EGFR荧光原位杂交与免疫组化检测的比较分析解析.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,EGFR,荧光原位杂交与免疫组化检测的比较分析,广州医科大学附属第一医院 病理科,林毅妍,序言,近年来，以表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）为治疗靶标的分子靶向治疗在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）治疗中越显突出。EGFR基因的检测不仅可认为分子靶向药物的使用提供有效指导，也可认为肺癌治疗措施的制定以及肺癌预后的鉴定提供重要信息。目前临床病理工作中，对EGFR基因扩增的检测使用较多的措施有荧光免疫原位杂交FISH）技术、免疫组化（IHC）检测技术、PCR扩增检测技术等。本文将对荧光原位杂交与免疫组化两种检测进行比较分析。,材料,标本来源：广州医科大学第一附属医院1月1月行支纤镜及手术切除的NSCLC病例，其中男性21例，女性19例；年龄3085岁，中位年龄58岁。所有标本均经10%中性缓冲福尔马林液固定，常规石蜡包埋。40例标本行持续切片，同步行FISH检测与免疫组化检测。,重要试剂与仪器,蛋白酶 K，探针：GLP EGFR/CSP7探针（北京金菩嘉企业），胃蛋白酶消化液，人抗EGFR单克隆抗体（即用型）购于福州迈新生物企业。Dako 杂交仪、观测用 Olympus BX51型显微镜和Nikon H600L荧光显微镜。,检测措施,（,1,）,FISH,检测：,3m,组织切片,TO,脱蜡至水,煮沸去离子水处理,15min,室温下,2SSC,中漂洗,2,次，每次,5min,在组织上滴加蛋白酶,K,工作液，在,37,预热的孵育盒中消化,3,5min,室温下用,2SSC,溶液中洗涤,2,次，每次,5min,，乙醇梯度脱水，自然干燥,避光环境中，探针混合液滴于玻片杂交区域,在温度,80,的自动杂交仪中变性,5 min,，,42,杂交,16,小时,第二天,46,水浴箱中,2SSC10min,，,0.1%NP40,溶液洗涤,5min,，室温,70%,乙醇,3min,暗处自然干燥玻片后加,DAPI,复染液，放于暗盒中复染,5min,Olympus BX51型荧光显微镜在DAPI/FIFC/RHOD三色滤光镜激发下观测间期细胞荧光杂交信号,检测措施,（,2,）,IHC,检测：,3m,组织涂胶片，,57,烤片过夜，浸于二甲苯中脱蜡至水,在组织上滴加胃蛋白酶消化液，在,37,预热的孵育盒中消化,30min,采用EnVision二步法，严格按照阐明书操作,成果判断,（1）FISH成果鉴定：红色信号代表检测的靶基因，绿色信号代表靶基因所在的染色体着丝粒。检测EGFR基因计数100个细胞，记录Ratio值（100个细胞核中红色信号数/100个细胞核中绿色信号数）。,FISH阳性分为：EGFR基因扩增：,Ratio2为阳性成果；,15个红色信号的细胞数占细胞总数的10%以上；,出现成团红色信号的细胞；高多体性：Ratio2，但4个红色信号的细胞数占细胞总数的40%以上。,FISH,阴性：,Ratio,2,为无扩增。,成果判断,（2）IHC成果鉴定：染色成果根据细胞膜着色的阳性细胞百分率和阳性染色程度评价。,着色细胞占计数细胞百分率5%为0分；625%阳性细胞为1分；2650%阳性细胞为2分；50%阳性细胞为3分。,再结合染色强度，无色为0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。将每张切片着色细胞百分率得分与着色程度得分相乘，为其最终得分。,同一视野如有染色强度不一，取其平均值作最终得分0,1,分为阴性（），,2,3,分为弱阳性（,1+,），,4,6,分为中等阳性（,2+,），,6,分以上为强阳性（,3+,）。,记录学处理,采用SPSS 17.0记录软件进行描述性分析。,FISH技术与IHC法检测成果的比较使用x2检查。,成果 FISH,图,1.EGFR FISH,（,+,）,（高多体）,图,2.EGFR FISH,（,+,）（,点簇状,）,图,3.EGFR FISH,（,-,）,成果 IHC,+,+,+,-,成果,FISH技术与IHC法检测EGFR的成果比较见表1。,FISH,IHC,合计,（,-,）,（,1+,）,（,2+,）,（,3+,）,（,+,）,6,5,2,215,（,-,）,19,5,1,0,25,合计,20,10,3,2,40,表1 FISH技术与IHC法检测EGFR的成果比较,40例NSCLC标本中，FISH显示为阳性的15例，其中IHC检测EGFR体现为（）的6例（40%），阳性的9例（60%）；FISH显示为阴性的25例，其中IHC检测EGFR体现为（）的19例（76%），阳性的6例（24%）。