大肠菌群检测.doc

曹双：请综合看看各种方法，比较一下，有些内容是一致的，有些是每种方法不同于其他方法的，注意比较。
第一篇
（蓝色部分为说明和附录，去掉这部分剩下的为连续文件）

大肠杆菌检验方法
　　　　SN 0169—92出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
　　　　GB/T 4789.6—1994　食品卫生微生物学检验　致泻大肠埃希氏菌检验 （这两个检验方法另有完全的PDF文件，见文件夹）
以SN标准方法为例，进行说明。
样品制备：
　　以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
　　稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
　　附：这是一种9管MPN法测定方法，什么是MPN法（最近似法）？
MPN法简介
发布日期：2010-05-13   浏览次数：212
The Most Probable Number Method　　In the following example, a set of 3 tubes of an all purpose broth medium is inocu
The Most Probable Number Method
　　In the following example, a set of 3 tubes of an all purpose broth medium is inoculated from each of the ten-fold dilutions, with each tube being inoculated with one ml.

　　After incubation, the number of tubes showing growth is recorded. As the succeeding dilutions were made, the organisms were diluted to such an extent that none were in the inocula of seven of the tubes (marked negative). In order to estimate the number of organisms per ml of the sample which would cause this kind of growth response, we locate the three sets of tubes which show dilution of the organisms "to extinction" – i.e., those tubes which were inoculated from the 10–2, 10–3 and 10–4 dilutions.

　　　　　　　　　　　　　　　　　附　录
　　　 　　　　　　　1g检样中最近似值(MPN)表 (补充件)
以0.1、0.01、0.001g各用3管。
━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━
阳 性 管 数　　　 ┃　　　　┃　　　阳 性 管 数　 ┃
━━━━━━━━━┫　MPN 　┣━━━━━━━━━━┫ MPN
0.1 0.01 0.001　 ┃　　　　｜ 0.1 0.01 0.001　　┃
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
　0　 0　 0　　　 ┃ ＜3 　┃　 2　 0　 0　　　　┃ 9.1
　0　 0　 1　　　 ┃　 3　 ┃　 2　 0　 1　　　　┃ 14
　0 　0　 2　　　 ┃ 　6　 ┃　 2　 0　 2　　　　┃ 20
　0 　0　 3　　　 ┃　 9　 ┃　 2　 0　 3　　　　┃ 26
　0　 1　 0　　　 ┃　 3　 ┃ 　2　 1　 0　　　　┃ 15
　0　 1　 1　　　 ┃ 　6.1 ┃　 2　 1　 1　　　　┃ 20
　0 　1　 2　　　 ┃　 9.2 ┃ 　2　 1　 2　　　　┃ 27
　0　 1　 3　　　 ┃　　12 ┃　 2　 1　 3　　　　┃ 34
　0　 2　 0　　　 ┃　 6.2 ┃ 　2　 2　 0　　　　┃ 21
　0　 2　 1 　　　┃ 　9.3 ┃　 2　 2　 1　　　　┃ 28
　0　 2　 2　　　 ┃　 12　┃　 2　 2　 2　　　　┃ 35
　0　 2　 3　　　 ┃ 　16　┃ 　2　 2　 3　　　　┃ 42
　0　 3　 0　　　 ┃　 9.4 ┃　 2　 3　 0　　　　┃ 29
　0　 3　 1　　　 ┃　 13　┃　 2　 3　 1　　　　┃ 36
　0　 3　 2　　　 ┃　 16　┃ 　2　 3　 2　　　　┃ 44
　0　 3　 3　　　 ┃　 19　┃　 2　 3　 3　　　　┃ 53
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
　1　 0　 0　　　 ┃　 3.6 ┃ 　3　 0　 0 　　 　┃ 23
　1　 0　 1　　　 ┃ 　7.2 ┃　 3　 0　 1　　　　┃ 39
　1　 0　 2　　　 ┃ 　11　┃　 3　 0　 2　　　　┃ 64
　1　 0　 3　　　 ┃　 15　┃　 3　 0　 3　　　　┃ 95
　1　 1　 0　　　 ┃ 　7.3 ┃ 　3　 1　 0　　　　┃ 43
　1　 1　 1　　　 ┃　 11　┃ 　3　 1　 1　　　　┃ 75
　1　 1　 2　　　 ┃ 　15　┃ 　3　 1　 2　　　　┃ 120
　1　 1　 3　　　 ┃　 19　┃ 　3　 1　 3　　　　┃ 160
　1　 2　 0　　　 ┃　 11　┃ 　3　 2　 0　　　　┃ 93
　1　 2　 1　　　 ┃　 15　┃　 3　 2　 1　　　　┃ 150
　1　 2　 2　　　 ┃ 　20　┃ 　3　 2　 2　　　　┃ 210
　1　 2　 3　　　 ┃　 24　┃ 　3 　2　 3　　　　┃ 290
　1　 3　 0　　　 ┃　 16　┃ 　3　 3　 0　　　　┃ 240
　1　 3　 1 　　　┃ 　20　┃ 　3　 3　 1　　　　┃ 460
　1　 3　 2　　　 ┃ 　24　┃　 3　 3　 2　　　　┃ 1100
　1　 3　 3　　　 ┃ 　29　┃ 　3　 3　 3　　　　┃＞1100
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LST和EC初步筛选：
　　对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。将接种管置于36±1℃培养48±2h。
　　观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养48±2h。
　　附：LST肉汤、EC肉汤有些什么？
LST肉汤和EC肉汤中有什么？
（发酵乳糖产气）

