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棕色蘑菇活性成分的初步研究

吴爽
( 天津农学院　农学系)
1 前言
棕色蘑菇( Agaricus brunnescens Peck) 俗称棕蘑,隶属于担子菌纲(Basidiomycotina) ,伞菌目(Agaricales), 蘑菇科(Agaricaceae) , 蘑菇属(Agaricus)。棕色蘑菇菌盖棕褐色,不会因褐变引起商品质量下降,又无需使用化学护色、 漂白剂处理,从而保证了食品的营养和安全;其子实体的营养、 口感和香味更接近于野生口蘑,受到欧美及世界发达国家和地区消费者的青睐,也是中国鲜食的优质蘑菇品种。
真菌多糖是从真菌子实体、 菌丝体、 发酵液中分离出的由10个分子以上的单糖经过糖苷键连接而成的高分子多聚物, 是一类能够控制细胞分裂分化、 调节细胞生长和衰老的活性多糖, 是当今医药和食品工业共同关注的焦点。国内外已从高等担子菌中筛选到200多种有生物活性的多糖物质, 当前市场上投放的真菌多糖类保健品已有上百种之多。真菌多糖在免疫功能的调节、 肿瘤的抑制、 抗衰老及调节血压、 血脂等方面都有着重要的作用。
1.1 真菌多糖的结构
真菌多糖的结构可分为一级结构、 二级结构、 三级结构和四级结构。一级结构包括糖基的组成、 排列顺序、 相邻糖基的连接方式、 异头物构型及糖链有无分支、 分支的位置与支链的长短等。真菌多糖的一级结构主链是均糖链, 主要有: ①葡聚糖( Glucan) , 以β( 1→3) 糖苷键连接为主, 兼有少量β( 1→4) 或其它糖苷键, 侧链是以β( 1→6) 或β( 1→3) 健合的葡萄糖低聚物。如香菇多糖( Lentinan) 、 裂褶菌多糖( schizophyllian Polysaccharide) 的一级结构都属于这种连接［1］。②甘露聚糖( Mannan) , 主要由α-糖苷键连接为主链, 如冬虫夏草多糖( Polysaccharide of Cordyceps Sinensis) 为α( 1→2) 糖苷键连接［2］, 银耳多糖( Tremella polysaccharide) 和黑木耳多糖( Auricularia auricular　polysaccharide) 为α( 1→3) 糖苷键连接［3］。二级结构指多糖骨架链间以氢键结合所形成的各种聚合体, 这只关系到多糖分子中主链的构象, 不涉及支链的空间排布［4］。三级结构是指由多糖的糖残基中的羟基、 羧基、 氨基及其它基团间经过非共价相互作用而形成的有序、 规则的空间构象。四级结构指多聚链间以非共价键结合形成的聚集体。
1. 2 真菌多糖的结构与生物活性的关系
1. 2. 1分子量大小对生物活性的影响
分子量大小是多糖具备生物活性的必要条件, 这可能与多糖分子形成的高级构型有关。多糖发挥生物学活性一般需要其分子质量在一定范围内: 多糖分子量越大, 分子体积越大, 不利于多糖跨越多重细胞膜障碍进入生物体内发挥生物学活性; 但分子量过低, 无法形成产生活性的聚合结构。高分子量的β( 1→3) -D-葡聚糖的高度有序结构( 三股螺旋) 对于调节免疫活性至关重要, 而只有分子量大于9.0×104的分子才能形成三股螺旋, 三股螺旋结构靠β-葡萄糖苷键的分支来稳定［5］。而且不同多糖产生生物学活性的最佳相对分子质量的范围不同。
