培养基及配制.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,培养基,种类,成分,配制,技术,一、培养基,培养基的成分,3,碳源和能源,4,植物激素,1,无机盐,2,有机物,5,琼脂,6,辅助物质,1,无 机 盐,元素名称 添加形式,N KNO,3,NH,4,NO,3,大量,P KH,2,PO,4,NaH,2,PO,4,元素,K KCl KNO3,(0.5mmol/L),Ca CaCl,2,2H,2,O,Mg Mg,2,SO,4,7H,2,O,S,Fe FeNa,2,-EDTA,微量,B H,3,BO,3,元素,Mn MnSO,4,(0.5mmol/L),Cu CuSO,4,Mo Na2MoO4 2H,2,O,Cl CaCl,2,2H,2,O,1,）大量元素,N,是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。,P,是磷脂的主要成分。培养基中常用,KH,2,PO,4,NaH,2,PO,4,等。,K,对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。,Mg,、,S,、,Ca,是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；,S,是含,S,氨基酸的蛋白质的组成成分。,Ca,是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，,Ca,及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。,2,）微量元素,在微量元素中，,铁,的使用最大，铁是一些氧化酶的组成成分。同时又是叶绿素形成的必要条件。,由于培养基的,pH,较高，所以培养中几乎都使用不易分解的乙二胺四乙酸铁这种鳌合物来防止铁的沉淀。,硼,与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系；,铜,是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长；,锰,参与植物的光合、呼吸代谢；,钼,参与氮素的代谢；,氯,是光合作用水光解的活化剂。,微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。,No MS salts,没有任何生长特征,MS salts 0.47 g.l,-1,长出更多的根,MS salts 9.52 g.l,-1,长大量的再生苗而无根,*,愈伤组织缺无机营养表现症,状,N-,某些愈伤组织出现花青甙，没有导管形成,N,、,P,或,K-,细胞过度增大且形成层减少,S-,愈伤组织非常明显褪绿,Fe-,细胞分裂停止,B-,细胞分裂和细胞伸长迟缓,Mg,和,Mn-,影响细胞伸长,2,有,机,物,2.1,维生素,2.2,肌 醇,2.4,氨基酸,2.3,天然复合物,种类：,硫胺素,-,维生素,B1 VB,1,吡哆素,-,维生素,B6 VB,6,烟 酸,-,维生素,B3 Vpp,抗坏血酸,-,维生素,C Vc,以及,B5,、生物素、叶酸。,浓度：,0.1,1.0mg/L,作用：,VB,1,促愈伤组织产生，提高活力,VB,6,促根生长,Vpp,与代谢和胚发育有关,Vc,防组织褐变,2.1,维生素,2.2,肌醇,促进愈伤组织生长、胚状体和芽的形成,对组织细胞繁殖、分化的促进作用,浓度,100 mg/L,2,有,机,物,2.1,维生素,2.2,肌 醇,2.4,氨基酸,2.3,天然复合物,椰乳：,促愈伤组织和细胞培养，用量,10,20%,。使用注意茎尖大小。,2.3,天然复合物,香蕉泥：,对,pH,值缓冲大，用量,150,200ml/L,，应用在兰花组培。,水解酪,(,乳,),蛋白：,浓度,100-200mg/L,，多用于微茎尖培养。,天然复合物,马铃薯提取液：,对,pH,值缓冲大，用量,150-200g/L,，使苗壮。,其它：,2.4,氨基酸,种类：甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸以及酰胺类物质（如天门冬酰胺）和多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。,注意：氨基酸类物质只有在含有无机氮的情况下，对离体组织生长才有较好的效果。,培养基的成分,第一节,3,碳源和能源,4,植物激素,1,无机盐,2,有机物,5,琼脂,6,辅助物质,3,碳源和能源,种类：蔗糖或葡萄糖、果糖、砂糖等。,蔗糖浓度：,1-5%,，胚培养为,4-15%,。,注意：,高压灭菌部分糖会分解。,大生产时可用白砂糖。,作用：,作为离体组织赖以生长的碳源使培养基维持一定的渗透压（一般在,1.5-4.1MPa,）,蔗糖（,0%,）,蔗糖含量（,1蔗糖含量,（,5%,）,在外植体上既没有芽发生，也没有根和愈伤组织产生,在外植体上表面边缘产生芽，也有一些根发生,芽从外植体的上表面发生而根从下表面发生,4,植物激素,4.1.,生长素类,（,1,）种类,IBA,吲哚丁酸；,IAA,吲哚乙酸；,NAA,萘乙酸；,2,4-D-2,4-,二氯苯氧乙酸,使用效价：,IAAIBANAA2,4-D,NAA,、,IBA ,生根培养,2,4-D ,愈伤组织诱导与增殖,（,2,）作用,诱导愈伤组织和根分化，促进细胞分裂和伸长。