流式细胞术在肿瘤学中的应用(课堂PPT).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,流式细胞术在肿瘤学中的应用,贵阳医学院附属医院中心实验室,马莉,1,什么是流式细胞仪？（,Flow Cytometer,FCM),在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器,Injector,Tip,Fluorescence,signals,Focused laser,beam,Sheath,fluid,2,流式细胞术,流式细胞术是应用流式细胞仪对悬浮液中的细胞或细胞器进行快速测量和多参数检测的细胞分析技术，是上世纪,70,年代在单细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞理化特性，诸如大小、,DNA,、RNA,、蛋白质、抗原等进行快速测量并分类收集的高科技技术。它综合了激光技术，计算机技术，流体力学，细胞化学，单克隆抗体，荧光化学，分子生物学等各门学科，在对细胞群体的亚群进行定量分析时，具有其它手段无法比拟的优越性。,3,流式细胞仪特点及检测标本,特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析；,可检测的样本种类多样,(1),外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞,(2),血清、血浆、培养上清、细胞裂解液,4,细胞周期及,DNA,倍体分析在临床肿瘤中应用,免疫指标检测在临床肿瘤中应用,监测癌基因与抗癌基因表达在肿瘤发生发展中的作用,监测分析肿瘤多药耐药,细胞凋亡,5,流式细胞周期与,DNA,倍体分析的基本原理,通过,DNA,检测进行细胞周期分析,细胞周期：,G0,、,G1,、,S,、,G2,、,M,细胞周期中,DNA,含量：,G0/G1-2C,（二倍体）,S,期,-2C,4C,、,G2/M-4C,（四倍体）,6,7,DNA,荧光染料特异性与细胞,DNA,结合,DNA,含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度与,DNA,所吸收荧光分子多少成正比。,最常用的荧光染料：碘化丙啶（,PI,）,FCM,分析细胞周期的基本方法,8,DNA,含量的表示,细胞群的,DNA,含量在,FCM,中一般以,DNA,指数（,DNA index,，,DI),表示相对含量，一个正常的二倍体细胞峰，其,G0/G1,期细胞,DNA,含量为,2C,，,DI,值为,1.0,。,DI=,（样本,G0/G1,期细胞峰平均荧光道数）,/,（正常二倍体标准细胞,G0/G1,期细胞峰平均荧光道数）,9,DNA,倍体的判定标准,二倍体的,DI,为,1.0,，四倍体的,DI,为,2.0,。,变异系数（,CV,）：标准细胞,CV,3%,，,新鲜组织标本,5%,。,DNA,倍体判定标准，,DNA,非整倍体具有,2,个分离的,G0/G1,峰，并根据,DI,值判断,DNA,倍体。,10,对于一个正常人体的二倍体细胞群，,G0/G1,期占,85-90%,以上，,S+G2M,细胞占,10-15%,以下。,11,12,13,14,以二倍体参考细胞,G0/G1,期细胞,DNA,含量定为,2C,值,DI=1.0,，基于标准二倍体细胞的,CV,在,5%,以下，判定标准即；,DNA,二倍体,=2C+2CV,，,DNA,异倍体不等于,2C+2CV,。,1.DI=1.0,0.1(0.91.10),为二倍体。,2.DI=1.0,0.15(0.851.15),为近二倍体。,3.DI=2.0,0.1(1.902.10),为四倍体。,4.DI 2.10,为多倍体,5.,其余,DI,均为异倍体。