一般认为, 分子量大于16kD时才有抗肿瘤活性。如分子量为16kD的虫草多糖有促进小鼠巨噬细胞吞噬作用的活性, 而分子量为12kD的虫草多糖就失去此活性［2］。分子量大于100kD且有三股螺旋的裂褶菌多糖具有较强的抗肿瘤活性, 而分子量小于50kD的裂褶菌多糖无任何生物活性。
1 .2. 2  主链连接方式对生物活性的影响
长期的实验表明, 在多糖骨架链上占优势的( 1→3) 连接的β-D-葡聚糖, 往往具有抗肿瘤活性［5］。小核菌多糖、 香菇多糖、 裂褶多糖都是该骨架的葡聚糖, 香菇多糖和裂褶菌多糖是被研究最多的具有免疫调节活性的β( 1→3) -D-葡聚糖, 两者均被用作免疫药理制剂。从香菇中分离的香菇多糖, 主链是β-( 1→3) -D-葡聚糖, 主链上约有23％的葡萄糖残基经过C-6分支点连有侧链［6］。从银耳中分离得到的银耳孢糖( TSP-2a～TSP-2c) , 其结构都是以( 1→3) -D-甘露聚糖为主链, 并在O-2、 O-4、 O-6位上有分支点, 它们都能刺激人外周单核细胞产生IL-1a、 IL-6、 IL-8的数量增加, 具有显著的免疫活性［3］。
1. 2. 3  分支度对生物活性的影响
支链的分支度( degree of branch, DB) , 是指平均每个糖单位所具有的分支数目。分支度大小与多糖生物活性关系并不是一种线性关系, 分支度适中的多糖往往具有较高的活性, 而分支度过大或过小都无法使多糖生物活性达到理想状态。具有生物活性的真菌多糖的分支度变化较大, 一般为0.02～0.75。研究结果表明, 只有分支度在0.2～0.33的那些β( 1→3) -D-葡聚糖才具有较强的生物活性［7］。如活性很强的香菇多糖和裂褶菌多糖仅在C-6上有分支, 分支度为0.33。DB为0.31～0.36的灰树花多糖、 DB为0.2的猪苓多糖均显示出较强的免疫活性。
1. 2 .4  支链及支链基团对生物活性的影响
支链的分支度和性质对β-( 1→3) -葡聚糖的免疫活性也有较大影响。支链分支度较高的β-( 1→3) -葡聚糖生物活性较强, 如冬虫夏草的胞外多糖CS-81002可促进巨噬细胞的吞噬功能, 不同程度的酸水解可使CS-81002的分子量下降, 分支减少, 并降低了对巨噬细胞的促进作用［2］。
经13C核磁共振谱分析推断, 连接在β-( 1→3) -D-葡聚糖骨架上的多羟基基团, 对抗肿瘤活性起重要作用。从黑木耳子实体中分离得到一种无生物活性的葡聚糖B, 对其进行过碘酸氧化、 硼氢还原及温和水解, 得到降解的水溶性多糖, 该多糖在其0-6上共价连接多元羟基, 显示出较强的生物活性, 具有很强的抑瘤活性［8］。
茯苓多糖是茯苓菌核的主要成分, 易溶于稀碱而不溶于水。主链是一种线性β-( 1→3) 糖苷键连接的葡聚糖, 支链由9～10个葡萄糖残基经过β-( 1→6) 糖苷键连接。该多糖基本没有抗癌作用, 但经过适当的溶剂处理使之转变成溶于水的多糖, 就具有了抗肿瘤活性。如用4mol／L的尿素溶液在70℃处理多糖4h, 其三级结构发生变化, 将其中的一些β-( 1→6) 支链用类似过碘酸氧化、 Smith降解的方法将其切去, 成为U一茯苓多糖后, 就获得了具有强烈抗肿瘤活性的多糖, 称为次茯苓多糖; 如果再将次茯苓多糖羧甲基化, 其活性就更高［9］。
1.3 真菌多糖的主要药理作用
1. 3. 1真菌多糖的抗肿瘤活性