,NAA,和,IBA,常与细胞分裂素结合用于芽的增殖。,（,3,）浓度,0.05,5mg/L,（,4,）,配制,生长素可溶解在稀NaOH,中或溶于乙醇。,4.2,细胞分裂素（,CTK,）,（,1,）种类：,Kt-,激动素,BAP-,苄氨基嘌呤,2,iP-,异戊烯腺嘌呤,ZT-,玉米素,TDZ,（,2,）作用：,启动脱分化、细胞增殖，诱导愈伤组织芽分化、芽增殖，丛生芽。,（,3,）浓度：,0.05,10.0mg/L,（,4,）,配制：,溶于稀酸或稀碱,激素配比模式,生长素与细胞分裂素：,它们的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。,高：有利于根的形成和愈伤组织的形成；,适中：有利于根芽的分化；,低：有利于芽的形成,生长素,细胞分裂素,=,如：为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。,细胞分裂素与生长素对器官或愈伤组织的影响,No BAP,BAP 0.1 mg.l,-1,No NAA,Poor shoot development and no roots.Extensive callus generation,Poor shoot development and no roots,NAA 0.1 mg.l,-1,More balanced development of roots and shoots.However,undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,Profuse development of roots and a reduced number of shoots.Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,NAA 5.0 mg.l,-1,Profuse development of roots over the explant upper and lower surface,and few shoots.Some callus,4.3,赤霉素（,GAs,）,（,1,）种类：,GA3,（,2,）作用：,促茎伸长，促胚发育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入。,注意：,不耐热；,生理活性,5,15d,，时间太长有抑制作用。,较生长素和细胞分裂素少用，可溶于水。,ABA,因物种不同，能促进或抑制愈伤组织生长；,5,琼脂,/,培养体支持材料,5.1.,琼脂,(1),用量,6,10g/L,(2),种类,琼脂粉 琼脂条,(3),作用,固化作用,注意：,琼脂使用有优缺点；新买应试凝固力。,不凝原因：,pH5,不凝；长时间高压灭菌；,长期存放，易变质；厂家不同，杂质含量不同,配制时融解不充分，分装不均匀；,5.2.,其它,玻璃纤维滤纸桥海绵、卡拉胶等,6,辅助性物质,6.3,抗生素,6.2,抗氧化物,6.1,活性炭,6.1,活性炭,1),作用：具吸附作用；,茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增殖（浓度,0.1-0.2%,）；,促进生根,根避光生长；,防止组培苗玻璃化（浓度,0.3%,）；,有利于胚胎培养。,2),常用浓度：,0.5,10g/L,3),注意：活性炭具副作用。选择吸附性差，导致营养损耗和,pH,，应适当调高营养物质与激素水平，并加大,Agar,用量。,6.2,抗生素,用量：用量,520mg/L,注意：抗生素对组织生长有抑制作用，使用要慎重。,多数需过滤灭菌,。,作用：,抑制内生菌；,种类：,青霉素、链霉素、庆大霉素、利福平、卡那霉素等，,6.3,抗氧化物,2),用量：,50,200mg/L,，,3),作用：,防止氧化,4),注意：,可用抗氧化剂洗涤外植体伤口表面。,1),常用抗氧化剂：,半胱氨酸、,V,C,6.4,其它成分：,AgNO,3,：,作用：,吸附乙烯，促进茎芽分化，防玻璃化苗、早衰、落叶；只能短期培养，,用量,110mg/L,，,需过滤灭菌,pH,值,在灭菌之前培养基的,pH,值一般都是调节到,5.0-6.0,。,一般来说，当,pH,值高于,6.0,时培养基将会变硬；,低于,5.0,时，琼脂不能很好地凝固。,pH,值对不同植物的影响会有差异，如玉米胚乳愈伤组织在,pH,值,7.0,时鲜重增加最快，在,pH,值,6.1,时干重增长最快。,种类,最适,pH,值,种类,最适,pH,值,杜鹃,4.0,月季,5.8,越桔4.5,胡萝卜、石刁柏,6.0,蚕豆,5.5,桃,7.0,番茄,5.7,不同植物对培养基最适,pH,值的要求不同,(,见表,),二、培养基的制备,1,水和药品,水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。