奈瑟菌的分离和鉴定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,奈瑟菌的分离和鉴定,卫生部北京医院,陈东科,、脑膜炎奈瑟菌,脑膜炎奈瑟菌,(Neisseria.meningitidis),简称脑膜炎球菌，是引起流行性脑脊髓炎（简称“流脑”）的病原菌。多发年龄在,529,岁。对本菌的鉴定是确定诊断的重要依据，同时给临床治疗提供参考价值。,人类是脑膜炎球菌的唯一宿主。流行性脑脊髓炎病人和带菌者是本病的传染源。本病经飞沫传染，潜伏期,14d,。细菌首先侵害鼻咽腔，引起上呼吸道感染或局部炎症。当少量细菌侵入血流时，可引起菌血症突发恶寒、发热、恶心、呕吐等，并有出血或红斑性皮疹及脾肿大。当大量细菌侵入血流时，由血液或淋巴到达脑脊髓膜则发生脑脊髓炎的症状和体症。在我国以,A,群流行为主。,1.,生物学性状,（,1,）形态与染色,脑膜炎球菌为革兰阴性双球菌，菌体呈肾形或豆形，成双排列凹面（短轴）相对。由病人体内新分离的菌株有多糖荚膜。,（,2,）培养特点,本菌为专性需氧菌，营养要求高，,58%CO,2,可促进生长，其最适生长温度为,3637,，最适,pH,值为,7.47.6,。在巧克力平板上经,1824h,培养，形成圆形、光滑、透明、湿润、边缘整齐菌落。直径,23mm,，在血平板上不溶血。培养时间延长，由于细菌自溶酶的作用，菌落可变成酪样或胶样。,（,3,）生化反应特点,脑膜炎球菌可分解葡萄糖、麦芽糖，产酸不产气。不分解蛋白质，不产生靛基质，不产生硫化氢，不分解尿素，硝酸盐还原试验阴性，氧化酶试验阳性。,2.,标本采集：,根据病期不同，采集的标本也有所不同。菌血症期病人可采取血液；出现出血点或瘀斑者，可挑取瘀斑渗出液；如出现脑脊髓膜刺激症状者，必要时可抽取脑脊液；上呼吸道感染期的疑似病人和带菌者，可取鼻咽腔分泌物进行检查。因该菌易自溶，故应立即送检，最好在床边接种。,3.,检验方法：,（,1,）直接检查法：,1,）脑脊液,以无菌方法获得脑脊液标本后，经,3000r/min,离心,30min,，取沉淀物，首先接种培养，然后再涂片染色检查。通常制两张涂片，一张作革兰染色，一张作美蓝染色进行镜检。若脑脊液较清应先增菌，即在脑脊液中加入少量葡萄糖肉汤培养液，经,37,46h,增菌培养后，再行涂片染色镜检，可提高阳性检出率。一般情况下，患病早期的脑脊液中脑膜炎球菌数量较少，且大多数在细胞外；在疾病后期菌量增大，大多数在细胞内。,2,）瘀斑（出血点）,选择细小的色泽鲜红，境界明显的瘀点，或无瘀点时用充血皮肤，经消毒干燥后刺入,0.5cm,，用清洁玻片采血三滴，涂成血膜片，自然干燥。用美蓝或革兰染色镜检。第一滴血含菌量比第二、三滴血高数倍，故不能按常规采血弃去第一、二滴血。,（,2,）培养检查法,1,）脑脊液,取脑脊液离心沉淀物，立刻接种巧克力平板，,37,，,58%CO,2,环境培养,1824h,。如脑脊液混浊可直接种入培养基。,2,）瘀斑渗出物,渗出物直接涂于巧克力平板上，,37,，,58%CO,2,环境培养,1824h,。,3,）鼻咽腔分泌物,将绵拭标本立即涂于，,P.V(Polymyxin B.Vancomycin),卵黄琼脂或,P.V,巧克力平板一端，再用接种环划线分离，进行培养观察。,4,）血液,抽取静脉血,58ml,，立刻接种注入血培养瓶，按血液细菌培养常规操作。,（,3,）生化反应,取纯培养物，如其形态、菌落特征典型，氧化酶阳性，可按表,1,进行鉴定。,（,4,）凝集试验,包括血清凝集试验、,SPA,协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。,（,5,）荚膜肿胀试验,取一接种环菌掖或脑脊液，于玻片上，再加一环抗血清及二环吕氏美蓝液混合，加上盖玻片，,20min,，用油镜观察荚膜是否肿胀，同时用盐水作对照。此试验仅适用于,A,群和,C,群菌株。,二、淋病奈瑟菌,淋病奈瑟菌（,N.gonorrhoeae,）简称淋球菌，它是淋病的病原菌。