许多真菌多糖都具有抗肿瘤活性。云芝多糖可有效地抑制S180肿瘤生长, 给小鼠灌胃, 口服500～1000mg／kg, 抑制率达31.96％～32.99％; 腹腔给药25mg／kg, 抑瘤率为34.85％。刘瑞等［12］研究显示, 用云芝多糖提取物( 800mg／kg) 灌胃给药7d, 可显著抑制皮下接种的鼠肝癌HepA细胞的生长, 抑瘤率达44.50％; 可提高血清中IgG的含量, 显著促进胸腺T淋巴细胞转化增生, 抑制小鼠肝内鼠抗人P53单克隆抗体、 鼠抗人VEGF单克隆抗体的表示, 具有显著的肿瘤抑制作用。云芝多糖是一种免疫调节剂和免疫增强剂, 它是经过调节和增强机体的免疫功能, 特别是增强T淋巴细胞的功能而发挥抗肿瘤作用的。
灵芝多糖能明显延长S180、 U14腹水型荷瘤小鼠生存期, 延长荷瘤小鼠的生命。灵芝多糖的抗肿瘤作用是由机体的免疫系统介导的。灵芝多糖在体内既可诱导巨噬细胞、 T细胞释放肿瘤坏死因子-α( TNF-α) 、 干扰素-γ( INF-γ) 等细胞因子, 抑制、 杀死肿瘤细胞; 也可经过树突状细胞( DC) 诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞( CTL) 活化, 进一步发挥细胞毒作用, 而这一作用与灵芝多糖明显促进CTL细胞的IFN-γmRNA转录及蛋白表示以及显著促进CTL中的颗粒酶B在基因转录和蛋白水平表示有关［13］。
1. 3. 2 真菌多糖的免疫调节作用
实验证明, 多数真菌多糖的抗肿瘤作用是作为生物反应调节剂, 经过增强宿主免疫调节功能即宿主介导抗肿瘤活性来实现的。真菌多糖可经过多条途径、 多个层面对免疫系统发挥调节作用。大量免疫实验证明, 食药用真菌多糖不但能激活T、 B淋巴细胞、 巨噬细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞, 还能活化补体, 促进细胞因子的生成, 对免疫系统发挥多方面的调节作用［14］。香菇多糖能够明显增加小鼠胸腺重量, 电镜下可见胸腺网状内皮细胞增生, 体积增大, 细胞中线粒体数目增多, 体积增大, 表明其功能旺盛, 说明香菇多糖能够增强细胞免疫; 香菇多糖对脾脏的重量无明显影响, 但电镜下可见脾脏中浆细胞数目增多, 以成熟浆细胞为主, 浆细胞中粗面内质网扩张呈泡状或环形, 腔内电子密度降低, 充满合成的抗体蛋白颗粒, 表明其功能十分旺盛, 证明香菇多糖也能够增强机体体液免疫［14］。
1. 3. 3 真菌多糖的降血糖作用
食用菌多糖降血糖的机制主要有4种［15］: ①促进胰岛素分泌, 增加血清胰岛素含量。注射虫草多糖( CSP-1) 连续一周后, 正常小鼠血糖水平显著降低, 高血糖小鼠的血清胰岛素水平显著性升高, 这提示CSP-1能刺激胰腺分泌胰岛素及降低胰岛素代谢。②改进胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是指机体对胰岛素产生抵抗, 因此组织不能正常利用葡萄糖, 而需要超常量胰岛素才能获得常量胰岛素的生理功能。黄志江等运用体外细胞培养法发现人工虫草多糖能促进胰岛素抵抗的脂肪细胞对葡萄糖的摄取水平, 并认为其降血糖作用与促进外周组织的葡萄糖代谢、 改进胰岛素抵抗有关。③加速肝葡萄糖代谢。香菇多糖就是经过调节糖代谢、 促进肝糖原合成、 减少肝糖原分解而起到降血糖、 改进糖耐量作用的。这主要表现为高低剂量组的香菇多糖都有明显的降血糖作用, 能明显改进高血糖大鼠的糖耐量, 提高肝糖原含量。④减少或减缓对葡萄糖的吸收。香菇多糖吸水性强, 它能在胃肠道内形成凝胶以调节小肠对葡萄糖的吸收及减缓葡萄糖向小肠绒毛膜的扩散, 因此香菇多糖具有调节血糖平衡、 改进糖耐量的作用。
真菌多糖除了以上生物活性外, 还具有抗氧化、 抗病毒、 抗疲劳、 抗辐射、 抗血栓、 抗凝血、 降血脂、 降血压、 改进记忆等作用。