,配制培养基母液时要用,蒸馏水或重蒸馏水,，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。,大规模生产时可用自来水。,但研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。,药品：,应选取等级较高的化学纯（,CP,）或分析纯,(AR),；,药品的称量一定要准确、正确，防止药勺之间的交叉污染。,2.1,母液（贮备液，,stock solution),配制的目的,1,）方便配置其他培养基；,2,）保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取,3,）,便于低温保藏。,2.2,母液配制方法,（,1,）单配法：,将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。,（,2,）混配法：,将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液,.,2,培养基母液的配制和保存,（,3,）一般原则：,一般母液配成比所需浓度高,10-1000,倍。,母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起,配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如,Ca,2+,和SO,4,2-,，,Ca,2+,、,Mg,2+,和,PO,4,3-,一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。,各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。,母液配好后放冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。,（,4,）母液配制的药品与器材,1,）药品,：,配制,MS,培养基所需的药品、生长调节物质、蒸馏水、,1mol/L,的,NaOH,，,1mol/L,的,HCl,2,）器材：,各类天平、烧杯、容量瓶、量筒、,母液瓶、标签、冰箱等。,（,5,）母液配制（以,MS,培养基为例）,有机物母液,铁盐母液,无机大量 母液,无机微量母液,激素母液,配制,MS,培养基时母液的计算,A,无机大量母液,(,扩大,10,倍配,1L),成 分,硝酸钾硝酸铵,硫酸镁磷酸二氢钾,氯化钙,称量工具,托盘天平,百分电子天平,注意,：,无机大量母液中的各种物质在混合过程中有些离子易产生沉淀，应使每种物质先充分溶解，再进行混合，而且钙盐最后缓慢加入进去。,硼酸，硫酸铜，,硫酸锰，硫酸锌，,氯化钴，钼酸钠，,碘化钾,万分电子天平,B,无机微量母液（扩大,100,倍配,1000ml,）,称量工具,成分,C,铁盐（扩大,100,倍,1000ml,）,铁盐,硫酸亚铁，,Na,2,-EDTA,注意：,铁盐选用硫酸亚铁而不用硫酸铁，是因为它溶解后易产生红色的氢氧化铁沉淀。,在装有,800ml,蒸馏水的烧杯中加入2粒氢氧化钠。溶解后加入3.73,g EDTA-Na,2,，,加热使其全部溶解，然后边搅拌边慢慢加入2.78,g FeSO,4,.7H,2,O,直至全部溶解，冷却后定容至,1000ml，,置于冰箱中备用。,D,有机物（扩大,50,倍,500ml,）,有机物,甘氨酸,VB1,VB6,烟酸,肌醇,注意：,有机物中的物质均采用电子天平称取。,E,激素母液（常用的）,生长素,NAA,，,IBA,，,2,4-D,，,IAA,细胞分裂素,6-BA,，,KT,，,GA,，,ZT,注意：,这些激素配制时，一般配成,0.2-1mg/ml,，,NAA,、,IBA,、,IAA,一般可先用少量无水乙醇助溶。,2,4-D也可用,0.1mol,L,的,NaOH,或,KOH,助溶，细胞分裂素类一般先用少量,0.1mol,L,盐酸溶解,后，再加入温水冷却后定容。,(6),母液的保存,1),装瓶,:,将配制好的母液分别倒入瓶中，贴好标签，在标签上注明母液名称，配制倍数，与配制日期。,2,）储藏,：,母液配好后放人冰箱内,4,低温保存，用时再按比例稀释。,3,培养基的配制,1),用具器材：,粗天平、塑料量杯、烧杯、量筒、移液管、三角瓶、玻璃棒、药勺、,pH,试纸（,5.4-9.0,）,/,酸度计、橡皮吸球、吸水纸、羊皮纸等。