月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤
EC肉汤

　　胰蛋白(月示)或胰酪胨(Trypticase) 20g
　　氯化钠　　　　　　　　　　　　 5.0g
　　乳糖　　　　　　　　　　　　　 5.0g
　　磷酸氢二钾(K2HPO4)                        2.75g
　　磷酸二氢钾(KH2PO4)                        2.75g
　　月桂基硫酸钠                                       0.1g
　　蒸馏水                                       1000.0mL

　　胰蛋白(月示)或胰酪(月示) 20.0g
　　3号胆盐或混合胆盐　　  1.5g
　　乳糖　　　　　　　　　 5.0g
　　磷酸氢二钾(K2HPO4)        4.0g
　　磷酸二氢钾(KH2PO4)        1.5g
　　氯化钠　　　　　 　　　 5.0g
　　蒸馏水                   1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。
将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管),每管8mL。121℃高压灭菌15min,最终H6.9±0.1。

EMB平板：
　　取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。
　　检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
　　如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h。
　　附：怎样进行平板划线分离？
平板划线分离的方法
发布日期：2010-09-01   浏览次数：202
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法  
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法

窗体顶端
窗体底端

　　　　平板划线示例
平板划线示例
发布日期：2010-09-01   浏览次数：612
平板划线示例 This is an example of a good stre
平板划线示例

This is an example of a good streak for isolation using the "four corners" method.
The small colonies here are of Staphylococcus epidermidis

This is not a great streak plate but it is serviceable, as there are a few isolated colonies. This plate would have been better if the loop had been flamed between each sector.

This is an example of how NOT to streak for isolation. Scribbling is not streaking, and most likely will not result in isolated colonies

This plate isolates two different colonies: Escherichia coli (the cream-colored) colonies, and Serratia marcescens (the red colonies).(粘质沙雷菌）

This is a plate with Micrococcus luteus滕黄微球菌 , the yellow colonies. While this is a good streak for isolation, the plate has been contaminated. The large "fuzzy" colonies are fungal colonies.
The lid may have been lifted too far away from the plate while streaking, or a draft may have caused the spores to fall into the plate.
　　　　EMB平板原理及照片
EMB平板照片及原理
发布日期：2010-05-13   浏览次数：238
　　　This image illustrates the growth of gram-negative bacteria that cannot ferment lactose on eosin methylene blue (
　　　This image illustrates the growth of gram-negative bacteria that cannot ferment lactose on eosin methylene blue (EMB) agar. EMB agar contains bile salts and dyes which inhibit growth of gram-positive bacteria. Growth on EMB agar is a useful diagnostic tool to distinguish between lactose fermenters and nonfermenters which will appear colorless. This image can be used to describe the use of metabolism in identification of bacteria. Salmonella and Shigella, both nonlactose fermenting pathogens, can be distinguished from the more common intestinal flora which ferment lactose.

　　lnfemb-an.jpg Lactose Nonfermenter on EMB
　　Pat Johnson, Palm Beach Community College, Lake Worth, Fla., USA