1.4 真菌多糖的提取工艺
1. 4. 1  多糖的提取
真菌多糖按溶解性不同可分为几个种类, 如灵芝多糖种类很多, 有水溶性多糖、 水不溶性多糖、 酸性多糖和碱性多糖等［10］。提取的方法按提取溶剂的不同能够分为热水浸提法、 微波辅助热水浸提法、 酸提法、 碱提法、 有机溶剂提取法、 双酶提取法、 复合酶提取法、 超声波催化酶法等, 其中较常见的是水提法和碱提法。水溶性多糖可采用水提法, 即用水加热浸提, 将水提液过滤, 滤液浓缩, 然后边搅拌边加入4倍体积95％的乙醇, 待沉淀完全后过滤, 沉淀相经乙醇、 丙酮、 乙醚洗涤, 或经流水透析再冷冻干燥便可得到多糖粗制品。水不溶性多糖一般用酸或碱法提取, 常见试剂有三氯乙酸、 稀盐酸、 草酸铵、 氢氧化钠等。影响真菌多糖得率的因素很多, 如提取时间、 浸提比、 提取次数、 温度、 pH值、 溶剂和搅拌等都能影响真菌多糖得率。如香菇多糖的提取大多采用不同温度的水和稀碱溶液, 并尽量避免在过于酸性的条件下操作, 因为强酸性能引起糖苷键的断裂, 形成较多的单糖和低聚糖, 从而使还原糖含量升高和多糖含量下降［10］。
多糖总量测定采用苯酚-硫酸法、 蒽酮-硫酸法、 间接碘量法。最常见的方法是苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。本实验采用苯酚-硫酸法, 以获取最佳的提取工艺; 同时对棕色蘑菇中多糖的抗氧化活性进行初步研究。
2. 实验方法
2.1 实验材料
2.1.1 药材来源
班立桐老师提供的棕色菇。
2.1.2 实验仪器
JH754 紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司
LXJ-HB 离心机 上海安亭科学仪器厂
JY88-Ⅱ 超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司
电子天平 FA 中华人民共和国上海金科天平
2.1.3 实验试剂
①所需药品及溶剂: 葡萄糖、 EDTANa2、 FeSO4、 苯酚、 Tris、 、 邻苯三酚、 磷酸二氢钾、 无水乙醇、 丙酮、 三氯甲烷、 乙醚、 浓硫酸、 浓盐酸、 正丁醇、 H2O2、 乙酸乙酯等。
②显色液: 硫酸——苯酚显色液
2.1.4 实验器材
玻璃比色皿、 石英比色杯 试管、 三角瓶、 量筒、 移液管、 记号笔、 烧杯、 离心管、 试管架、 锥形瓶、 布氏漏斗、 玻璃棒等。
2.2 实验方法
2.2.1 真菌多糖的提取
2.2.1.1 药品预处理
用电子天平准确称取1g棕色菇, 进行研磨。
2.2.1.2 超声波破碎提取
准确称取苇蘑1g放入50mL的离心管中, 按适当料液比向离心管中加入一定体积蒸馏水, 在恒温水浴锅中以一定得温度加热5min, 然后放入超声波细胞粉碎机中超声提取。( 由于超声波细胞粉碎机不具备加热功能, 因此在超声过程中要每间隔5分钟对料液进行加热, 以便维持料液在恒定的温度[13]。) 超声处理一定时间后, 把离心管放入离心机中离心10min后取上清液; 再向离心管中加入等体积的蒸馏水, 充分混匀后再超声处理同样的时间, 然后离心取上层清液。两次清液合并, 并测量体积。
2.2.2 超声波破碎提取真菌多糖提取条件的优化
用正交试验对提取因素: 超声时间、 超声功率、 料液比、 超声温度进行优化。选用L1644正交表, 不考虑因素间的交互影响。因素——水平设计如表1

