滇橄榄核多糖的酶法提取工艺及其抗氧化活性研究.pdf

120摘要：以滇橄榄核为原料,基于单因素试验结果，利用响应面法优化多糖的提取工艺。结果表明：最佳工艺条件为纤维素酶添加量2.7%（以滇橄榄核粉质量计）、液料比45：1（mL/g）、酶解时间3.7 5h、酶解温度6 0，在此条件下多糖得率最高为2.0 43%。红外光谱分析和抗氧化试验结果显示，滇榄核多糖是糖苷键类型为构型的吡喃糖，且抗氧化活性与其质量浓度呈正相关关系。关键词：滇橄榄核；多糖；响应面；酶法提取;抗氧化活性Enzymatic extraction technology and antioxidant activity ofpolysaccharides from Phyllanthus emblica Linn.kernelYANG Yuan-hui,CHEN Ruo-fei,ZI Lu-xi,GUO Lei(School of Life Science,Southwest Forestry University,Kunming 650224,Yunnan,China)Abstract:Based on the results of single factor experiment,response surface methodology was used to op-timize the extraction process of polysaccharides from Phyllanthus emblica Linn.kernel.The resultsshowed that the optimal process conditions were as follows:cellulase addition 2.7%(based on the massof Phyllanthus emblica Linn.kernel powder),liquid to material ratio 45:1(mL/g),enzymatic hydroly-sis time 3.75 h,and enzymatic hydrolysis temperature 60 C.U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s,t h e h i g h e s t p o l y-saccharide yield was 2.043%.The infrared spectrum analysis and antioxidant test results showed thatthe polysaccharide from Phyllanthus emblica Linn.kernel had pyranose was type of glycosidic bond,and the antioxidant activity was positively correlated with its mass concentration.Key words:Phyllanthus emblica Linn.kernel;polysaccharide;response surface;enzymatic extraction;antioxidant activity中图分类号：TS201.1滇橄榄又名余甘子，是一种在我国有广泛分布的药食两用植物资源，其中云南省滇橄榄资源最为丰富，具有较大的潜在价值 1-2 。滇橄榄人口酸涩，但回味甘甜,风味独特,此外还含有丰富的营养成分，如氨基酸、微量元素，维生素C含量都比较高 3。研究 4-6 表明,食用滇橄榄有降血糖、降血压、滤尿、治肝炎、抗放射线损伤及抗衰老等作用。橄榄包括果肉和核，目前对橄榄果肉研究较多,包括食品加工、生物活性成分提取及活性研究等，而粮食与油脂滇橄榄核多糖的酶法提取工艺及其抗氧化活性研究杨圆慧，陈若飞，资璐熙，郭磊（西南林业大学生命科学学院，云南昆明6 50 2 2 4)文献标志码：A2023年第36 卷第11期文章编号：10 0 8-9 57 8(2 0 2 3)11-0 12 0-0 5对滇橄榄核的研究，尤其是对其多糖的研究还未见报道。植物体内的天然多糖是10 多个单糖以糖苷键结合而形成的大分子物质，具有调节免疫、抗氧化和降血糖等多种生物功能 7-9 。本研究以滇橄榄核为原料，探究纤维素酶法辅助提取滇橄榄核多糖的工艺,再利用响应面法优化此提取工艺,并分析滇橄榄核多糖的红外结构及抗氧化活性,为滇橄榄核的综合开发利用奠定一定的基础。收稿日期：2 0 2 2-0 9-2 7基金项目：云南省大学生创新训练项目（2 0 2 110 6 7 7 0 15）；生物学质量工程项目（50 319 0 10 6）；云南省科技厅基础研究计划项目（2 0 2 10 1AT070042）；云南省科技厅农业联合专项（2 0 2 10 1BD070001-054）作者简介：杨圆慧（2 0 0 0 一），女，本科，食品科学与工程专业。通信作者：郭磊（19 8 1一），男，博士，副教授，研究方向为食品化学。2023年第36 卷第11期1材料与方法1.1 材料与试剂滇橄榄,市售;纤维素酶（40 0 U/mg）,上海源叶生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DP-PH）,北京酷来博科技有限公司;苯酚、浓硫酸、无水乙醇等,分析纯。