酶类药物医学知识专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,主要内容,：,一、概述,二、酶类药品分类,三、酶类药品制备,几个主要酶类药品制备工艺,知识目标：,掌握酶类药品分类、应用和生产方法,掌握,SOD,生产工艺,了解酶类药品发展趋势,酶类药物医学知识专家讲座,第1页,一、概述,1,、酶,(enzyme),特点,酶含有高度专一性和催化效率,.,酶催化反应反应条件温和,.,酶催化活性在生物体内受到各种原因调整,.,酶对底物结构含有严格选择性,.,2,、药用酶,是用于预防、治疗、诊疗疾病一类酶制剂,。,酶类药物医学知识专家讲座,第2页,3,、酶类药品发展历程,4,千多年前夏禹时代就盛行酿酒；周朝已开始制醋、酱、豆豉（在霉菌蛋白酶作用下产生风味食品）和饴糖（主要含麦芽糖）,.,1833,年，,Payen,从麦芽抽提物中沉淀出一个对热不稳定物质，它可促进淀粉水解成可溶性糖，人们开始意识到生物细胞中可能存在着一个类似催化剂物质,.,1893,年,francs,用木瓜蛋白酶治疗白喉和结核性溃疡病，疗效很好,.,1896,年，,WKuhne,首先把这类物质称为,“enzyme”,，汉字译为,“,酶,”.,1897,年,Buchner,成功地用不含细胞酵母液实现发酵，说明含有发酵作用物质存在于细胞内，并不依赖活细胞,.,1926,年,Sumner,首次提取出脲酶，并进行结晶。,20,世纪,60,年代中期以前，普通动植物起源酶已陆续投入生产，随即，又向着生产各种微生物起源酶和辅酶方向发展。现已经有二千余种酶被判定出来，已经应用有,1211,各种其中有二百余种得到结晶。,酶类药物医学知识专家讲座,第3页,二、酶类药品分类,1.,消化酶类,胰酶、胰脂酶、胃蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等，用于治疗消化不良、食欲不振、急慢性肠胃炎、消化功效受阻等。,2.,消炎（抗炎）,胰蛋白酶、糜蛋白酶等用于消炎、消肿、清疮、排脓和促进伤口愈合；,胶原蛋白酶用于治疗褥疮和溃疡；,溶菌酶可作为一个含有杀菌作用天然抗感染物质。有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加紧组织恢复功效等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、水痘、带状疱疹和扁平疣等,木瓜凝乳蛋白酶用于治疗椎间盘突出症；,胰蛋白酶还用于治疗毒蛇咬伤。,依照其功效和临床应用分类,酶类药物医学知识专家讲座,第4页,3,心血管疾病治疗,弹性蛋白酶能降低血脂，用于防治动脉粥样硬化；,激肽释放酶有扩张血管、降低血压作用；,一些酶制剂对溶解血栓有独特效果。如尿激酶、,链激酶、蚓激酶、纤溶酶及蛇毒溶栓酶。,凝血酶可用于止血,。,4.,抗肿瘤酶类生化产品,用于治疗一些肿瘤，如门冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、蛋氨酸酶等。,L-,门冬酰胺酶是一个抗白血病药品，它是利用门冬酰胺酶选择性地争夺一些类型瘤组织营养成份，干扰或破坏肿瘤组织代谢，而正常细胞能本身合成门冬酰胺故不受影响。,谷氨酰胺酶能治疗各种白血病、腹水瘤、实体瘤等。,神经氨酸苷酶是一个良好肿瘤免疫治疗剂。,尿激酶可用于加强抗癌药品如丝裂霉素,(mitomycin),药效，,米曲溶栓酶也能治疗白血病和肿瘤等,酶类药物医学知识专家讲座,第5页,5,、其它酶类生化产品,细胞色素,c,是参加生物氧化一个非常有效电子传递体，是组织缺氧治疗抢救和辅助用药；,超氧化物歧化酶,(SOD),用于治疗类风湿性关节炎、放射病，在抗衰老、抗辐射、消炎等方面也有显著疗效。,PEG-,腺苷脱氢酶用于治疗严重联合免疫缺点症；,DNA,酶和,RNA,酶可降低痰液黏度，用于治疗慢性气管炎；,透明质酸酶用于药品扩散剂；青霉素酶可治疗青霉素过敏。