,IHC检测阳性例数高于FISH检测阳性例数，差异无记录学意义（x2=5.184，P0.05）。,讨论,表皮生长因子受体(EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体，位于第7号染色体p1322区,全长200kb,由28个外显子构成，编码1186个氨基酸1广泛分布于除成熟骨骼肌细胞、体壁内胚层和造血组织以外的所有组织细胞。EGFR 的异常高体现可见于多种恶性肿瘤，其活化可激活多种转录因子,引起细胞的增殖、分化、迁移、黏附、抗凋亡和细胞转化等效应，在肿瘤进展、血管生成、转移扩散、凋亡受抑等方面起重要作用2。EGFR酪氨酸激酶克制剂可克制激活EGFR的酪氨酸激酶活性，从而阻断EGFR的功能，阻碍肿瘤的发生发展3。多数文献提醒，分子靶向治疗晚期NSCLC疗效明显，并且治疗明显的患者中，EGFR基因突变的发生率明显高于治疗无效的患者，EGFR基因检测可以作为患者应用分子靶向治疗的一种预测指标，在NSCLC个性化治疗过程中提供重要信息。,讨论,FISH技术检测的敏感性和特异性较高，操作过程中标本受影响较少，可以定量判读成果。,IHC法是临床常用的EGFR蛋白体现的措施。该措施操作简便，可反复性高，对仪器、材料的规定不高，是国内检测EGFR蛋白体现的重要措施。但IHC法在标本固定和处理中也许会使蛋白质变性破坏而影响检测成果，易导致假阴性或假阳性，且成果判断人为主观性较强。由于免疫组化措施因抗体类型与来源不一样，以及所使用的评分系统的差异而导致成果差异，不一样抗体可使成果范围从12变至144。,讨论,以FISH为原则，IHC与之比较：,2例IHC法强阳性（3+）标本中，FISH检测EGFR基因扩增均为阳性，阳性预测值为100%；,3例IHC中等阳性（2+）标本中，FISH检测EGFR基因扩增阳性为2例，阳性预测值为66.67%；,10例IHC弱阳性标本（1+），FISH检测EGFR基因扩增阳性为5例，阴性预测值为50%；,25例IHC阴性（-）标本中，FISH检测EGFR基因扩增阴性为19例，阴性预测值为76%。,总体而言，两种措施的符合率较低。但其中IHC法EGFR体现（3+）及（2+）的标本，尤以强阳性（3+）标本与FISH检测EGFR基因阳性的一致性较高，与有关文献报到有所不一样5，但该类标本例数较少，仅占总例数的12.5%，其一致性与否可靠需要深入验证。,讨论,表2.2963 例乳腺癌HER-2 的IHC和FISH检测成果比较,以 FISH作为原则IHC 与之比较，其阳性预测值在IHC阳性(+以上)标本中为 91.6%，阴性预测值在 IHC 阴性(0或+)标本中为97.2%，在IHC弱阳性和阳性(0或+)标本中其敏感性为92.6%，在IHC阳性标本中其敏感性为98.8%6。,讨论,综上所述，免疫组化法对于评价患者与否使用EGFR酪氨酸激酶克制剂治疗并非最佳的手段，但可作为筛选检查。,参照文献,1 Reiter J L,T hreadgill D W,Eley G D,et al.Comparat ivegenomic sequence analysis and isolation ofhuman and mousealt ernative EGFR transcripts encoding truncated recept or isofornlsJ.Genomics,71(1):1.,2Jorissen RN,Walker F,Pouliont N,et al.Epidemal growth factor receptor：Mechanisms of activation and signalingJ.Exp Cell Res,，284（1）:31.,3 Cunningham D,Humblet Y,S iena S,et al.Cetuximab monotherapy and cetuximab plus irinotecan in irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer J.N Engl J Med,351(14):337-345.,4Buckley AF。Kakar scomparison of the Dako EGFR pharmI)xkit and Zymed EGFR antibody for assessment of EGFR status incolorectal adenocarcinomaJAppllmmunohistochem Mol Mor_phol，15(3)：305309,5周晓秋，王东关，孙希印，高摇虹，王琳琳，李新功.非小细胞肺癌耘郧云砸基因和蛋白检测的比较分析J.临床与试验病理学杂志，,28（10）：1124-1132.,6刘艳辉.乳腺癌组织HER-2的荧光原位杂交和免疫组化联合检测的评价J.循证医学，6(2)：81-83.,谢谢！,