低共熔溶剂液液微萃取-高效液相色谱法分析蜂蜜中四环素类抗生素.pdf

154摘要：采用低共熔溶剂-液液微萃取法提取蜂蜜中四环素类抗生素，并采用高效液相色谱法进行其残留分析。结果表明：在低共熔溶剂（百里酚-辛酸摩尔比2：1）10 0 uL、样品溶液pH4.5、盐(NaCl)质量浓度0.2 g/mL、超声萃取5min时，土霉素和四环素在0.1 2 0.0 g/mL的范围内线性关系良好，相关系数分别为0.9 9 7 3和0.9 9 9 3,检测限均为0.0 1g/mL,富集倍数为7.1和6.5；加标回收率为8 8.2%119.8%，相对标准偏差（RSD）为1.0%4.8%。方法简单快捷，易操作,且具有良好的准确性及灵敏度。关键词：液液微萃取；低共熔溶剂；土霉素；四环素Detection of tetracycline antibiotics in honeyby high performance liquid chromatographywith deep eutectic solvent based on liquid-liquid microextractionFENG Zuo-xun,LIU Yan,CHEN Qing-yu,WANG Ya-bo(School of Pharmacy,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,Hebei,China)Abstract:The liquid-liquid microextraction with deep eutectic solvent was used to extract tetracyclineantibiotics in honey,and their residues were analyzed by high performance liquid chromatography.Theresults showed that the linear relationship between tetracycline and oxytetracycline was good in the rangeof 0.1-20.0 g/mL when the low eutectic solvent(thymol to caprylic acid ratio 2:1)was 100 L,thepH of the sample solution was 4.5,the mass concentration of NaCl was 0.2 g/mL,and the ultrasonic ex-traction was carried out for 5 min.The correlation coefficients were 0.997 3 and 0.999 3,the detectionlimits were 0.01 g/mL,and the enrichment multiples were 7.1 and 6.5.The recoveries were 88.2%-119.8%,and the relative standard deviations(RSD)were 1.0%-4.8%.This method was simple,rapid,easy to operate,and had good accuracy and sensitivity.Key words:liquid-liquid microextraction;deep eutectic solvent;oxytetracycline;tetracycline中图分类号：TS201.6文章编号：10 0 8-9 57 8(2 0 2 3)11-0 154-0 5蜜蜂在养殖时会使用大量的四环素类抗生素目前,蜂蜜中残留抗生素的检测方法常用的有防治败血病等细菌性疾病 。抗生素残留问题不高效液相色谱法（HPLC)7、液相色谱-质谱法（LC-仅会降低蜂蜜的质量，更会直接或间接影响人类健MS）8-9 等，样品前处理方法有固相萃取（SPE）和康 2-3。蜂蜜的成分相当复杂,包括高浓度的单糖、液液萃取(LLME)0-12等。SPE过程较为繁琐,成有机物和氨基酸等 4-6 大分子基质。因此,分析蜂本高,常需大量的有机溶剂,不环保。LLME则具有蜜中抗生素的残留时，样品前处理与检测手段相当萃取溶剂用量小、成本低、操作简便、灵敏度高等优重要。点。近些年各种新型萃取溶剂不断涌现 13，萃取溶收稿日期：2 0 2 2-11-30基金项目：河北医科大学大学生创新性实验计划项目（USIP2022255)作者简介：冯作勋（19 9 5一），男，硕士，助理实验师，研究方向为样品前处理及食品分析检测。通信作者：王亚博（19 9 1一），男，硕士，实验师，研究方向为食品检测及药品检测。粮食与油脂低共熔溶剂液液微萃取-高效液相色谱法分析蜂蜜中四环素类抗生素冯作勋，刘彦，陈晴宇，王亚博（河北医科大学药学院，河北石家庄0 50 0 17）文献标志码：A2023年第36 卷第11期2023年第36 卷第11期剂类型成为LLME技术的研究热点，例如以离子液体为萃取溶剂分析蜂蜜中金霉素和强力霉素 12 ,但离子液体难以降解,对环境有一定污染。低共熔溶剂(DES)是由氢键受体（HBA）和氢键供体（HBD)制备而成的一种低成本、低毒性的混合溶剂，具有良好的萃取特性及可生物降解等优点 14-15,已被广泛应用于样品前处理过程中。然而，合成DES大多以氯化胆碱作为HBA,更多新类型的DES仍有待研究。