,Ag,5,受检组织非特异性染色,6受检组织不含定位,Ag,7,受检组织含定位,Ag,免疫组化染色试验组与对照构成果分析表,免疫组化原理及流程简介,从表上可以看出，只有6，7试验成果故意义。15均因对照组的成果已否认Ab的特异性或因IHC技术操作存在错误等而使试验成果失去意义，必须反复试验或换用 Ab.,阳性对照,阴性对照,替代对照,实验 组,结论,6,受检组织不含定位,Ag,7,受检组织含定位,Ag,免疫组化原理及流程简介,1阳性染色特点,Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有构造性。（非特异性染色 细胞与组织无区别）,染色强度不一样：颜色深浅不一（非特异性染色 弥散性均匀）。,除上述对照成果分析之外，还必须从如下几种方面综合评价：,2,组织切片制作过程的影响,固定不良,非特异性染色，显示不均。,边缘干燥,非特异性染色（常见），加抗体时勿干片。,免疫组化原理及流程简介,3人工假象与特异性成果显示不在同一 平面上。,免疫组化原理及流程简介,染色失败的几种原因：,(1)所染的所有切片均为阴性结,果，包括阳性对照在内。,染色失败的也许状况,(2),所有切片均呈阳性反应,(3),所有切片背景过深,(4),阳性对照染色良好，检测的,阳性标本呈阴性反应,免疫组化原理及流程简介,(1),所有切片呈阴性,1,）染色未完全严格按照操作步骤进行,2,）漏加一种抗体，或抗体失活,3,）,缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性,4,）,底物中所加,H2O2,量少或失活,5,）,复染或脱水剂使用不当,免疫组化原理及流程简介,切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。,缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不精确，洗涤不彻底。,使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。,抗体温育的时间过长。,H2O2,浓度过高，呈色速度过快且粘,附剂太厚。,（,2,）所有切片呈阳性反应，其原因：,免疫组化原理及流程简介,（,3,）,所有切片背景过深,内源性过氧化酶没有完全阻断,切片或涂片过厚,漂洗不够,底物呈色反应过久,蛋白质封闭不够或所用血清溶血,使用全血清抗体稀释不够,免疫组化原理及流程简介,（,4,）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。,最常见的原因是：,标本的固定和处理不妥,1.苏木素复染时间需要探索，尤其要考虑阳性染色的位置。,2.切片脱蜡和水化要充足；加反应液时要覆盖组织充足；每次加 液前甩干洗涤液，但又防止干片。,免疫组化原理及流程简介,注意事项：,3.如下原因也许导致片子着色不均匀：,脱蜡不充足。可以 60 烤 20 min，立即放入新鲜的 二甲苯中；,水化不全。应常常配制新鲜的梯度乙醇；,抗体没混匀。用移液器充足混匀一抗/二抗等试剂；,抗体孵育时，切片放倾斜；,抗体孵育后 PBS 冲洗不充足。,制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。,免疫组化原理及流程简介,4.,一抗的清洗：,免疫组化原理及流程简介,（1）单独冲洗，防止交叉反应导致污染。,（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐用浸洗方式；,（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。,5.PBS,的,PH,和离子强度的使用。,免疫组化原理及流程简介,提议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。,中性及弱硷性条件（PH7-8）有助于免疫复合物的形成，而酸性条件则有助于分解；低离子强度有助于免疫复合物的形成，而高离子强度则有助于分解。,5.,拍照,免疫组化原理及流程简介,有条件的话最佳立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。,免疫组化原理及流程简介,谢 谢,谢谢欣赏！,/11/5,48,