,15,16,17,18,19,20,流式细胞周期与,DNA,倍体的分析方法,（一）单细胞悬液制备,1,、新鲜或冰冻实体组织：酶消化法、,机械法,、化学试剂处理法等。,剪碎法：取新鲜或冰冻（浸泡于生理盐水中）实体组织,0.5cm,3,，眼科手术剪剪碎，加入生理盐水，,300,目尼龙膜过滤，,200g,离心,5min,，生理盐水洗涤二次。,21,半自动机械法单细胞制备系统：是目前较为理想的方法，简便，实用，单细胞获取率较高，特别适用于临床应用。,22,由于各种实体组织成份、特性各不相同，对不同的实体组织必须采用不同的单细胞分散方法，才能使单细胞产量高，细胞损伤小。,23,新鲜组织单细胞悬液制备注意事项：,手术或活检的新鲜组织及时浸泡于生理盐水。,立即送检,冷冻或冷藏。（室温过高，放置时间过长而造成组织自溶发生，影响检测结果）24,25,26,27,28,29,30,2,、石蜡包埋组织：扩大了,FCM,分析应用范围，并可以对大量临床随访病例资料进行重新研究与利用。标体制备：,二甲苯脱蜡法,组织清洁剂脱蜡法,甲酸双氧水处理法。,注意事项：,脱蜡完全：检验方法 加入,100%,乙醇，如果无絮状物浮起，即可视为脱净，反之则没有脱净。,掌握消化时间，避免细胞核消化掉。,切片薄厚适宜，过薄碎片大多，过厚不宜脱蜡。,31,32,33,34,35,3,、骨髓、血液及体液：去除红细胞及浓缩有核细胞。,骨髓及血液：淋巴细胞分离液,体液：一般需经,300g,离心,5min,，,PBS,洗涤二次。如体液中红细胞太多，可用溶血素去除红细胞。,注意事项：,每次同时制备对照血液淋巴细胞标本，作为二倍体细胞外参标准。,视标本中有核细胞浓度的高低进行调整，一般细胞浓度调至,510*10,9,/L,。,36,（二）,DNA,染色及,FCM,分析,1,、,PI,染色法,应用,BD,公司,Cycle TEST IMK Kit,（,1,）单细胞悬液制备,（,2,）加入,A,液,250ul,，放置,10,分钟。,（,3,）加入,B,液,200ul,，放置,10,分钟。,（,4,）加入冷,C,液,200ul,，避光放入,2-8,C,冰箱,10,分钟。置,28,C,冰箱避光保存，,4h,内,FCM,检测,37,（,5,）流式细胞分析：流式细胞仪校准与设置、数据获取用,Cellquest,软件，,SSC/FSC,、,FL2,设置为线性放大，阈值设为,FL2,。,收集图：,FSC/SSC,和,FL2W/FL2A,散点图、,FL2-H,或,FL2-A,荧光直方图,数据分析：,ModFit,软件,38,流式细胞周期与,DNA,倍体分析在临床肿瘤学中应用,39,FCM,分析在肿瘤早期诊断和监别诊断中的应用,DNA,异倍体的出现是癌变的一个重要标志，有助于癌变的早期诊断。,淋巴瘤在病理形态学还不能作出诊断前，,FCM,倍体分析可以提供准确的诊断信息。,DNA,非整倍体的交界瘤应按恶性肿瘤对待。,形态学表现为良性的肿瘤出现非整倍体提示有恶变的可能。DI,可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标,40,FCM,分析,DNA,含量和,DNA,倍体的预后意义,通常认为,DNA,含量高，非整倍体的肿瘤恶性程度高，预后差，二倍体或近二倍体肿瘤预后好。,除,DI,及倍体外，反映肿瘤细胞增殖状态的,S,期细胞比例也被作为判断预后的指标。,41,FCM,分析在肿瘤脱落细胞学检查中的应用,FCM,分析诊断肿瘤细胞的标准：,(1),发现,DNA,非整倍体细胞峰诊断为癌。,(2),如无明显的非整倍体细胞峰，但有一个突出的四倍体细胞峰和,15%,的超二倍体细胞（,S,期细胞），并伴有,G0/G1,峰的,CV,9%,，,诊断为癌。,(3),无明显的非整倍体细胞峰，但,G0/G1,峰,CV,值增大，并伴有,10%15%,超二倍体细胞和一个突出的四倍体峰，诊断为可疑癌。,42,