,酶类药物医学知识专家讲座,第6页,6,辅酶类生化产品,辅酶或辅基在酶促反应中起着递氢、递电子或基团转移作用，对酶催化作用化学反应方式起着关键性决定作用。各种酶辅酶或辅基成份含有医疗价值。,如烟酰胺腺、腺嘌呤二核苷酸,(NAD),、烟酰胺腺嘌呤核苷酸磷酸,(NADP),、黄素单核苷酸,(FMN),、泛醌、辅酶,A,等已广泛用于肝病和冠心病治疗。,辅酶,A,常与,ATP,、细胞色素,c,、胰岛素等组成复方制剂以增强疗效。,酶类药物医学知识专家讲座,第7页,三、酶类药品制备,1,、原料选择,（,1,）不一样酶用料选择,(,含量低）,（,2,）注意不一样生长发育情况及营养情况,（,3,）原料起源丰富,（,4,）从简化提纯步骤着手,（鸽肝中提取乙酰化酶，需将动物饥饿，降低肝糖原）,（,5,）如用动物组织作原料，应在此动物宰杀后马上取材。,伴随酶应用日益广泛和需求量增加，工业生产重点已逐步转向微生物。,酶类药物医学知识专家讲座,第8页,2,、微生物酶制剂高产菌株选育,自然界分离筛选,.,物理、化学方法处理、诱变,.,基因重组与细胞融合技术,.,3,、微生物酶制剂生产发酵技术,菌株产酶最适培养条件（培养基、温度、,PH,、通气量）,一系列工艺条件（灭菌方式、发酵罐型号）,酶类药物医学知识专家讲座,第9页,（,1,）材料预处理,动物材料预处理,：,机械法,冻融,丙酮粉微生物材料预处理,:,干燥法：干燥后菌体产生自溶。,空气干燥法：适合于酵母，热稳定性好酶。,真空干燥法：适合细菌,冷冻干燥：适合于较敏感酶。,机械法,酶法处理,4,、酶类药品提取与纯化,酶类药物医学知识专家讲座,第10页,（,2,）,酶提取,水溶解法：惯用稀盐溶液或缓冲液提取，普通在低温下操作，酸性蛋白酶用碱性溶液提取，碱性蛋白酶用酸性溶液提取，盐溶度以等渗为好，,0.15mol/L NaCl,离子强度是最适合酶提取。,有机溶剂法,一些结合酶如微粒体和线粒体膜酶，因为和脂类牢靠结合，用水溶液极难提取，为此必须除去结合脂类，且不能使酶变性，最惯用有机溶剂是丁醇。,表面活性剂法,表面活性剂能与蛋白质结合而分散在溶液中，故能够提取结合酶。,酶类药物医学知识专家讲座,第11页,（,3,）酶制剂工业提取法,发酵液预处理及过滤：,在发酵液中加入絮凝剂（聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷氨酸）,酶液脱色（活性炭、脱色树脂）,盐析,有机溶剂法,喷雾干燥直接制备粉末酶制剂,酶类药物医学知识专家讲座,第12页,（,4,）酶纯化,凡用于蛋白质纯化伎俩均适合用于酶纯化,.,注意两个问题：,1.,建立快速测定酶活力方法,2.,建立活力回收表,酶类药物医学知识专家讲座,第13页,杂质去除,PH,和加热沉淀法,蛋白质表面变性法,选择性变形法,核酸沉淀剂法,酶与底物结合,脱盐(透析、凝胶过滤）,浓缩（超滤、真空减压浓缩薄膜浓缩、,冷冻浓缩和聚乙二醇浓缩）,酶结晶-处于过饱和状态,盐析法,有机溶剂沉淀法,复合结晶法,透析平衡法,等电点法,酶分离和纯化过程注意事项-（变性、辅因子流失、降解）,酶类药物医学知识专家讲座,第14页,1938,年,Marn,等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶,1969,年,McCord,等重新发觉这种蛋白，而且发觉了它们生物活性，搞清了它催化过氧阴离子发生歧化反应性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。,超氧化物歧化酶按其所含金属辅基不一样可分为三种：,（,1,）是,Cu.ZnSOD,，最为常见一个酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；,（,2,）是,MnSOD,，呈紫色，存在于真核细胞线粒体 和原核细胞内；,（,3,）是,FeSOD,），呈黄褐色，存在于原核细胞中。