表1 正交试验的因素和水平
水平
A/料液比
B/超声时间(min)
C/超声温度( ℃)
D/超声功率( W)
1
1: 10
5
30
50
2
1: 20
15
50
100
3
1: 30
25
70
150
4
1: 40
35
90
200
2.2.3 硫酸——苯酚定糖法测定多糖含量[14]
2.2.3.1 配制显色液
配置5%苯酚溶液, 在电子天平上准确称取5g苯酚, 用100mL的容量瓶定容配成5%的苯酚溶液。( 溶剂为蒸馏水) ( 显色液的颜色为棕黄色)
2.2.3.2 显色温度的确定
分别吸取一定量的标准葡萄糖溶液样品, 分别置于4支比色管中。加水至2mL, 再加1mL5%苯酚和5mL硫酸, 摇匀后分别于0℃、 25℃、 50℃、 75℃、 100℃、 显色20分钟, 冷却后测吸光度, 结果上述温度下吸光度分别为: 0.543、 0.665、 0.584、 0.478、 0.432。在 25 ℃条件显色能够达到最大的吸光度, 因此测多糖含量时显色温度以25℃为最佳。
2.2.3.3 制作标准曲线
( 1) 在电子天平上准确称取葡萄糖0.1g, 用100mL的容量瓶定容配成1.0mg/mL的葡萄糖溶液。取1mL上述溶液定容至10mL, 即为0.1mg/mL的葡萄糖溶液。并分别稀释成0, 0.01, 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04mg/mL浓度梯度的葡萄糖作为基准物。
( 2) 每种浓度的葡萄糖溶液取1mL分别加入5mL显色液振荡混匀, 然后于25℃水浴中加热30min, 流水冷却后于754型分光光度计490nm处测光密度值。
( 3) 以葡萄糖浓度为纵坐标, 光密度值为横坐标作标准曲线。见表2
表2 葡萄糖标准曲线
项目
0
1
2
3
4
5
6
7
葡萄糖浓度( mg/mL)
0
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
显色液( mL)
5
5
5
5
5
5
5
5
吸光度(A)
0
0.1
0.142
0.192
0.246
0.278
0.320
0.380

