药物跨膜转运载体.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,P,o,w,e,r,B,a,r,中国专业,PPT,设计交流论坛,药物跨膜转运载体,-ABC,类载体,一、,ABC,类转运体,ATP,结合盒,(,ATP-binding cassette,，,ABC),类物质外排转运载体。,这类转载体转运各种类型的底物如糖、氨基酸、金属离子、多肽、蛋白质以及各种脂溶性物质外排式跨膜转运。,ABC,类载体是许多生命过程必须的，缺陷可以引起多种疾病或与多种疾病有关如囊性纤维化、神经系统疾病、视网膜变性、胆固醇和胆汁转运缺失、贫血症和药物反应异常等。,特点：,1,。与,ATP,结合，利用,ATP,跨膜转运物质。底物分子转运是单向的，通常是泵出细胞外。,2,。结构上：,ATP-,结合域,称之为核苷结合包,(NBF),和跨膜,(TM),域。该域一般由,6,个,-,螺旋段组成。,NBF,含,3,个保守区域,Walker A,、,Walker B,和,Walker C,。在,Walker,A,和,B,存在,ATP,结合点,，而,Walker C,为一签名区,位于,Walker B,的上游，,C,区是相应,ABC,载体,特有性的。,3,。典型的,ABC,载体有两个,NBF,和两个,TM,域,NBF,存在于胞浆侧。,发现,48,个,ABC,载体。,这些基因根据区域的构成和氨基酸的同组关系分成,7,个亚型。,许多,ABC,载体在脂质层的功能维持、脂肪酸转运和类固醇类转运方面有重要的作用。,已发现,14,种与人类疾病相关的,ABC,基因,ABCC2,（,Abcc2,）基因突变：与,Dubin-Johnson,综合征有关。,ABCC2,蛋白存在于肝细胞的管侧面膜上调节有机阴离子转运。在多有机阴离子转运载体（,TR-,）的缺陷的大鼠中，该大鼠已,用作,Dubin-Johnson,综合征的动物模型。,ABCB7,基因的错义与成高铁红细胞贫血症和失调（,XLSA/A,）相关。,CFTR蛋白为氯离子通道，与所有外分泌有关，缺陷导致胆囊纤维病变。,ABCC8,是磺酰脲受体，对磺酰脲药物有高度的亲和力。磺酰脲类药物为治疗非胰岛素依赖性糖尿病，主要促进胰岛素的分泌。,ABCC8,基因突变可能,type II,糖尿病有关。,二、多药耐药（药物外排载体）,所有,ABC,的外排在体均存在于细胞膜上，参与各种结构类型的药物、代谢物和化合物的外排。根据结构类型，药物外排载体分为四大类。,ABC,家族药物转运载体的预测二级结构。,NBD,（,ATP,）,核苷结合点,IN,细胞内,OUT,细胞外,药物载体在极性细胞（包括组织内皮或上皮细胞）中的定位,。,1.MDR1 P-,糖蛋白,(,MDR1 P-glycoprotein),ABCB1.,又称为,M,DR1,，,P-GP,或,PGY1,。,人,MDR1,MDR3,药物,药物，脂质,MDR,基因,MDR,基因,Mdr1a,/,mdr1b,mdr2,药物,药物，脂质,P-,GP,有两个相似和对称的半载体组成,每个半载体有一个,ATP,结合点和,6,个,TM,域。两个半载体只有,43%,氨基酸序列是一致的。,先与,ATP,结合，再水解是药物转运必需的。,不同的底物转运需要的,ATP,分子是不同的，每转运一个药物分子出细胞,需要,0.3-3,个分子的,ATP,。,P-gp,催化循环,.,药物和,ATP,与,Pgp,结合,P-GP,转运柔红霉素,(DNR),跨膜两步过程,。环孢素,A(CsA),XR9576(XR),和长春碱,(VL),在细胞浆侧面阻断,维拉帕米,(VER),在细胞外侧阻断,(,优先占领,).,2.P-GP,底物,P-GP,有各种类型的底物如秋水仙碱阿霉素、长春碱、脂质、类固醇、化学异物和多肽等,.,似乎无共性,1,）多数底物是两性分子,2),化合物脂溶性和氢键的数目决定底物与,P-GP,亲和力的重要参数。