,1,、概述,超氧化物歧化酶,（,Superoxide dismutase,SOD,）,酶类药物医学知识专家讲座,第15页,人类,SOD,酶晶体结构,（彩虹彩色图：,N-,末端,=,蓝色，,C-,末端,=,红色）,结合铜（蓝,-,绿球）与锌（灰球）,线粒体,SOD,酶类药物医学知识专家讲座,第16页,2,、,SOD,临床作用,酶类药物医学知识专家讲座,第17页,3,、,SOD,应用领域,（,1,）药品类,主要集中在炎症病患者，尤其治疗类风湿关节炎、慢性多发性关节炎、心肌梗塞、心血管病、肿瘤患者以及放射性治疗炎症病患者；,（,2,）生化制药,作为一个生化酶制剂，广泛应用于临床和科研上，可抗衰老，抗肿瘤、调整人体内分泌系统；,（,3,）化装品,可添加在化装品中，含有抗氧化抗腐蚀优良性能。以,SOD,为主要成份化装品风靡世界，引发了化装品历史上一场革命，使人类永葆青春漂亮梦想成真；,（,4,）保健食品、饮料,SOD,糖、,SOD,口服液、,SOD,干啤等都非常畅销。在饮料、糖果、糕点等食品中加入,SOD,既可利用其抗腐蚀性延长保质期，又可调整人体内分泌系统,。,酶类药物医学知识专家讲座,第18页,酶类药物医学知识专家讲座,第19页,4,、,SOD,性质,对热稳定：天然牛血,SOD,可,75,加热数分钟，对热稳定性与溶液离子强度相关,对,pH,稳定性：普通,pH5.39.5,较稳定，猪血,SOD,在,pH7.6,9,较稳定,金属辅基与酶活性关系,Cu,、,Zn-SOD,：,Zn,与分子结构相关，与催化活性无关,Cu,与活性相关，对酶活力是必需,Mn-SOD,：,Mn,对酶活力是必需,Fe-SOD,：,Fe,对酶活力是必需,酶类药物医学知识专家讲座,第20页,5,、,SOD,制备,酶类药物医学知识专家讲座,第21页,提取工艺关键点：,溶血液制备：新鲜牛血以,3.8%,柠檬酸钠抗凝,血球分离机分离红细胞,加,2,倍无离子水,搅拌溶血,30 min.,选择性热变性：溶血液泵入夹层反应釜,搅拌蒸汽加热至,68,加入适量蛋白质沉淀剂使血红 蛋白完全变性后,将反应液泵入冷却罐,搅拌机搅拌,快速冷却至,15,按反应液总体积补加适量蛋白质沉淀剂,搅拌,1 h,甩干过滤去除变性血红蛋白,过滤液,3000rpm 20min,低速离心,去除颗粒沉淀物,.,超滤浓缩：上清液经微孔过滤去除细微颗粒,经超滤器超滤浓缩至总体积,1/200,搜集浓缩液,.,丙酮沉淀：超滤浓缩液预冷至,4,加入等体积预冷工业丙酮,放置,1h,4000rpm 30min,冷冻离心,沉淀用少许无离子水回溶,对无离子水透析,12h,4000rpm 30min,冷冻离心,搜集上清液,.,柱层析：经处理,DEAE-52,装柱,用,2.5mM/L,缓冲液平衡,迟缓上样,用梯度洗脱,搜集,SOD,部分,对无离子水透析,12h.,冷冻干燥 透析后酶液经浓缩,置冻干机内冷冻干燥,升温速率控制在,5/h.,酶类药物医学知识专家讲座,第22页,6,、,SOD,检测,SOD,酶活力测定 采取邻苯三酚自氧化法,25,自氧化速率,0.07,pH8.2,50mM Tris-HCl,缓冲液,.,蛋白质浓度测定 采取,Lowry,法,以,250g/ml BSA,作标准曲线,.,分子量测定 采取,SDS-PAGE,电泳法,浓缩胶,3.5%,分离胶,10%.,紫外吸收光谱检测 扫描波长范围,230300 nm.,酶类药物医学知识专家讲座,第23页溶菌酶（,lysozyme,）,1,、概述,（,1,）溶菌酶（又称胞壁质酶、,N-,乙酰胞壁质聚糖水解酶）是一个能水解致病菌中黏多糖碱性酶。主要经过破坏细胞壁中,N-,乙酰胞壁酸和,N-,乙酰氨基葡糖之间,-1,4,糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，造成细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷病毒蛋白直接结合，与,DNA,、,RNA,、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。所以，该酶含有抗菌、消炎、抗病毒等作用。