图1 标准曲线图

2.2.4 清除超氧阴离子()能力的测定
2.2.4.1 试剂的配制
Tris-HCl缓冲液(pH=8.0, 50mmoL/L): 取Tris0.6lg, EDTANa2 0.037g用双蒸水溶解至98mL左右, 用HCI调节pH=7.90(用pH计校正)最后定容至l00mL。
HCI溶液(10mmoL/L): 取100µL浓盐酸定容至100mL即可。
邻苯三酚溶液(50 mmoL/L): 称取邻苯三酚0.063g, 用10 mmoL/L HCI溶液溶解, 定容至10mL, 避光, 冷冻保存。
2.2.4.2方法: 采用邻苯三酚法[38] 。
操作步骤: ①分别取10μl 浓度为10mg/mL 上述15种植物提取物样品10μl, 加入3ml PH为8.2的tris-Hcl缓冲液, 25℃水浴20min。②水浴结束时, 各样品管中加入7mmol/L的邻苯三酚溶液3ml, 反应4min后加入28μl、 10mol/L的盐酸终止反应, 以tris-Hcl缓冲液调零, 在420nm处测吸光度值, 根据抑制率判断样品对清除的能力。每份样品重复测定5次。
抑制率%=[A对照－( A样品－A样品空白) ]/ A对照×100%
A对照为不加样品的反应体系, A样品为加入样品的反应体系, A样品空白为不加邻苯三酚的反应体系。
2.2.5 清除羟自由基(·OH)能力的测定
2.2.5.1 试剂的配制
H2O2溶液( 8.8mmol/l) : 取H2O217.08µl加蒸馏水定容至25ml。
FeSO4溶液( 10mmol/l) : 取FeSO438mg加蒸馏水定容至25ml。
水杨酸溶液( 10mmol/l) : 取水杨酸34.53mg加蒸馏水定容至25ml。
2.2.5.2方法: 采用水杨酸法[39]。
操作步骤: ①分别取10mg/mL上述15种植物提取物样品10μl, 分别加入8.8 mmol/L H2O2 1ml,10mmol/L FeSO4 1ml, 10 mmol/L 水杨酸1 ml。②加H2O2启动反应, 37℃反应0.5 h。③以蒸馏水作参比, 在510 nm下测吸光度。每份样品重复测定5次。
清除率( %) ＝[( A0-(A1-A2)) /A0]×100
其中A0为对照液的吸光度, A1为加入样品后的吸光度, A2为不加显色剂H2O2样品溶液的吸光度。
2.2.6 维生素C的测定( 紫外快速测定法)
2.2.6.1 原理
维生素C又称抗坏血酸, 广泛存在于水果及蔬菜中, 柑桔、 番茄、 辣椒、 苹果、 鲜枣、 猕猴桃、 豆芽、 甘蓝、 洋葱、 菌类等果蔬中均具有较高的含量。由于维生素C具有较强的还原性, 对光敏感, 氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸, 脱氢抗坏血酸依然具有生理活性。进一步水解则生成2, 3-二酮古洛糖酸并失去生理活性。食品中的维生素C主要以前2种形式存在, 一般以二者的总量表示食品中维生素C的含量。测定维生素C的方法很多, 常见的有2, 6-二氯靛酚滴定法、 荧光法、 高效液相色谱法、 紫外分光光度法等。
紫外测定法是维生素C快速测定的方法, 操作简单, 不受其它还原性物质等成分的干扰。其原理是根据维生素C具有对紫外光产生吸收、 对碱不稳定的特性, 在243nm处测定样品液与碱处理样品液两者吸光度值之差, 并经过标准曲线, 即可计算出维生素C的含量。
2.2.6.2 试剂配置
( 1) 10%HCl: 取133mL浓盐酸, 加水稀释至500mL;
( 2) 1% HCl: 取22mL浓盐酸, 加水稀释至100mL;
( 3) 1mol/L NaOH溶液: 称取40g 氢氧化钠, 加蒸馏水, 不断搅拌至溶解, 然后定容至1000mL。
2.2.6.3 操作步骤
(1) 维生素C标准溶液的配制: 在分析天平上准确称取抗坏血酸10mg, 加2mL 10%HCl, 再蒸馏水定容至50mL, 混匀, 即为200μg/mL维生素C标准溶液。
(2) 测定并制作标准曲线: 取具塞刻度试管8支, 依序加入100μg/mL维生素C标准溶液0.1 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.8、 1.0mL, 分别补加蒸馏水至10.0mL, 摇匀。以蒸馏水为空白, 在243nm处测定标准系列维生素C溶液的吸光度。以维生素C的量( μg) 为横坐标, 对应的吸光度( A243) 为纵坐标作标准曲线。见表3

表3 维生素C标准曲线
项目
0
1
2
3
4
5
6
7
标准液体积( mL)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
维生素C含量( μg)
0
40
80
120
160
200

240
280
吸光度(A)
0
0.122
0.254
0.406
0.555
0.731
0.840
0.980

( 3) 样品中维生素C含量的测定: 用正交表分析结果的最优水平制备样品提取液。取0.1～0.2mL提取液, 放入盛有0.2～0.4mL10%HCl的10 mL容量瓶中, 用蒸馏水稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为空白, 在243nm处测定吸光度。
(4) 待测碱处理液的制备与测定: 分别吸取0.1～0.2mL提取液、 2mL蒸馏水和0.6～0.8 mL1mol/L NaOH溶液依次放入10 mL容量瓶中, 混匀, 15min后加入0.6～0.8 mL10%HCl, 混匀, 加蒸馏水定容至刻度。以蒸馏水为空白, 在243nm处测定吸光度。( 也能够碱处理待测液为空白, 在243nm处测定样品提取液的吸光度。)
( 5) 计算: 由待测液及碱处理待测液的A243值之差, 查标准曲线, 计算样品中维生素C的含量; 或者直接以碱处理待测液作空白测得的样品提取液的吸光度值查标准曲线, 计算样品中维生素C的含量。