脂溶性大或,氢键数目多，,P-GP,的亲和性高,.,电子供体基团间距离有一定范围是识别,P-GP,结合点必需的，至少其中一个,2.5 0.3,，另一个为,4.6 0.6,MDR1 P-GP,抑制剂,第一代,P-GP,抑制剂如维拉帕米、环孢素,A,第二代或第三代抑制剂,PSC 833,GF120918,P-GP,生理功能,1),肿瘤细胞 耐药原因之一 诱导性,2,）正常体内：生理性屏障（肠上皮、脑血管内皮细胞、胆小管上皮细胞、胎盘合胞体滋养细胞）,1),血脑屏障,在脑血管内皮细胞腔侧面表达丰富的,P-GP,成为许多药物难以通过血脑屏障的原因,;,一些疾病如癫痫诱导,P-GP,表达,成为顽固性癫痫的原因之一,炎症下调,P-GP,表达,导致血脑屏障的通透性显著增加,.,Fig.Western blot showed expression of P-gp from the cerebral cortex of normal rats and PTZ-kindled rats.,n,=3.,(*,p,0.01 vs Normal),Fig.P-gp functional activity in hippocampus and cerebral cortex of normal rats and PTZ-kindled rats.Samples of 60min after a single dose of 0.2mg/kg Rh123.,n,=4.(*,p,0.05,*,p,0.01 vs Normal),Fig.Distribution of PB in brain tissues of normal rats,kindled rats and kindled rats treated with CsA(5 mg/kg).Samples of 60min after a single dose of 10mg/kg PB.Data were expressed as ratio values as meanSD(,n,=4).(*,p,0.05,*,p,0.01 vs normal rats,#p0.05,#p0.01 vs kindled rats).,2),在肝,-,胆和肠中作用 生物利用度的原因,(1),保护机制 防止毒物由胃肠道进入体内。,(2,）肠上皮细胞中,P-GP,分泌功能成为许多药物吸收差的原因之一,成为药物口服吸收的障碍。,野生型小鼠灌胃,50 mg/kg,紫衫醇约有,95%,的药物原型从粪中排泄,.,同时口服,P-GP,抑制剂环孢素,A(50 mg/kg),PSC 833(50 mg/kg),GF120918(25 mg/kg),LY335979(80mg/kg),或,R101933(80 mg/kg),显著降低粪中原型药物的排谢分数，分别为,32.4%,12.5%,6.2%,34.9%,和,73.6%,。,在,mdr1a/1b,基因敲除小鼠，粪中原型排泄分数只有,6%,。,3),P-gP,介导的药物外排,符合载体转运的特点，存在饱和特性,某些底物的,M-M,常数,不同底物和剂量肠道,P-GP,的作用是不同的。,A.,地高辛通常剂量是,0.5,到,1mg,，肠内的浓度不到,10,mol/l,，低于,Km 58,mol/l,。,P-Gp,在吸收方面有重要的意义，可能是该药物吸收程度地和变异大的主要原因。,B.,剂量大于,50mg,，,肠内药物浓度达到,mmol/,l,水平,，,可能超过,相应药物的,Km,值,，,P-GP,的活性处于饱和，,P-GP,对药物吸收的贡献不大。,Indinavir,：,P-GP,的底物,，剂量高达,800mg,，肠内浓度超过,1 mmol/L,远远大于,Km 140,mol/L,，,p-GP,的作用对,贡献不大。