,2),药品试剂：,蒸馏水、蔗糖、琼脂、,1mol/L NaOH,、,1mol/L HCl,、各种培养基母液,3.1,实验用品,3.2,培养基配制（以,1L,百合继代培养基为例）,1),培养基配方：,MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+3%,蔗糖,+0.8%,琼脂,2),配方成分计算：,大量元素（,扩大,10,倍配,1L,）,微量元素,（扩大,100,倍配,1000ml,）,有机物,（扩大,50,倍配,500ml,）,铁盐,（扩大,100,倍配,1000ml,）,6-BA(0.5mg/ml),NAA(0.1mg/ml),蔗糖,琼脂,100ml,10ml,10ml,10ml,3ml,2ml,30g,8g,母液的稀释计算,吸取量,=,需要配制培养基的体积,X,需要配制浓度,母液浓度,3),配制步骤,其他准备,加琼脂,第三节 常用培养基的配方及其特点,1,培养基的种类,1.1,根据其态相不同分为,固体培养基：,是指加凝固剂（如琼脂）的培养基。,液体培养基：,是指不加凝固剂的培养基。,1.2,根据培养物的培养过程分为,初代培养基：,是指用来第一次接种从植物体上分离,下来的外植体的培养基。,继代培养基：,是指用来接种继初代培养之后的培养,物的培养基。,1.3,根据其作用不同分为,诱导培养基、增殖培养基、生根培养基,1.4,根据其营养水平不同分为,基本培养基：,主要有,MS,、,White,、,B5,、,N6,、改良,MS,、,Heller,、,Nitsh,、,Miller,、,SH,等,完全培养基：,就是在基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如植物生长调节物质和其它复杂有机附加物等。,下面介绍几种基本培养基,:,基本培养基,无机盐、离子 浓度高，含高,K,、,N,，硝酸盐含量较高，含铵盐。,营养丰富,加速合作愈伤组织和培养物生长,1962,年由,Murashige,和,Skoog,为培养烟草细胞而设计的。广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的,。,MS,培养基,Miller,培养基,B,5,培养基,SH,培养基,N,6,培养基,KM-8P,培养基,White,培养基,基本培养基,无机元素用量是MS,的,1/3,1/2,微量种类少,无肌醇,MS,培养基,Miller,培养基,B,5,培养基,SH,培养基,N,6,培养基,KM-8P,培养基,White,培养基,基本培养基,无机盐量较低,使用广泛,适合生根培养、胚,胎培养等,提高了,MgSO4,的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。,MS,培养基,Miller,培养基,White,培养基,SH,培养基,B,5,培养基,N,6,培养基,KM-8P,培养基,基本培养基,含较低的铵，硝酸盐和盐酸硫胺素用量较高。,适合双子叶植物，尤其木本植物组培,。,1968,年由,Galmborg,等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在,B5,培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。,MS,培养基,Miller,培养基,SH,培养基,B,5,培养基,N,6,培养基,KM-8P,培养基,White,培养基,基本培养基,特点与,B5,相似，硫酸铵改用磷酸二氢铵。,无机盐浓度较高。,MS,培养基,Miller,培养基,SH,培养基,B,5,培养基,N,6,培养基,KM-8P,培养基,White,培养基,基本培养基,成分简单,硝酸钾和硫酸铵含量高,适合花粉、花药培养,1974,年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，,KNO3和（,NH4,）,2SO4,含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。,MS,培养基,Miller,培养基,SH,培养基,B,5,培养基,N,6,培养基,KM-8P,培养基,White,培养基,基本培养基,有机成分复杂,用于原生质体培养,(,包括原生质融合的培养,),是,1974,年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。,MS,培养基,Miller,培养基,SH,培养基,B,5,培养基,N,6,培养基,KM-8P,培养基,White,培养基,依培养基配方中含盐量多少可将目前培养基分为,4,类：,*,含盐量较大的培养基,，如,MS,培养基以及改良的,MS,培养基，含较高浓度的硝酸盐、铵盐和钾盐，微量元素非常全，,LS,、,BL,、,ER,培养基也属于。,*,硝酸钾含量较高的培养基,，,如,B5,、,N6,、,SH,，盐浓度也很高，其中,NH,+4,和,PO,-3,4,是由,NH,4,H,2,PO,4,提供。,*,含盐量中等的培养基,，,如,H,培养基，大量元素为,MS,的,1/2,，微量元素种类减少，但含量增加，维生素种类比,MS,的多，,*低,盐浓度的培养基,，,White,，,WS,和,HE,培养基。,以上,4,种类培养基中，前两种培养基较适合,愈伤组织诱导和细胞培养,，但选用那类培养基，还应依植物种类、基因型、外植体等而定；,后两类培养基则有利于,根的形成,。,诱导愈伤组织常用的培养基为,MS,和,B5,。,高盐浓度的培养基可能对培养过程中愈伤组织数量及鲜重增加有益。,