式中: C—由标准曲线查得的维生素C含量( μg) ;
V—样品提取液定容体积( mL) ;
V1—测定时吸取样品提取液的体积( mL) ;
W—称取样品的质量( g) 。

3. 实验结果
3.1 棕色蘑菇正交试验结果
四水平四因素的正交试验的设计见表1。根据棕蘑多糖的测定方法可得正交试验方案与结果。见下表4

3.2 棕色蘑菇多糖的含量测定
在正交试验的最佳提取条件下测定真菌多糖的含量, 准确称取棕蘑1g放入50mL离心管中, 向其中各加入30mL蒸馏水。在恒温水浴锅50℃下加热5min, 然后进行超声15min, 超声后离心取上清液, 再加入30mL蒸馏水混匀后在恒温水浴锅50℃下加热5min, 然后进行超声15min后离心取上清液。两次上清液合并, 并记下体积。
取1mL离心得到的上清液, 稀释50倍。再取稀释液1mL加入5％苯酚1mL、 浓硫酸5mL, 然后振荡混匀, 在沸水浴中显色20min, 冷却至室温, 此时溶液颜色为棕黄色。再在754型分光光度计490nm处测光密度值。多糖含量=上清液体积×稀释液×稀释倍数×多糖浓度/样品重量×100％

表4 正交试验方案与结果
序号
A
( W)
B
( ℃)
C
( min)
D
溶液
( mL)
吸光度
( A)
多糖含量
( ％)
1
50
30
5
1:10
18.5
0.483
0.047
2
50
50
15
1:20
36
0.517
0.099
3
50
70
25
1:30

52.2
0.209
0.057
4
50
90
35
1:40
67
0.048
0.017
5
100
30
15
1:30
55.5
0.218
0.064
6
100
50
5
1:40
74.8
0.098
0.039
7
100
70
35
1:10
13.8
0.398
0.029
8
100
90
25
1:20
30
0.173
0.028
9
150
30
25
1:40
71
0.103
0.039
10
150
50
35
1:30
51
0.185
0050
11
150
70
5
1:20
34
0.135
0.024
12
150
90
15
1:10
11.5
0.260
0.016
13
200
30
35
1:20
32
0.239
0.041
14
200
50
25
1:10
13.0
0.426
0.029
15
200
70
15
1:40
69.0
0.050
0.018
16
200
90
5
1:30
53.8
0.076
0.022

k1
0.055
0.048
0.033
0.030
k2
0.04
0.054
0.049
0.0480
k3
0.032
0.032
0.038
0.0481
k4
0.028
0.021
0.034
0.028
R
0.027
0.033
0.016
0.02
优水平
A1
B2
C2
D3
主次因素
主次因素
B2 A1 D3 C2
B2A1D3C2
最优组合
A1 B2 C2 D3

3.3 精密度试验
取棕蘑样品稀释液1mL、 加5％苯酚溶液1 mL、 浓硫酸5mL, 然后振荡混匀, 显色30分钟后冷却至室温, 连续进样五次测定吸光度。结果见表9
表5 精密度试验
棕蘑样品

1
2
3
4
5
RSD( %)

0.239
0.235
0.239
0.232
0.236

由精密度试验结果可知, 棕蘑多糖连续进样五次测得的吸光度的相对标准差RSD都小于5％, 因此可得出此测定方法可行。
3.4 稳定性试验
取棕蘑样品稀释液1mL、 加5％苯酚溶液1 mL、 浓硫酸5mL, 然后振荡混匀, 显色20min后冷却至室温, 每隔2h测一次吸光度连续8h。结果见表10
表 6 稳定性试验
棕蘑样品
0
2h
4h
6h
8h
RSD( %)