窗体顶端
窗体底端

生化试验：
　　将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。　　
　　1　色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。
　　附：靛基质试验原理及照片
靛基质试验原理及照片
发布日期：2010-05-13   浏览次数：290
靛基质（Indole）试验：　　某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基
靛基质（Indole）试验：
　　某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。
　　试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。
　　实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。

Margaret (Peg) Johnson Mesa Community College, Mesa, Ariz., USA

　　This image depicts the results of negative and positive indole tests. The indole test is frequently employed to distinguish Klebsiella or Enterobacter bacteria (indole negative) from Escherichia coli (indole positive). The presence of E. coli is used by public health officials as an indicator of fecal contamination of food and water supplies.
　　Prior to this test, Enterobacter aerogenes was used to inoculate one tryptone broth, while another tryptone broth was inoculated with Escherichia coli. The two broths were then incubated for 24 h and mixed with Kovas reagent (p-dimethylamino-benzaldehyde). Tryptone broth is rich in the amino acid tryptophan. Tryptophanase, an enzyme, is capable of cleaving tryptophan and producing indole, pyruvic acid, and ammonia. Indole can be detected by the development of a red color after adding Kovas reagent. Organisms that do not produce tryptophanase will be indole negative, as no indole will be present to react with the Kovas reagent

　　2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。
　　将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。
附：MR-VP试验原理及照片
　MR-VP试验原理及照片
发布日期：2010-05-13   浏览次数：224
甲基红（Methyl Red）试验　　肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径
甲基红（Methyl Red）试验
　　肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。 
V-P试验
　　某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。
大肠杆菌：MR + /VP - 

　　3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。
　　附：枸椽酸盐利用试验原理及斜面显色照片
枸椽酸盐试验原理及斜面照片
发布日期：2010-05-13   浏览次数：136
枸椽酸盐试验：某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于
枸椽酸盐试验：
　　某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰色。

