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虾青素分析测定方法的研究
科学技术与应用 罗玉芳 约3713字 【摘 要】选择分光光度法及高效液相色谱法对测定虾青素的分析条件进行研究从而得出最佳的测定条件。用分光光度法和高效液相色谱法测定虾青素标准曲线的回归方程的R2都超过了0.99。用分光光度法测定虾青素回收率范围为99.3-101相对标准偏差RSD值为0.78-1.3用液相色谱法测定虾青素回收率范围为100-102 相对标准偏差RSD为0.62-1.4。这些值都在定量分析所要求的阈值范围内可以用于定量分析。 【关键词】分光光度法高效液相色谱法虾青素 Abstract Choice two based on the spectrophotometry and high performance liquid chromatography HPLC were developed for determination the astaxanthin. And the optimum conditions was investigated in detail. The total amount of astaxanthin was measured by spectrophotometry the recoveries were in the range of 99.3-101 and RSD were in the range of 0.78 -1.3 . Also the astaxanthin was determined by HPLC and the recoveries were in the range of 100 -102 RSD were in the range of 0.62-1.4. All these values were within the range of permissive threshold value on quantitative analysis which showed that it’s feasible for measuring the content of astaxanthin by these two methods. Key words: spectrophotometryHPLCastaxanthin 从动植物及菌类中提取虾青素目前还处于实验研究的基础阶段要实现产业化生产虾青素还必须对其提取工艺进行广泛深入的研究。要开展这方面的研究必须建立起快速、高效、简便的虾青素分析方法。虾青素是一种类胡萝卜素1分光光度法和高效液相色谱法是常用的两种类胡萝卜素分析方法23这两种方法各有特点类胡萝卜素分子因其分子结构中的共轭双键体系及离域化的π电子在可见光区表现出强吸收带且每种类胡萝卜素分子的最大吸收峰位置与紫外可见光光谱的精细结构都是具有特征性的。由于类胡萝卜素分子的这种光吸收性质溶液中的类胡萝卜素一般服从Beer-Lambert定律所以通过分光光度法可实现对其精确的定量分析4高效液相色谱法具有分离速度快在线检测如UV 检测器灵敏度高等优点是美国NFIA美国饲料协会规定的测定方法。本工作旨在通过对分光光度法和液相色谱法测定虾青素的研究从而建立快速、有效、准确的测定虾壳中虾青素的方法。 一、材料和方法 一材料 1仪器721型分光光度计上海精科食品厂 高效液相色谱仪日本岛津公司 18 色谱柱250 mm×4.6 mm迪马公司 恒温箱 202-1 型上海市上海县试验仪器厂 JA2003 上皿电子天平上海天平仪器厂 2试剂虾青素标准品分析纯美国sigma公司乙腈色谱纯甲醇、无水乙醇、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、石油醚等均为分析纯。 二实验方法 1分光光度法 准确称取一定量的虾青素纯样品多份分别用乙醇有机溶剂溶解后各自配制成1.0μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL、5.0μg/mL、6.0μg/mL的标准溶液用721型分光光度计测定不同波长下的吸光度。在最大波长下以试剂空白调零测其吸光度。 以虾青素标准溶液的浓度为横坐标对应的吸光值为纵坐标绘制标准曲线。 2高效液相色谱法 1. 色谱工作条件 色谱柱C18250mm×4.6mm。流动相乙醇甲醇二氯甲烷751510V/V流速为1.0mL/min。柱温室温。检测波长为480nm进样量20μL。 2. 标准工作曲线绘制 称取一定量的虾青素标准溶液用甲醇配制浓度分别为1.0 μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL、8.0μg/mL、10.0 μg/mL标准溶液分别取20μL进样根据峰面积与相应的浓度进行线性回归绘制标准工作曲线。 