1.2仪器与设备VIS300紫外分光光度计、NicoletIS50傅里叶红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司;JSP-200型多功能粉碎机，浙江永康金穗机械制造厂；UV-BAS2245电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司;HH-2数显电子恒温水浴锅，金坛市丹瑞电器厂；3K15高速台式离心机，德国西格玛公司;FD5冷冻干燥机，金西盟（北京）仪器有限公司。1.3试验方法1.3.1葡萄糖标准曲线的绘制参考董玉玮等 10 的方法,并加以修改。取不同体积(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL)的标准葡萄糖溶液(0.1 mg/mL)于10 mL试管中,分别加去离子水至2.0 mL,依次加入1.0 mL质量分数6%苯酚和5.0 mL浓硫酸,摇匀避光2 5min,在波长490 nm处测定吸光度。以葡萄糖溶液质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得标准曲线方程:Y=20.739X-0.000 8(R=0.999 4)。1.3.2试验预处理选取新鲜的滇橄榄去除果肉保留果核，破碎后于6 0 下烘干6 h,粉碎后过0.18 mm筛，备用。1.3.3滇橄榄核多糖的提取与测定根据文献!的方法,并进行调整。称取1g橄榄核粉,添加纤维素酶,并按液料比加去离子水，进行一段时间的水浴加热,之后于沸水中灭活10 min，过滤得澄清样液。准确吸取1 mL样液于试管中,加去离子水补至2 mL。采用苯酚-硫酸法测定吸光度，得出样液质量浓度。滇橄榄核多糖得率按式(1)计算。多糖得率=X 100%m式中:p为多糖质量浓度,mg/mL;V为提取样液总体积,mL;n为稀释倍数;m为样品质量,g。1.3.4单因素试验以酶解温度50、酶解时间2.5h、液料比30：粮食与油脂1（m L/g）、纤维素酶添加量2.5%（以滇橄榄核粉质量计)为基准条件,进行单因素试验，每组试验的最优水平带入下组试验，分别研究纤维素酶添加量、液料比、酶解时间、酶解温度对滇橄榄核多糖得率的影响。1.3.5响应面试验在单因素试验的基础上，选取纤维素酶添加量（A）、液料比(B）酶解时间（C)为考察因素,以滇橄榄核多糖得率为响应值,设计响应面试验。因素水平见表1。表1响应面试验因素与水平因素水平A纤维素酶添加量/%B液料比/（mL/g）C酶解时间/h-12.002.513.01.3.6滇橄榄核多糖红外光谱测定参考文献 12 的方法,取1mg 纯化的滇橄榄核多糖冻干粉,压制成片后,在40 0 0 40 0 cm=范围内进行红外扫描。1.3.7滇橄榄核多糖清除DPPH自由基的能力参考文献 13 的方法，分别取2.0 mL不同质量浓度（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）的样品溶液于试管中,各加人2 mLO.1mmol/LDPPH溶液混匀反应,在波长517 nm处测定吸光度Ai。用无水乙醇代替DPPH溶液与样品溶液反应，混合后测定吸光度A2,再用无水乙醇代替样品溶液与DPPH溶液反应作空白对照,混合后测定Ao。维生素 C 作阳性对照。DPPH 自由基清除率计算见式(2)。DPPH 自由基清除率=(1-1.3.8数据统计分析所有试验均重复3次,结果取平均值;采用Ex-cel 2016 分析数据,计算得率和清除率;采用 DesignExpert8.0.6和Origin进行试验设计与分析。2结果与分析2.1单因素试验结果(1)2.1.1纤维素酶添加量对滇橄榄核多糖得率的影响由图1可知:随着纤维素酶添加量的增加,多糖得率先升高后降低，当纤维素酶添加量为2.5%时，多糖得率最高,为1.7 2 4%,在该情况下酶活基本达12140:13.045:13.550:14.0_ A1-A2 100%Ao(2)122到饱和,继续增加纤维素酶对反应影响不大 14。因此,确定纤维素酶添加量为2.5%。1.8r1.71.61.51.41.31.2图1纤维素酶添加量对滇橄榄核多糖得率的影响2.1.2液料比对滇橄榄核多糖得率的影响由图2 可知：溶剂用量的增加可以使滇橄榄核粉与溶剂充分接触,有助于多糖的提取。然而溶剂过量会导致溶液中其他杂质浸出，从而影响多糖的得率 15。因此,确定液料比为45:1(mL/g)。2.00工1.951.901.851.801.751.701.6530:1图2液料比对滇橄榄核多糖得率的影响2.1.3酶解时间对滇橄榄核多糖得率的影响2.052.001.95%率影琴1.901.851.801.751.70图3酶解时间对滇橄榄核多糖得率的影响粮食与油脂由图3可知：酶解时间过短，酶不能充分溶于提取剂之中,多糖得率较低。而酶解时间过长,存在的一些杂质又会使酶结构发生变化甚至使酶失活,造成多糖得率偏低 16 。因此,确定酶解时间为3.5 h。2.1.4酶解温度对滇榄核多糖得率的影响由图4可知：随着酶解温度的升高,多糖得率先升高后降低，在酶解温度6 0 时达到最大值，为2.058%。酶的本质是蛋白质，酶解温度太低会使生物活性受到抑制，无法充分发挥其作用，而酶解温度过高又会使蛋白质结构发生改变从而失去活性 17 ,最终使得多糖得率降低。因此,确定最适酶1.01.5纤维素酶添加量/%工112.02023年第36 卷第11期2.02.5135:1液料比/(mL/g)2.53.0酶解时间/h3.040:145:13.5解温度为6 0 。