说明：
　　SN标准所用培养基是肉汤培养基，且不加指示剂，因此，只能观察是否浑浊生长。

Koser氏枸椽酸盐肉汤
　　磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O)　　　 1.5g
　　磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0g
　　硫酸镁(MgSO4·7H2O) 　　　　　　　0.2g
　　枸椽酸钠(含2H2O)　　　　　　　　　3.0g
　　蒸馏水 1000.0mL
　　将各成分溶解于蒸馏水中,分装试管,每管10 mL,121℃高压灭菌15min。最终pH6.7
±0.2。　
4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。
　　5　革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。
大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━
　　靛 基 质┃　　 MR　　 ┃ 　　VP　　 ┃　 枸椽酸盐 ┃ 鉴定(型别)
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
　　　　＋　┃　　 ＋　　 ┃ 　　－ 　　┃ 　－ 　　　┃典型大肠杆菌
　　　　－　┃ 　　＋　 　┃ 　　－ 　　┃ 　－ 　　　┃非典型大肠杆菌
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
　　　　＋　┃　　 ＋　　 ┃　　 －　　 ┃ 　＋ 　　　┃典型中间型
　　　　－　┃　　 ＋ 　　┃ 　　－ 　　┃ 　＋　　　 ┃非典型中间型
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
　　　　－　┃　　 － 　　┃　　 ＋　　 ┃　 ＋　　　 ┃典型产气肠杆菌
　　　　＋　┃　　 － 　　┃ 　　＋ 　　┃ 　＋ 　　　┃非典型产气肠杆菌
━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━
　　如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做
重复试验。
结果报告：
　　大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋
－－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN
值。
第二篇
大肠菌群测定的操作细则（MPN法）
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1 设备和材料
1.1 温箱：36±1℃。
1.2 冰箱:0～4℃
1.3 恒温水浴 :44.5±0.5℃。
1.4 天平。
1.5 显微镜。
1.6 均质器或乳钵。
1.7 平皿:直径为90mm。
1.8 试管。
1.9 吸管。
1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11 玻璃珠:直径约5mm。
1.12 载玻片。
1.13 酒精灯。
1.14 试管架。
2 培养基和试剂
2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
2.6 生理盐水。
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
3 操作步骤
3.1 检样稀释
3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
3.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖 胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃ 温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
3.3 分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃ 温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
3.4 证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置 36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
3.5 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
4 粪大肠菌群(faecal coliform)
4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置 培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。
4.2 结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。
第三篇
出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
Method for examination of coliform，fecal coliform and escherichia coli in food for export
SN 0169—92
代替ZB X09 002—86
1 主题内容与适用范围
本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2 设备和材料
2.1 吸管：1mL，具0.1mL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。
2 2 水浴箱：44.5±0.5℃。
2.3 培养箱：36±1℃，44.5±0.5℃。
2.4 冰箱：0～5℃和-15～-20℃。
2.5 均质器。
2.6乳钵和研棒。
2.7 平皿：直径90mm。
2.8天平：感量0.1g。
2.9 显微镜
2.10 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11 玻璃珠：直径约5mm。
2.12菌落计数器。
3 培养基及试剂
3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白 (LST)肉汤。
3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。
3.3 EC肉汤。
3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。
3.5营养琼脂斜面。
3.6 色氨酸肉汤。
3.7 MR-VP培养基。
3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。
3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11 生理盐水。
3.12 革兰氏染色液。
3.13 Kovacs氏靛基质试剂。
3.14 甲基红指示剂。
3.15 Voges—pros kauer(V—P)试剂。
4 样品制备
4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2—5℃18h内解冻，或在45℃以下15min内解冻。
4.2 不同食品样品匀液的制备
4.2.1 液体食品
以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇)，制成1：10的样品匀液。
42.2 固体和半固体食品
以无菌操作取25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r／min均质1～2min，制成1：10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如10-2、10-3、10-4.………。从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15min。
5 大肠菌群的测定  
5.1 大肠菌群MPN值的测定
5.1.1 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白 (LST)肉汤，每管接种1mL。
5.1.2 将接种管置于36±1℃培养48±2h。
5.1.3 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。
5.2 大肠菌群的证实试验
5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。
5.2.2 置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。
5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。
5.2.4 结果报告：按BGLB肉汤产气管数，查MPN表(见附录B(补充件))报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。
6 粪大肠菌群测定
61 用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内，培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。
6.3 记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。
6.4 结果报告：按产气管数，查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。
7 大肠杆菌测定
7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h，取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板，36±1℃培养24±2h。
7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
7.3 如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36±1℃培养18～24h。
7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
7.4.1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后，加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL，上层出现红色为靛基质阳性反应。
7.4.2 MR—VP培养基；在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1mL至13mm×l00mm试管中，加5％ɑ—萘酚乙醇溶液0.6mL，40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性。
将MR—VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。
7.4.3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。
7.4.4 LST肉汤：于30±1℃培养48±2h，观察试管中是否产气。
7.4.5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。
7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
靛基质        MR        VP        枸椽酸盐        鉴定（型别）
+        +        -        -        典型大肠杆菌
-        +        -        -        非典型大肠杆菌
+        +        -        +        典型中间型
-        +        -        +        非典型中间型
-        -        +        +        典型产气肠杆菌
+        -        +        +        非典型产气肠杆菌
如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。
7.5 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为++--或-+--，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。
8 大肠菌群固体培养基测定法
8.1 样品制备同第4章。
8.2 计数
8.2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样品液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿1mL。另取lmL稀释剂加入一个灭菌平皿中，作空白对照。
8.2.2 将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10～15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀。
8.2.3 待琼脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。
8.2.4 翻转平板，置于36±l℃培养18～24h。
8.2.5 选用有30～150个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。
8.2.6 证实
8.2.6.1 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养24h和48h，观察产气情况。
8.2.6.2 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管，应进行革兰氏染色，以便排除革兰氏阳性杆菌。
8.2.7 结果报告
经最后证实为阳性(产气，革兰氏阴性杆菌)的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。
例：10-4样品稀释液lmL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：
100×6／10×104／g(mL)＝6.0×105／g(mL)
附 录 A
培养基和试剂
(补充件)
A1 月桂基硫酸盐胰蛋白 （LST）肉汤  
胰蛋白 或胰酪胨(Trypticase)
20g
氯化钠        5.0g
乳糖        5.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4)        2.75g
磷酸二氢钾(KH2P04)        2.75g
月桂基硫酸钠        0.1g
蒸馏水        1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。
A2 煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤
蛋白胨        10.0g
乳糖        10.0g
牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液        200.0mL
0.1％煌绿水溶液        13.3mL
蒸馏水          
将蛋白胨乳糖溶于