流式细胞仪BD-FACSCanto-II.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,流式细胞仪背景知识,1,总览,流式细胞术基本知识,流式细胞仪的组成,数据采集与分析,2,流式细胞技术是什么？,流式细胞术,在流动的状态中检测细胞或颗粒的各项特性,特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析,可检测的样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，实体组织，培养细胞，微生物,Flow Cytometry,Flow:Fluid Cyto:Cell Metry:Measurement,3,流式细胞术检测样本0.4um,40um,4,流式细胞术检测指标,流式细胞术提供的信息：,-,相对细胞大小,-,相对细胞颗粒密度和内部复杂度,-,染色过细胞的相对荧光强度,5,细胞结构,细胞大小,细胞粒度,DNA,含量与细胞周期,RNA,含量,蛋白质含量,染色体分析,细胞功能,细胞表面,/,胞浆,/,核的特异性抗原,细胞活性,细胞内细胞因子,酶活性,激素结合位点,细胞受体,细胞凋亡,在上述信号基础上的细胞分选,流式细胞术的应用,6,流式细胞仪组成,液流系统：形成层流系统，聚焦细胞,光学系统：产生和收集光学信号,电子系统：光信号转化为电信号，进行信号处理,7,Fluidics Diagram,Sheath Flow,sheath tank,Sample Flow,sheath,interior reservoir,waste,interior reservoir,sheath filter,sample injection,tube(SIT),test tube,or plate,flow cell,interrogation point,bubble filter,waste tank,8,液流系统,9,光学系统,激发光学系统包括,:,-,激光器,-,透镜和反射镜，将激光引导到检测区域,收集光学系统包括,:,滤光片，将产生的光信号引导到对应的光学接收器,10,11,12,光学系统,13,14,光学系统,-,滤光片,460 500 540,460 500 540,460 500 540,SP 500,LP 500,BP500/50,LongpassShortpassBandpass,15,16,17,电子系统,Laser,Laser,Laser,Time,Voltage,Time,Voltage,Time,Voltage,18,电子系统,19,电子系统,20,Review,悬浮状态的细胞,单个流过流动室,细胞被激发,产生散射光和荧光 信号,信号被采集,转换成数字信号,存储于电脑上,液流系统,光学系统,电子系统,21,回顾,流式细胞仪的三大组成部分？,滤光片,LP600,代表什么意思？,BP400/40,呢？,22,数据采集,三种数据：,-,前向散射光,FSC,-,侧向散射光,SSC,-,各种荧光散射光,FL1,，,FL2,，,FL3,，,FL4,23,当使用激光光源时，在前向方向（和激光行进的方向相同）上可用,前向散射光接收通道,接收到一定量的散射光,前向散射光的强度是和细胞或其他检测颗粒的大小、形状密切相关的,数据采集,-,前向散射光,24,当激光光源被使用时，侧向也有一定量的散射光产生，,可以用,90,o,角的侧向散射光检测通道,来采集,侧向散射光的强度和细胞或其他检测颗粒的颗粒密度、内部复杂程度密切相关,数据采集,-,侧向散射光,25,外周全血细胞散射光双参数点图,颗粒杂质、气泡,对检测的影响,26,细胞标记上荧光物质后，这种荧光物质要求特定波长的激发光来激发，同时发出特定波长的光,荧光物质被激发以后产生的发射光将由特定的荧光通道来接收,特定检测是通过光学滤片和透镜来控制的,数据采集,-,荧光信号,荧光强度是和细胞上标记上的荧光染料的量正相关,27,数据采集,28,电压,信号放大方式：,log,、,lin,信号类型：,A,W,H,电压的调节,:,根据阴性对照管来调节,29,阈值,可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值,大多数样本都可以设定,FSC/SSC,阈值以下的信号不存储,根据阴性对照管来调节,目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号,30,31,32,补偿,补偿方式：任意两个通道之间，可以采用手动或自动补偿。,补偿的调节,:,根据单染对照管来调节,33,34,35,36,37,38,1.)Compensation-Too Little;Too Much,39,2,.),Basic Principles of Compensation-,%Compensation is independent of fluorescence intensity,40,3,.)Compensation-,Too Dim,Too Bright Compensation Controls,Small errors in compensation of a dim control(A),can result in large compensation errors with bright reagents(B&C).,41,数据分析,流式数据,直方图,散点图,等高线图,密度图,三维图,统计数据,42,直方图,直方图,(Distribution Histogram),横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度,，单位是对数，可以是线性或对数坐标。,纵坐标一般是细胞数。,43,散点图,散点图,(Dot Plot),X,坐标为该细胞一参数相对含量，,Y,坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。,44,等高线图和密度图,45,三维图,46,统计数据,Events,百分比,平均荧光强度,荧光中位值,CV,SD,47,数据获取与分析,电压,阈值,补偿,获得数据,画图,设门,统计,48,Thanks!,49,