仍然有好的生物利用度,C.,一些药物如,环孢素（,200,700mg,）,、紫杉醇（,100,200 mg,），尽管剂量很高，由于,这些药物的溶解度和释放度低，肠内的浓度低于,Km,值，但,P-GP,对吸收的影响仍然很大。,D.,某些药物吸收程度随剂量增加而增加如,(,S,)-(,)-talinolol,计量校正的,AU,C,由 12.5,mg,剂量的,18,g,.,h/l,增加到,200,mg,剂量的,36,g,.,h/l,。,4),肠中,P-GP,也是机体重要保护机制之一，免受各种肠中毒素的侵害。如,Mdr1a,缺陷小鼠产生一种大肠炎症，类似人类的肠内部炎。正常情况下，肠中的,P-GP,阻止毒素进入肠壁内,.,复杂性和注意问题,:,抑制胃肠道上,P-GP,功能,必然降低屏障功能,增加毒物,(,素,),进入体内,!,肠不同部位,P-GP,的表达不同,.,图,6.,人肠中不同部位,P-gp,和,villin IOD ratio,比值平均和变异,.1/2,代表十二指肠,/,近端空肠，,3/4,5/6,和,7/8,分别代表中段至远端空肠，近端回肠支远端回肠。,3,),胎盘 屏障,P-GP,存在于胎盘合胞体滋养层顶侧面膜。类似于血脑屏障，防止有毒物质从母体进入胎儿。,在,P-GP,缺陷或基因敲除动物，,avermectin,地高辛,saquinavir,和,紫杉醇,通透性增加,10,20,倍。,对于多数治疗药物而言，在胎盘上的低通透性当然是需要的，但在有些情况下，成为治疗上的障碍。如对于,HIV,治疗，希望在婴儿出生前，有一个合适的,“,负荷剂量,”,，降低在出生过程中,母,-,婴,H,IV,感染的频率,乳腺癌耐药蛋白,(,BCRP),1.,乳腺癌耐药蛋白（,b,reast cancer resistance protein,BCRP,ABCG2,）。,BCRP,只有一个,NBF,和,TM,域，为半,ABC,载体。,BCRP mRNA,最早发现于胎盘中。,BCRP,首先是从乳腺癌细胞中分离得到的，称之为乳腺癌耐药蛋白。,第一次在,耐阿霉素的,MCF7,乳腺癌细胞株,(MCF-7/AdrVp),中克隆到,BCRP,。,鼠类命名为,Bcrp1,BCRP,是细胞株对丝裂霉素、阿霉素和柔红霉素抗癌药物等产生耐药的主要原因。,BCRP,主要在细胞膜上，存在于细胞的顶侧面上,.,2.BCRP/Bcrp1,介导的耐药,BCRP,的底物与,P-GP,MRP1,和,MRP2,的底物间有较大的重叠性,细胞株对丝裂霉素,拓朴替康,9-,氨基喜树碱,柔红霉素,SN-38,flavopiridol,吲哚咔唑,拓朴酶抑制剂,(NB-506,和,J-107088),细胞染料如罗丹明,123,Lysotracker,绿,BBR3390,以及,荧光素,-,BODIPY-prazosin.,对长春新碱紫杉醇和顺铂等抗癌药无耐药性,不同药物诱导表达的结果往往存在差异。某些,药物诱导,表达,B,CRP,细胞株,对蒽醌类有很高的耐药性,而另一些药物诱导,B,CRP,表达的细胞株,相对丝裂霉素而言，则对蒽醌类几乎没有耐药性。,有些诱导表达,BCRP,细胞株对拓朴替康的耐药性相当高,但另一些诱导表达,BCRP,细胞株的耐药很低,存在两种突变株：,野生型,482,位上的氨基酸为,Arg,两种突变型,:,Thr,和,Gly。,不同的,BCRP,对底物的作用不同。,野生型与突变型比较,野生型 突变型,482,位,A,Arg,Thr,或,Gly,底物,叶酸及其衍生物,+-,罗丹明,123 -+,LysoTracker,绿,-+,柔红霉素,-+,丝裂霉素,+,bodipy-prazosin +,Hoechst 33342 +,抑制剂新生霉素,+-,3,.,BCRP/Bcrp1,抑制剂,（,1,）,GF120918,;P-GP,抑制剂,，也是有效的,BCRP/Bcrp1,抑制剂,;,抑制药物外排泵,BCRP,和,P-GP,（,2,）,fumitremorgin C(FTC),是有效,的,BCRP-,抑制剂,但在体有神经毒性，其中两种类似物,Ko132,和,Ko134),活性比,FTC,大，,Ko134,细胞毒性很低，在体可以用很高剂量,可以显著增加小鼠口服拓扑替康的生物利用度,。