该研究以百里酚为HBA，辛酸为HBD合成新型疏水性DES,以其作为萃取溶剂用于蜂蜜中四环素类抗生素残留的分析,以期为四环素类抗生素残留检测的样品前处理技术提供新思路。1材料与方法1.1 材料与试剂盐酸土霉素对照品（纯度9 8%），中国药品生物制品检定所；盐酸四环素对照品（纯度98%），中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈，色谱纯;去离子水,实验室自制;辛酸、百里酚、NaCl、草酸，分析纯；食用蜂蜜，上海冠生园蜂制品公司。1.2仪器与设备LC2000高效液相色谱仪（配有紫外检测器和T2100P色谱工作站），上海天美公司；TG16-WS台式高速离心机，湖南湘仪公司；MilliporeSimplicity水纯化系统，法国密理博公司。1.3试验条件1.3.1色谱条件采用Venusil MP Cis色谱柱(2 50 mm4.6 mm,5m）,流动相为甲醇-乙腈-0.0 1mol/L草酸水溶液（体积比12:18:7 0），色谱柱的流速为1.0 mL/min，检测波长2 8 0 nm,柱温35,进样量10 L。1.3.2溶液的配制称取土霉素和四环素对照品约5.0 mg,分别置于5mL的棕色容量瓶中,加入甲醇,使得土霉素和四环素完全溶解,定容,即得质量浓度为1.0 mg/mL的对照品储备液。Na,EDTA-Mcllvaine缓冲液及蜂蜜样品的配制均参照文献 12 方法。1.3.3DES 的制备按照一定的摩尔比称取百里酚和辛酸,置于100mL烧杯中,采用磁力搅拌仪在7 5水浴条件下搅拌15min,混匀。粮食与油脂1.3.4基于DES 的 LLME操作步骤采用1mol/L磷酸将蜂蜜样品溶液pH调节至4.50.2,量取2 mL,加人0.4 gNaCl,以10 0 LDES为萃取溶剂,超声处理5min,然后于室温条件下以3350 g的离心力离心处理5min,取上层溶液进行HPLC分析，记录峰面积A并代人线性方程中计算各个待测物萃取后的质量浓度。2结果与分析2.1DES的配比由表1可知：当百里酚：辛酸摩尔比为2：1时，所得土霉素和四环素的质量浓度分别为（18 5.2 7 6.48)g/mL和(8 9.17 2.0 9）g/mL,萃取效果良好。当百里酚：辛酸摩尔比为3：1时,所得土霉素和四环素的质量浓度反而降低,这可能是由于辛酸的增加引起了DES自身性质如黏度、表面张力等物理系数的改变 16-17 ,从而影响了萃取效果。因此,最终选取摩尔比2：1的百里酚-辛酸作为本试验的萃取溶剂。表1基于不同摩尔比DES的LLME结果分析（n=3)DES百里酚：辛酸摩尔比土霉素/（g/mL）四环素/（g/mL）DES-11:1DES-21:2DES-31:3DES-42:1DES-53:12.2基于DES 的LLME的条件优化2.2.1萃取溶剂的体积由图1可知：当萃取溶剂为10 0 L时，土霉素和四环素萃取后的质量浓度最大；当萃取溶剂为200L和30 0 L时，土霉素和四环素的质量浓度降低。这可能是因为待测物在2 种溶剂中的分配达到了动态平衡，绝对萃取量不会始终与萃取溶剂体200(Tu/)/x鲁单15010050F050图1不同体积的萃取溶剂对土霉素和四环素质量浓度的影响（n=3）155100.76 5.2365.32 3.4175.50 4.1843.77 2.5671.84 3.9747.78 3.59185.27 6.4889.17 2.09115.37 3.6974.69 3.57土霉素四环素100200体积/L300156积呈正相关。所以，最终选择萃取溶剂体积为100 L。2.2.2样品溶液pH由图2 可知：当样品溶液pH为4.50.2 时，土霉素和四环素萃取后的质量浓度最高，分别为185.27g/mL和8 7.6 9 g/mL。土霉素和四环素均为两性化合物,猜测2 种待测物在pH为4.50.2时主要呈分子状态,在水溶液中溶解度降低,在DES 中的溶解度增大,进而更易被 DES 萃取,获得待测物最佳萃取浓度。所以,样品溶液的pH选择4.5 0.2。200(Tu/a)/鲁里15010050F图2 不同样品溶液pH对土霉素和四环素质量浓度的影响（n=3)2.2.3盐质量浓度由图3可知：当盐(NaCl)质量浓度为0.2 g/mL时,萃取所得土霉素和四环素的质量浓度分别为178.52g/mL和8 5.2 4g/mL,效果最佳。当盐质量浓度为0、0.1g/mL时,溶液的离子强度提高能产生盐效应，降低分析物与基质的相互作用，加速待测物从样品溶液向萃取溶剂的转移，促进萃取、富集 18-19 。而当盐质量浓度达到0.3g/mL时，使得样品溶液的黏度增加，影响了待测物从样品溶液向DES的转移，导致土霉素和四环素质量浓度降低。所以,选择最佳盐质量浓度为0.2 g/mL。200r土霉素(Tu/a)/鲁单四环素1501005000盐质量浓度/（g/mL）图3不同的样品溶液盐质量浓度对土霉素和四环素质量浓度的影响（n=3)粮食与油脂2.2.4萃取方式由图4可知：当萃取方式为涡旋1 min时，土霉素和四环素的质量浓度最低；当萃取方式改为超声5 min时，土霉素和四环素的质量浓度分别为180.30g/mL和8 8.6 7 g/mL;当超声10 min时所得2 种待测物的质量浓度与超声5min未见明显差异，已趋于稳定。相较于涡旋，超声萃取不会使DES产生极化，而是通过产生声波空化作用从而增大待测物分子与萃取溶剂的接触，提高待测物转移到DES的传质速率 12 。所以,最终选择萃取方式及时间为超声5 min。