二、结果与分析 一分光光度法分析虾青素 1虾青素标准样品在乙醇溶剂中的最大吸收波长 我们将虾青素标准样品溶解在乙醇溶剂中在400 nm 至700 nm范围内测其吸光度结果如图1。从图中可以看出虾青素标准样品在乙醇溶剂中的最大吸收波长为474 nm。 图片 2虾青素标准样品在乙醇有机溶剂中的标准曲线 准确称取一定量的虾青素纯样品多份分别用乙醇有机溶剂溶解后以试剂空白调零用721型分光光度计测其吸光度。以虾青素标准溶液的浓度为横坐标对应的吸光值为纵坐标绘制标准曲线。结果见图2。 条件测定波长λ474nm 图片 从图2中可以看出在乙醇溶剂中虾青素浓度与其吸光度具有良好的线性关系相关系数R2大于0.999通过测得的吸光度按其线性回归方程可计 算虾青素的浓度。 3回收率和精密度试验 精密称取虾青素10.00mg置100mL容量瓶中分别加入浓度为100μg/mL虾青素标准储备液2mL、3mL、4mL用乙醇溶解并稀释至刻度。用新建立的方法对其进行分析计算回收率及精密度值实验结果如表1所示。 图片 条件同图2 从表1可以看出虾青素的回收率范围为99.3-101相对标准偏差RSD值为0.78-1.3。 二液相色谱法分析虾青素 1 检测波长的选择 由于HPLC的检测器是紫外检测器综合考虑乙醇有机提取溶剂的最大吸收值及灵敏度最终选择紫外检测波长为480 nm。 2 色谱柱类型的选择 利用高效液相色谱法测定色素的国家标准大部分都是使用C8或C18为填料的反相液相色谱法根据本实验室现有条件采用了填料为C18的色谱柱来进行虾青素的液相色谱测定试验。 3 流动相及其他色谱条件的选择 甲醇、乙腈、四氢呋喃、水、甲醇、二氯甲烷、丙酮等是高效液相色谱法中最常用的流动相。在反相色谱中极性大的组分因K值较小先流出色谱柱极性较小的组分后流出。流动相中有机溶剂的比例增加流动相极性减小洗脱力增强。用水-甲醇作为流动相显然比较经济但我们试验的结果是出峰时间较后且峰形较胖所以本实验最终采用乙腈甲醇二氯甲烷751510体积比作为流动相超声波脱气进样前样品用0.45 μm微孔滤膜过滤。流速1mL/min检测波长为480nm进样量20μL柱温为室温。 4标准工作曲线及色谱图 图片 如上1.2.2.2配制系列标准溶液按给定色谱条件试验以峰面积y对各组分浓度x求回归方程并绘制标准工作曲线实验结果见图3。 由图3可知虾青素浓度在1.010.0μg/mL 时其浓度与峰面积成一直线关系。在此浓度范围内其标准曲线的回归方程为y139580x3470其中y表示HPLC峰面积x 表示游离虾青素浓度μg/mL。相关系数R0.9999线性相关性很好。图4为虾青素标准样品的高效液相色谱图。由图中可知出峰时间为7.432 min左右的峰为游离虾青素。 图片 5回收率和精密度测定 精密称取虾青素10.00mg置100mL容量瓶中分别加入浓度为100μg/mL虾青素标准储备液5mL、6mL用流动相溶解并稀释至刻度。用新建立的方法对其进行定量分析每个样品平行做3个计算回收率及精密度值实验结果如表2所示。 图片 条件同图4. 从表2中可以看出虾青素的回收率为100-102虾青素测定的相对标准偏差RSD为0.62-1.4。 三、结论 利用虾青素不溶于水易溶于有机溶剂的特点将虾青素标准样品经有机溶剂处理后利用分光光度法和高效液相色谱法对其虾青素含量进行测定其标准曲线的回归方程的R2都超过了0.999线性良好能用于定量分析测定。用分光光度法测定虾青素回收率范围为99.3-101相对标准偏差RSD值为0.78-1.3用液相色谱法测定虾青素回收率范围为100-102相对标准偏差RSD为0.62-1.4。这些值都在定量分析所允许的阈值范围内5说明用分光光度法和高效液相色谱法均可用来准确地测定虾青素。 参考文献 1 李浩明高蓝虾青素的结构、功能与应用精细化工2003200135-40 2 应国清王晓艳沈寅初高效液相色谱法分析检测虾青素食品与发酵工业2001271143-44 3 J. J . Scdmak D. K. Weerasinghe S. O. Jolly. Extraction and quanfitafion of astaxanthin from Phaffia rhodozyma.Bioteehnol Tech 1990 4:107-112. 4 惠伯棣类胡萝卜素化学及生物化学北京中国轻工业出版社2005 5 L. R. Armenta L. I. Guerrero S. Huerta. Astaxanthin extraction from shrimp waste by lactic fermentation andenzymatic hydrolysis of the carotenoprotein complex. J Food Chem 2002 673:1002-1006