,（,3,）某些,HIV,蛋白酶抑制剂强效的,BCRP,抑制剂,.z,在表达野生型,BCRP,的,HEK,细胞株中，,ritonavir,saquinavir,和,nelfinavir,是有效地抑制,BCRP,介导的丝裂霉素转运，其,IC50,分别为,19.5,19.5,和,12.5 mol/l,。,（,4,）植物酚类化合物,：,5,7-,二羟黄酮,(,Chrysin),和,biochanin A,，,silymarin,橙皮素（,hesperetin,）,栎精（,quercetin,）,黄豆苷（,daidzein,）,stilbene resveratrol,。,（,5,）香豆霉素抗生素：新生霉素,（,6,）酪氨酸激酶抑制剂,：,STI-571(imatinib mesylate),ZD1839(Iressa;gefitinib),和,N-4-(3-,溴苯,),胺,-6-,喹唑啉,-2-,丁胺,(EKI-785),4.BCRP/Bcrp1,组织分布,在人的胎盘中，,BCRP,m,RNA,表达非常高，而在鼠类胎盘相对弱。,相反，在小鼠的肾脏表达最高，而在人的肾脏表达低表达。,BCRP,在胎盘合胞体滋养层膜的母体侧、在肝细胞的胆管侧、肠的腔面侧膜，与,MDR1 P-GP,的定位相似。,BCRP,也存在与乳腺的小叶和排泄管的顶侧面。,BCRP,高表达于鼠原始造血干细胞中。分化的造血干细胞系中，几乎不表达但前红细胞和自然杀伤淋巴细胞可以表达,Bcrp1,。,在人中，,BCRP,表达与鼠相类似，在干细胞中有较高的表达，而在起源细胞表达降低，只有在自然杀伤细胞和成红血球细胞表达，而在其他分化的细胞中没有表达,BCRP,在脑血管内皮细胞高度表达,表达量高于,MDR,和,MRP1,.,3.BCRP/Bcrp1,药理生理作用,1,）,BCRP,分布与,P-GP,有重叠性,提示,BCRP/Bcrp1,的作用类似,P-GP,。,2,）保护机制,阻止从胃肠吸收毒物吸收,促进排泄,脱镁叶绿,(,甲酯,-),酸,A,（,PHA,）,是,叶绿素一种降解产物,，,为一种光毒性成分。,PHA,在体内外排转运是,BCRP,介导的，为,ABCG2,的特异性底物。,一项研究显示,Bcrp1,/,小鼠对的,PHA,光毒敏感性是的,野生鼠,100,倍以上，在敏感性增加的同时，伴随随高的血药浓度。与正常食物比较，喂养含,PHA,或含,20%,紫花苜蓿食物后，血药浓度分别增加,17,和,24,倍，而野生鼠喂养任何食物，血浆中,PHA,浓度都在检测浓度以下,.,3,）,血脑屏障的重要组成部分之一。,与野生型鼠比较,mdr1a,缺陷小鼠和野生型小鼠,长春碱脑摄取增加,2,倍,但哌唑嗪摄取不变不影响,丝裂霉素的摄取反而有所降低。,合用,GF120918,使哌唑嗪和丝裂霉素转运增加,2.1,和,3,倍,但,GF120918,不影响长春碱的转运。,在野生型鼠，,PSC833,增加长春碱的脑摄取,但不影响和丝裂霉素的摄取。,合用,GF120918,使哌唑嗪和丝裂霉素摄取分别增加,1.5,和,2,倍,GF120918,也使长春碱的摄取增加。,abcg2,mRNA,主要在脑微血管中表达，约是皮层的,700,倍。,（,4,）在,骨髓细胞的,“,傍细胞群,”,（,side population,，,SP,）中作用,。,从骨髓中分离到一类细胞,，,这类细胞用,Hoechst 33342,染色，结合双波长荧光显示浅红色和浅蓝色荧光，用维拉帕米预处理，浅着色细胞消失。这类细胞称之为傍细胞群。,？浅着色提示,细胞内,Hoechst 33342,浓度低，研究显示在,SP,细胞中表有,BCRP/Bcrp1,，促进,Hoechst 33342,外排所致,.,S,P,中富含未分化的干细胞，而在分化的干细胞系中,BCRP/Bcrp1,表达低或缺乏。