土霉素200四环素(Tu/)/鲁15010050F3.04.5pH0.10.22023年第36 卷第11期土霉素四环素6.00涡旋1min超声5min超声10 min萃取方式及时间图4不同萃取方式对土霉素和四环素质量浓度的影响（n=3）2.3系统适用性考察由图5可知：蜂蜜中土霉素、四环素的色谱峰之间互不干扰，分离度佳。因此，该方法具有良好的系统适用性。180/1501209060300-30l012345678910111213保留时间/min图5萃取后的混合对照品溶液(10.0 g/mL)（A）、萃取后的蜂蜜加标样品溶液(10.0 g/mL)（B)及蜂蜜样品直接进样(C)的色谱图注：1为土霉素；2 为四环素。2.4线性关系、定量限、检测限及富集倍数0.3配制系列质量浓度的土霉素和四环素对照品溶液（1.0、5.0、2 5.0、50.0、10 0.0、2 0 0.0 g/mL）,采用HPLC 进样分析。由表2 可知:在线性范围内，土霉素和四环素所得线性关系良好。当信噪比=32ABC2023年第36 卷第11期时,测得土霉素与四环素的检出限（LOD)均为0.08g/mL;当信噪比=10 时,测得土霉素与四环素的定量限(LOQ)均为0.2 g/mL,表明该方法灵敏度良好。待测物土霉素四环素待测物土霉素四环素配制不同质量浓度的土霉素和四环素加标蜂蜜样品溶液（0.1、5.0、2 0.0 g/mL），经LLME处理后,再采用HPLC进样分析，测得其峰面积，代人经萃取后所得线性方程计算其质量浓度，同时代人对照品直接进样所得线性方程计算其质量浓度，两者质量浓度之比即富集倍数（取平均值），具体见表3。结果表明,该方法可显著提高土霉素和四环素的检测灵敏度。2.5精密度及重复性以去离子水为溶剂,配制土霉素和四环素质量浓度均为5.0 g/mL的水溶液样品共5份。按1.3.4项条件将样品经LLME处理后进行HPLC分析,计算得到土霉素和四环素的相对标准偏差(RSD)分别为0.8%和1.1%,表明该方法的精密度良好。取同一蜂蜜样品5份，加标后得土霉素和四环素质量浓度均为5.0 g/mL,按1.3.4项条件将样品经LLME处理后进行HPLC分析，计算得到土霉素和四环素的RSD分别为3.8%和4.6%，表明该方法的重复性良好。2.6回收率及含量测定本研究所选蜂蜜未检测出土霉素、四环素。制备蜂蜜样品溶液后做加样处理，最终得土霉素和四环素质量浓度分别为1.0、5.0、10.0 g/mL,经LLME处理后采用HPLC进样分析,并计算待测物质量浓度及回收率。由表4可知：土霉素与四环素的回收率为8 8.2%119.8%,RSD4.8%,表明该方法所获得的准确度符合要求。粮食与油脂配制系列质量浓度的对照品溶液（2 0.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.1g/mL)经LLME处理后,再采用HPLC进样分析。由表3可知:在线性范围内，土霉素和四环素所得线性关系良好。表2 线性回归方程、相关系数、LOD和LOQ结果线性方程y=3.34 10*x-3.37 104y=3.45 10*x-4.34 104线性方程y=2.21 105x-1.44 105y=1.50 10 x 3.78 102157线性范围/(g/mL)LOD/(g/mL)0.999 91.0 200.00.999 81.0 200.0表3萃取后的线性回归方程、相关系数、LOD、富集倍数结果线性范围/(g/mL)0.997 30.1 20.00.999 30.1 20.0待测物浓度/(g/mL)土霉素1.011.011.025.035.015.0010.0110.0110.02四环素1.011.021.005.005.005.0110.0210.0210.013结论本研究将常见的百里酚、辛酸制备成疏水性DES,作为新型萃取溶剂用于LLME,萃取时用量仅100L,具有成本低、低毒环保的优势；样品经超声、离心后可直接进样，操作步骤简单；该方法对土霉素和四环素富集倍数分别为7.1和6.5,提高了检测的灵敏度，而且该方法重复性好、精密度高，因此,适用于蜂蜜样品中土霉素和四环素残留分析。LOQ/(g/mL)0.080.20.080.2LOD/(g/mL)富集倍数（n=3）0.017.1 0.90.016.5 0.7表4加标回收率结果(n=3)待测质量实测质量浓度/(g/mL)1.191.171.195.896.046.049.179.519.740.981.050.995.205.044.738.819.018.63回收率/%RSD/%118.41.0119.81.794.73.3100.53.799.84.888.22.1158 1 KRIVOHLAVEK A,ZUNTAR I,IVESIC N,et al.Foodsafety is an important public health issue:Chlorampheni-col residues determination by liquid chromatography tan-dem mass spectrometry(LC-MS/MS)in honey J.Psy-chiatria Danubina,2014,26(3):537-545.2 BEYENE T.Veterinary drug residues in food-animal products:Its risk factors and potential effects on 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