2.102.052.001.951.901.851.801.75图4酶解温度对滇橄榄核多糖得率的影响2.2响应面法优化试验响应面试验设计与结果见表2，方差分析结果见表3。表2响应面试验设计与结果50:1试验号12345678910111213144.015161745A-11-11-11-1100000000050酶解温度/BC-10-1010100-10-101010-11-1-111100000000005560得率/%1.291.441.391.371.431.541.631.881.571.801.891.901.952.001.982.021.98652023年第36 卷第11期以多糖得率(Y)为响应值,建立回归模型,得到二次回归方程:Y=1.98+0.061A+0.034B+0.12C-0.043AB+0.034AC-0.055BC-0.39A-0.22B2+0.025C。方差来源平方和自由度均方模型1.06A0.029B9.047E-003C0.12AB7.364E-003AC4.498E-003BC0.012A20.64B20.20C22.611E-003残差0.015失拟项0.012纯误差2.724E003总误差1.08注：*为差异显著(P0.05)；*为差异极显著(P0.01)。由表3可知：响应面回归模型P0.05,差异不显著，表明该模型拟合程度良好。2.3验证实验根据响应面模型试验结果，得到滇橄榄核多糖的最佳提取条件为纤维素酶添加量2.6 7%、酶解时间3.7 5h、液料比45.3：1（mL/g），此时滇橄榄核多糖的得率最高为2.0 30%。考虑实际操作的可行性,将最佳提取条件修正为纤维素酶添加量2.7%、液料比45：1（mL/g）、酶解时间3.7 5h,在此条件下进行5组验证实验，得到滇橄榄核多糖得率平均值为2.0 43%，与理论预测值相差0.0 13%，表明该模型准确可靠。2.4红外分析由图5可知：滇橄榄核多糖有多种多糖特征吸收峰,在3449.0 6 3cm处较宽的峰是一0 H伸缩振动峰;在32 9 9.6 0 6 cm-l处峰值相对较低的是CH伸缩振动峰；在159 7.7 35cm-处可能是酰胺羰基键；在1442.49 3cm-l处是CH变角振动峰；在1212.523cm-处出现了1个较明显的峰为非对称的硫酸酯（S一0）伸缩振动特征峰；在10 8 7.6 55、1051.014、10 32.6 9 4c m-1处的吸收峰证明有D-吡喃环存在的伸缩振动峰 COC 和 COH;在粮食与油脂832.1334cm-l、7 6 4.155、8 0 7.5455c m-l 处分别是D-吡喃环非对称环伸缩振动峰、甘露糖吸收峰和D-吡喃环对称环伸缩振动峰 18 。由红外分析可知,滇橄榄核多糖为吡喃糖,糖苷键类型为构型。表3多糖得率方差分析结果100rF值P值显著性90.1210.02919.047E 00310.1217.364E0033.500.103.714.498E0032.130.187 410.01210.6410.2012.611E-00372.107E00334.008E0035.880.059.946.810E004161239056.140.0001*13.940.007 34.290.077 056.280.00015.780.047 2302.760.0001*97.160.0001*1.240.302.480*%/率乐墅70*6050F40*3040003.5003 00025002 00015001000500图5滇橄榄核多糖红外图谱2.5滇橄榄核多糖清除DPPH自由基的能力由图6 可知：样品质量浓度在0.1 2.0 mg/mL范围内,滇橄榄核多糖对DPPH自由基的清除率逐渐升高，当滇橄榄核多糖质量浓度为2.0 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率最高,为6 6.7 8%。滇橄榄核多糖的ICso为1.158 mg/mL,维生素 C 的ICso为0.0 0 6 mg/mL,说明滇橄榄核多糖质量浓度在试验范围内,其清除DPPH自由基的能力低于维生素C。100r80F%/率潮清甲月Ha60F40F20F0.1图6 滇橄榄核多糖和维生素C对DPPH自由基清除率的影响3结论在单因素试验的基础上，运用响应面法优化提取滇橄榄核多糖的工艺，并结合实际进行分析验证,得出最佳工艺条件为纤维素酶添加量2.7%（以滇橄榄核粉质量计）、液料比45：1（mL/g）、酶解波数/cm维生素C多糖0.51.0质量浓度/（mg/mL)1.52.0124时间3.7 5h、酶解温度6 0，在此条件下滇橄榄核多糖得率最高为2.0 43%。由红外分析结果可知，滇橄榄核多糖为吡喃糖,糖苷键类型为构型。抗氧化结果显示，滇橄榄核多糖具有较强的清除DP-PH 自由基的能力。本研究结果为滇橄榄核在食品添加剂及功能性食品领域的开发应用奠定了基础。参考文献【1】吴建花，杨开保，杨晏平，等滇西地区滇橄榄自然居群果实经济性状变异研究 J云南农业大学学报（自然科学)，2 0 16,31(2)：2 8 1-2 8 7.【2】黄佳聪，龚发萍滇橄榄产业发展的问题与措施 J.林业调查规划，2 0 17,42(6)：7 6-8 0.【3骆扬，王永健滇橄榄西番莲复合果汁饮料的研制 J：文山学院学报，2 0 16，2 9(6)：39 42.【4成晓梅，魏屹余甘子的研究进展 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