,类似,SP,也出现在骨骼肌和胚胎等其他组织干细胞,伴随,Bcrp1,的高表达,.,BCRP/,Bcrp1,高表达可能是各种干细胞的一般特性,.,功能,？,ABCG2,基因缺陷引起骨髓中和骨骼肌中,SP,细胞数降低,，用转染,BCRP,（,-/-,）骨髓细胞移植小鼠内导致细胞再注入（,repopulation,）能力,降低,，,造血细胞对丝裂霉素,敏感性增加,与正常小鼠比较，,Mdr1a/1b,和,Bcrp1,缺陷小鼠研究的各种造血功能正常，在,SP,几乎消失,.,血祖先细胞对丝列霉素的敏感性增加。,用,Bcrp+/+,和,Bcrp-/-,小鼠祖先细胞研究显示，在正常氧功能条件下，两种细胞的克隆数相同，但缺氧条件下，,Bcrp-/-,小鼠祖先细胞的克隆数下降。阻断,BCRP,功能显著降低,Bcrp+/+,在缺氧条件下的生存力,。,ABCG2,mNRA,在造血干细胞,（,SP,34+/38-.34+/KDD+,细胞群,）,中表达高,，,而在定向分化的祖细胞,（,34+/33+,34+/10+,）,中表达,显著下降。在大多数成熟细胞中,表达低,但在自然杀伤细胞和成红血球细胞表达高。ABCG2,可能对造血干细胞中,SP,形成起重要的贡献。,在定向分化阶段，,ABCG2,下调，暗示该基因可能在多能干细胞方面有独特的生理功能,.,P-GP,MRP1,和,MRP 2,的协同转运,1,.协同转运,许多,ABC,载体能同时转运多种不同底物，可能存在协同转运，增加转运效率。,MRP1,转运长春新碱和依托甙需要还原型,GSH,参与。,GSH,促进,MRP1,依赖性的依托甙或长春新碱转运，长春新碱和依托甙也刺激,MRP1-,依赖性的,GSH.,用转染的,MRP2,的,Sf9,细胞膜囊摄取试验显示,不同物质对,MRP2,转运雌二醇,-17-,-,葡萄糖醛酸甙作用不同，,4,种类型：,1)刺激摄取,sulfanitran,pantoprazole,奥米拉唑,laneoprazole,丙磺舒、,squinavir,醋氨酚,-,葡萄糖醛酸甙,青霉素,G;,2,）,低浓度刺激转运,，,高浓度刺激作用降低,利尿磺胺,，,苯磺唑酮,，,吲哚美辛,，,glibenclamide,牛磺胆酸和甘胆酸,；,3,）,抑制摄取,GSSG,GS-DNP,4,),无影响,MTX,和,GSH,。,P-GP,介导的转运有类似的现象。,P-GP,有两个不同的正相协同的结合点和转运点。一个倾向于模型底物,Hoechst 33342,，另一个倾向于,罗丹明,123,。,一些化合物,(,不是所有的,),根据他们的刺激,罗丹明,123,转运和抑制,Hoechst,转运能力大小归为,Hoechst(,“,H,”,),类或,罗丹明,(,“,R,”,),类。,BQ102,促进,P-GP,转运柔红霉素和阿霉素,这种促进可以被维拉帕米抑制。对不同的底物作用不同,由于,BQ102,促进物质转运,降低细胞对某些底物的毒性。,图,维拉帕米抑制,QB102,促进细胞外排罗丹明,123,作用,.,(,a,),维拉帕米对抗,QB102-,介导细胞内罗丹明,123,浓度降低,.,(b),罗丹明,123,消失曲线,QB102,对细胞对不同,P-GP,底物的敏感性的影响,.KB8-5-11,细胞在有,10,mol/l,或没有,QB102,存在情况下,与受试药物工培养,3,天,测定,IC,50,.,结果为,IC,50,变化情况,意义,化合物间交叉刺激或抑制有时是很复杂的,药物转运刺激程度有时相当大。当刺激剂同时服用时,由于促进药物转运，可能会改变相应药物的药理作用，尤其是药物在肠上皮、血脑屏障、胎盘屏障上的转运。因此研究是否存在交叉激活现象很有意义，一方面肠中,MRP2、P-GP,的转运激活，可能导致药物的口服利用度降低，从而降低疗效，另一方面促进有毒物质的排泄。,