主要通过不洁性交引起泌尿生殖系统化脓性炎症，也可通过污染器械、带菌衣物、用具发生间接污染。也有肛门及咽部的淋球菌感染病例。新生儿经过产道时，可被感染而患淋病性眼结膜炎。,1.,生物学性状：,（,1,）形态与染色,淋球菌的形态与脑膜炎球菌很相似，菌体呈球形、肾形或豆形，成对排列，两球菌接触面平坦，形似一对黄豆。革兰染色阴性，无芽孢、无鞭毛、有荚膜。在急性淋病患者尿道脓汁标本中可见细菌被吞噬于中性粒细胞内；慢性淋病时多在细胞外。,（,2,）培养特点,本菌对营养要求高，需用巧克力平板，或含万古霉素、多粘菌素及制霉菌素的,Thayer-Martin,培养基（,GC,琼脂加生长添加剂）才能生长。初次分离需供给,58%CO,2,，最适生长温度为,3637,，最适,pH,值为,7.5,。经,48h,培养，形成圆形、不透明、灰白色凸起，细小颗粒状菌落。直径,0.61.0mm,，进一步培养，菌落可呈粘液样。,（,3,）生化反应特点,淋球菌只分解葡萄糖，产酸不产气，不产生靛基质，不产生硫化氢，硝酸盐还原试验阴性，氧化酶及触酶试验均阳性。,2.,标本采集：,（,1,）男性,尿道炎患者，先以无菌生理盐水清洗尿道口，采集尿道脓性分泌物；前列腺炎患者则从直肠侧对前列腺进行按摩，待分泌物排出后采集。,（,2,）女性,尿道炎患者，先以无菌生理盐水清洗尿道口，从阴道后壁由后向前压迫尿道，使分泌物排出，然后用无菌拭子或接种环采集；对于宫颈炎患者，先无菌生理盐水清洗宫颈口和阴道壁，再用阴道窥镜压迫子宫阴道部，使分泌物排出，然后用无菌拭子或接种环采集标本；合并肠炎的患者，可在直肠镜下，用无菌绵拭子采集直肠窝粘膜的粘液进行送检。,（,3,）眼分泌物、血液、关节液等,以无菌操作方式采集。,注意事项：,最好在治疗前采集样品；取材前不论有无症状一律禁用消毒药；对女性患者取材时不要碰阴道粘膜，以防污染正常菌群；由于本菌抵抗力甚弱，标本采集要迅速并立即送检，最好床边接种，立即培养。,3.,检验方法：,（,1,）直接检查法,取标本直接涂片进行革兰染色，急性期在脓细胞内可找到许多革兰阴性双球菌，有诊断意义。本法最适用于泌尿生殖道标本，男性与培养结果符合率达到,98%,，一般可不作培养；女性与培养结果符合率仅达,50%,左右，需进行培养鉴定。,（,2,）培养检查法,采取脓汁或粘液标本后，应立即接种于预温的巧克力平板上进行分离培养。,（,3,）生化反应,取纯培养物，如其形态、菌落特征典型，氧化酶阳性，可按表,1,进行鉴定。表,1 G,-,球菌的鉴别特征,菌 名 巧克力琼脂 营养琼脂 葡萄糖 麦芽糖 还 原 还 原,DNA,酶 乙酰脂酶,（,22,）（,35,）,NO,3,NO,2,脑膜炎奈瑟菌,+,淋病奈瑟菌,+V ,卡他莫拉菌,V +,其他奈瑟菌,V +*V ,*,粘膜奈瑟菌阳性。,V:,不定。,三、其他奈瑟菌,其他奈瑟菌大多寄居在人的上呼吸道中，很少有致病性。菌落较干燥，有咬琼脂的现象，大多呈黄色。也有少数菌落呈光滑型，且无色素，易于脑膜炎奈瑟菌及嗜血杆菌菌落相混淆，应注意鉴别，奈瑟菌落一般较粘，用接种环不易刮取。,解乳糖奈瑟菌,浅黄奈瑟菌,编织奈瑟菌,编织奈瑟菌,淋病奈瑟菌是否需要进行,-,内酰胺酶的检测？,一般来说，不需要对淋病奈瑟菌中的,-,内酰胺酶进行检测。,当前经验治疗淋病的药物为头孢曲松、头孢克肟或喹诺酮类抗菌药物，而这些药物的抗菌活性均不受,-,内酰胺酶的影响。由于多年前就已经不提倡用青霉素进行经验治疗，因此，不必要对淋病奈瑟菌进行,-,内酰胺酶的测试。除非在有些国家，青霉素仍在使用且有一定的抗菌活性，在这种情况下，就有必要进行,-,内酰胺酶的检测。另外，出于流行病学调查的需要，美国一些公共卫生部门可能也会要求实验室进行,-,内酰胺酶的测试。但在大多数情况下，绝大部分的公共卫生部门可以从国家性、地区性和当地的耐药监测网络中得到这些数据，从而不需要实验室常规对林病奈瑟菌进行,-,内酰胺酶的检测。,谢谢！,