,（,2,）,20,世纪初，英国细菌学家弗莱明（,Flemin,）在发觉青霉素前,6,年（,1922,年）发觉人唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁酶，因其含有溶菌作用，故命名为溶菌酶,。,。,酶类药物医学知识专家讲座,第24页,（,3,）性质,：,其纯品为白色或微黄、黄色结晶体或无定型粉末，无异味，微甜，易溶于水，遇碱易被破坏，不溶于乙醚，,溶菌酶由,129,个氨基酸残基组成碱性球蛋白，,等电点在,pH10.8,左右，,分子量为,14000,，,化学性质非常稳定，当,PH,值在,1.2-11.3,范围猛烈改变时，其结构几乎不变，,在酸性环境下，溶菌酶对热稳定性很强，,pH4.0-7,时，,100,处理,1min,仍能保持原油酸活性；,pH,值低于,4,时，能耐,100,加热处理，,在空气湿度较低时，溶菌酶能够长久在室温下存放。,酶类药物医学知识专家讲座,第25页,2,、溶菌酶制备,酶类药物医学知识专家讲座,第26页,胰蛋白酶（,Trypsin,）,1,、概述,胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取一个蛋白水解酶。,白色或米黄色结晶性粉末。,溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。,分子量,24 000,，,pI 10.5,，最适,pH,值,7.8,8.5,左右。,pH9.0,不可逆失活。,酶类药物医学知识专家讲座,第27页,2,、临床应用,能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸羧基所组成肽链，能消化溶解变性蛋白质，对未变性蛋白质无作用，所以，能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，另外还有抗炎症作用。临床上用于脓胸血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。,酶类药物医学知识专家讲座,第28页,3,、,胰蛋白酶制备（一）,酶类药物医学知识专家讲座,第29页,可溶性固定化胰蛋白酶制备,（二）,（,1,）载体合成：将,2g,经过碱处理壳聚糖,置于,40 mL,二甲亚砜中,在搅拌下加入,2g,丁二酸酐,于,65,反应,4-6 h,。反应结束后过滤,固相用乙醇浸泡,1 h,并将,pH,调到,10,左右。过滤后将沉淀物溶于蒸馏水中,用,4,倍体积丙酮沉淀,沉淀物再依次用无水乙醇和丙酮洗涤,40,真空干燥后得,N-,琥珀酰壳聚糖,。称取,1g N-,琥珀酰壳聚糖,溶于,20 mL,磷酸盐缓冲液中,调整,pH,至,45,左右,离心搜集沉淀。将沉淀溶解于,20 mL,磷酸盐缓冲液,即得,载体溶液,。,（,2,）可溶性固定化酶,(soluble-immobilizedtrypsin,SIT),制备,在磁力搅拌下向,20 mL,载体溶液中滴加入一定量,5%EDC,1-,乙基,-3-(3-,二甲基氨丙基,)-,碳二亚溶液和,10 mL,胰蛋白酶磷酸盐溶液,(2 mg/mL),于,5-15,反应一段时间后,调整溶液,pH,至,45,左右,离心搜集沉淀,用柠檬酸钠缓冲液,(02 mol/L,pH45),洗涤后,离心搜集沉淀。沉淀溶于磷酸盐缓冲液,(02 mol/L,pH80),定容至,50 mL,即得,SIT,溶液。,酶类药物医学知识专家讲座,第30页,尿激酶（,Urokinase,）,1,、概述,从健康人尿中分离，或从人肾组织培养中取得一个酶蛋白。,本品直接作用于内源性纤维蛋白溶解系统，能催化裂解纤溶酶原成纤溶酶，后者不但能降解纤维蛋白凝块，亦能降解血循环中纤维蛋白原、凝血因子,和凝血因子,等，从而发挥溶栓作用,分子式：,C21H25BrN2O3,分子量：,433.35,本品为白色状粉末,。,酶类药物医学知识专家讲座,第31页,2,、临床作用：,用于急性心肌梗塞、急性脑血栓形成和脑血管栓塞、肢体周围动静脉血栓、中中央电视台网膜动静脉血栓及其它新鲜血栓闭塞性疾病。