基因克隆-操作步骤原理及注意事项.doc

一： 提质粒
1：提取ml的菌液放到EP管中，12000r/s 30s离心，去除菌液，加入100微升的TE 振荡混匀后加入200微升裂解液二，轻轻混匀，是使细胞破碎，同时使蛋白变性和保持其高碱性，再加入150裂解液三 轻轻混匀是鞋包裂解开（最佳的效果是上层是蛋白，下层是透明的液体），离心10min，将液体转移到另一个EP管中，加入等体积的异丙醇，静置10min或更长（一般以析出的DNA为主 蛋白次之），离心10min 12000rpm/s ，除去上清液，加入400微升的70%的乙醇洗（去除里面的有机溶剂，同时使DNA沉淀），去除乙醇，室温下开口放置5-10min或放到烘箱中使乙醇挥发干，再加入20微升的水，跑胶看浓度
溶液I：Tris-Cl控制PH；葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
溶液II：NaOH裂解细胞的作用；SDS主要是变性蛋白，也有溶解细胞的作用。
溶液III：3 M 醋酸钾钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了；2 M 醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
25/50酚+24/50氯仿+1/50异戊醇 的作用：酚抽提蛋白的作用；氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
乙醇---100%沉淀质粒的作用；70%洗质粒去离子的作用；
RNase水：消化所提质粒中的RNA。

2：消化 补到50微升体系，再加入5微升的RNase 放入37℃ 2-3个小时
3：抽提 加入150微升的TE补到200微升体系 加入100微升的氯仿 100微升的苯酚 充分混匀 12000rpm/s 10min 离心 将上层液体转到新EP管中 再像其中加入200微升的氯仿 充分混匀，12000rpm/s 离心 ，取上层液体到新EP管中，加入1/4体积的5mol/L的NaCl 两倍体积的无水乙醇，放入-20℃ 3小时沉降 后离心 12000rpm/s 10min ，70%的乙醇洗干，再晾干或烘干 加20微升的水 跑胶检测
补充：酚氯仿法提取DNA的原理
用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？
使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。
氯仿的作用？
氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）
用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
4：酶切
酶切体系：a：鉴定 20微升体系 Buffer-x 2微升 酶 1微升 质粒 2微升（依浓度而定） 补水到20微升
b：回收 100微升体系 Buffer-x 10微升 酶-x 3-5微升 质粒10微升（依浓度而定）补水到100微升
注意事项：保持质粒的高浓度 ，确保回收的量 酶切一般3小时 37℃
5：回收a：做胶浓度在 0.7左右的 酶切前 先少量点样确定酶切完全，加样 100v 1小时左右
b：先在小烧杯里加水煮沸，将切胶的镊子预热，洗干净，切下所需的条带，放到EP管中
c：向EP管中加入400微升的binding buffer 二，在60℃中融化，3000rpm/s 1min 重复三次 将离心的液体倒回冲洗离心
d：去除下清，降入500微升的washing solution 洗两次 每次用新的洗液 8000rpm/s 30s 再12000rpm/s 2min 去除残留的液体
e: 加入10微升的Elution Buffer 放入37℃培养箱中10min 结合 12000rpm/s 2min
注意事项：1：保证是新胶 新缓冲液 浓度大小合适
2：割胶大小要对 ，割错了后面就白做了，不要割错了条带 ，这很重要，
3：短波紫外线（254）会引起DNA的断裂或是形成TT二聚体，前者会使以后的链接与转化等实验失败，后者肯能造成基因突变，给克隆工作带来麻烦，波紫外线，回收DNA时也要尽量短时照射，避免连续长时间照射
4：回收时要尽量的柔缓，避免将DNA链弄断
5：做胶时要尽量小薄，回收时割胶尽量少 提高回收效率
乙醇对回收的影响较大 应注意吸干
Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb

1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.
六 连接
将所回收的小片段与载体(大片段) 连接 连接体系：
小片段：7-9微升 大片段：1微升 Buffer:2微升
水：9-11微升 混匀65℃10min 后加入1微升的连接酶放入16-22℃中过夜，16小时
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DNA中loading buffer 的作用原理：使DNA粘度增大，不要再点样中被漂离凝胶; 加入的指示剂 可指示前沿。
1*的浓度 是个经验。浓度太大，可能产生 DNA和buffer中物质难以分开，拖带；指示剂前沿太宽等 适当增加浓度 没问题，但没必要。
目的基因的亚克隆
目的基因的亚克隆
所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。
    亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。

转化
取出感受态细胞放入冰中， 加入10左右的质粒放入4度冰箱中30分钟，使质粒吸附在感受态细胞上，在42度下热激80s，冰浴3min 3000rpm 1min 离心 去上清 加入700微升的LB 放入37度摇床中45-60min 5min 5000rpm 离心 去上清 剩100微升 涂板
冰浴过程中，原来加在溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，这样，在42度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中。这就是原理。热激是让已经有孔的大肠杆菌孔膨胀，增加DNA进入的几率，然后立刻冰浴，使孔收缩，进去的DNA不要出来
实验原理：（1）热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。
转化实验时要尽量设立对照组
7：挑菌 PCR鉴定
挑菌时每个挑6-10管 做PCR鉴定
注意事项：PCR鉴定时 要确定不要少加样试剂，因为都是微量加入，所以每次加入时都应注意是否加入试剂，鉴定时常会出现假阳性，即长出斑点的情况，而用PCR鉴定则无法鉴定出来，
8：划单克隆鉴定
PCR鉴定，一般可以挑1-3管检测鉴定
9：保种
80%的甘油 0.2ml 和0.8ml的菌液 用移液管 确保无污染
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