,酶类药物医学知识专家讲座,第32页,3,、重组人尿激酶原（,prouk,）工业化制备,（,1,）重组人,prouk,工程菌发酵,从,LB(,含,50g/mL Kan),平板上挑取,prouk,工程菌单菌落,于,500 mL LB,培养基中,经,37,、,180 r/min,培养约,12 h,后,接种至,10 L,种子罐,初始时设定温度为,37,pH 7.0,搅拌速度,200 r/min,通气量,5 L/min,溶氧,100%,打开酸泵,(2 mol/LHCl),和碱泵,(,浓氨水,),控制,pH,为,7.0.,逐步增加通气量至,15 L/min,搅拌速度最终提升到,1 000 r/min.,发酵进行约,4 h,细菌生长进入对数期,OD600,可达,1215,移入,100 L,发酵罐,.,控制,pH,为,7.0,伴随发酵进行,溶氧逐步下跌,可增加通气量和提升搅拌速度,.,约,3 h,后,OD600,增至约,1215,加入,IPTG,至终浓度,0.5 mmol/L,开始补充葡萄糖,(25%,葡萄糖终浓度为每升低于,1.5 g).,发酵过程中每,1 h,取样一次,测定,OD600,绘制生长曲线,当生长速度显著减慢,曲线到达基本水平时放罐,用连续流离心机,4,、,20 000 r/min,离心培养物,搜集菌体并称量,-80,保留备用,整个过程约,1012 h.,酶类药物医学知识专家讲座,第33页,（,2,）重组人,prouk,活化,将已知重量菌体,按,8 mL/g,湿重百分比加入,裂解液,(100mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L EDTA,pH 7.0),搅拌混匀,.,用弗氏压碎器,破碎,细胞两次,(16 00018 000 Lb/in2),待细胞裂解液冷至,4,时用超声匀浆仪,超声,直至溶液不再粘稠,.4,12 000 g,离心,30 min.,取沉淀物,(,包涵体,),悬浮在,9,倍体积洗涤缓冲液,(100 mmol/L Tris,5 mmol/L EDTA,0.5%Triton,2 mol/L Urea,pH 7.0),中,洗涤,3,次,.,取洗涤后湿包涵体约,1 000 g,溶解于,10 L,变性缓冲液,(10 mmol/L Tris-HCl,6 mol/L,盐酸胍,1 mmol/L EDTA,100 mmol/L DTT,pH 9.0),氮气饱和,45,变性,12 h.4,8 000 rmin,离心,30 min,取上清,逐步稀释到含有不一样浓度盐酸胍,NaCl,Urea,GSSG,GSH,等复性缓冲液中,反应终体积为,250 L,静置,24 h.,测定酶活力,参考,UK,标准曲线定出,prouk,活力含量,.,酶类药物医学知识专家讲座,第34页,（,3,）,prouk,分离纯化：,将,250 L,活化液超滤浓缩至,50 L,对,50 mmol/L HAc-NaAc,溶液,(pH 4.8),透析,.,透析液体积每次,250 L,每次,6 h,连续,4,次,.,将透析及过滤后活化液上,CM-,纤维素柱,(,直径,24 cm),流速约,3 L/h,经,50 mmol/LHAc-NaAc,0.1 mol/L NaCl,pH4.8,缓冲液洗涤后,用,50 mmol/LHAc-NaAc,0.5 mmol/L NaCl,pH4.8,洗脱液洗脱,搜集洗脱峰,超滤浓缩后上,Superdex 75,柱,(60600 mm),每次上样量约,1 g,用,5 mmol/L HAc-NaAc,0.1 mmol/L NaCl,pH 4.5,缓冲液洗脱,.,（,4,）去热源：采取,Affi-Prep ploymyxin support,亲和层析,去除内毒素,调,prouk,样品,pH,至,6.0,并迟缓流过,Affi-PrepPolymyxin,层析柱,搜集穿过液,并对,5mmol/L,醋酸透析过夜。,（,5,）冷冻干燥,酶类药物医学知识专家讲座,第35页,酶类药物医学知识专家讲座,第36页,