0.124
0.128
0.125
0.122
0.126

由表10稳定性试验的结果可知, 8h内每隔2h测定一次吸光度, 棕蘑多糖五次吸光度的相对标准差RSD都小于5％, 因此硫酸-苯酚定糖法可行。
3.5 棕色蘑菇子实体营养成分含量( 见表7)
表7 棕色蘑菇子实体营养成分含量
营养成分
粗脂肪
粗蛋白
粗纤维
水分
可溶性总糖
维生素
棕色蘑菇
1.86
6.14
0.63
89.0
1.69
0.27
注: 营养成分含量用%鲜重表示

3.6 氨基酸测定结果
棕色蘑菇( A garicus brunnescens Peck) 俗称棕蘑,隶属于担子菌纲(Basidiomycotina) 伞菌目(Agaricales ) , 蘑菇科( Agaricaceae ) , 蘑菇属( A g aricus)。棕色蘑菇菌盖棕褐色,不会因褐变引起商品质量下降, 又无需使用化学护色、 漂白剂处理, 从而保证了食品的营养和安全; 其子实体的营养、 口感和香味更接近于野生口蘑,受到欧美及世界发达国家和地区消费者的青睐, 也是中国鲜食的优质蘑菇品种。我们在棕色蘑菇选育与驯化研究的基础上, 对棕色蘑菇的营养成分进行了研究, 现将实验结果报道如下。
经检测, 在棕色蘑菇中含有16种氨基酸, 子实体中氨基酸总含量为22.08%。其中谷 氨 酸和缬氨酸含量最高, 分别为4.66%和3.55%。
表8　棕色蘑菇子实体氨基酸含量
门冬氨酸
ASP
1.83
异亮氨酸
ILE
0.76
苏 氨 酸
THR
0.92
亮 氨 酸
LEU
1.40
丝 氨 酸
SER
0.91
酪 氨 酸
TYR
0.50
谷 氨 酸
GLU
4.66
苯丙氨酸
PHE
0.83
甘 氨 酸
GLY
0.95
赖 氨 酸
LYS
1.16
丙 氨 酸
ALA
1.68
组 氨 酸
HIS
0.56
胱 氨 酸
CYS
未检出
精 氨 酸
ARG
1.00
缬 氨 酸
VAL
3.55
脯 氨 酸
PRO
1.26
蛋 氨 酸
MET
0.12
总 量

22.08
注: 氨基酸含量用%干重表示

图2　棕色蘑菇子实体氨基酸色谱图
3.7 主要微量元素含量测定结果( 见表9)
表9 棕色蘑菇子实体中主要矿物质元素和有害金素元素含量
微量元素
P
Fe
Mn
Cu
K
Zn
Ca
As
Se
Ce
Ge
Pb
棕色蘑菇
1.34
23.10
1.46
12.50
50.20
12.00
113.50
0.24
-
-
0.05
0.09
1） 元素含量用mg∕kg鲜重表示
2） ”-”: 未检出

　 由表9 可知,棕色蘑菇子实体中含有丰富的钙、 铁和锌,以及人体必须的磷、 钾、 锰、 镁等元素。砷(As)、 镉(Cd)和铅( Pb)的含量均在国家规定的食品安全标准(As ≤0. 50 mg/ kg ,Cd ≤0. 50 mg/ kg ,Pb ≤1. 00 mg/ kg) 范围内[17 ,18 ,19 ] 。
3.8 维生素C测定结果

图3 维生素C的标准曲线图
测得样品的吸光度值分别为: A样品=0.392; A碱处理样品=0.329:;
因此: C=18μg

C—由标准曲线查得的维生素C含量( μg) ; 18μg
V—样品提取液定容体积( mL) ; 10ml
V1—测定时吸取样品提取液的体积( mL) ; 0.2ml
W—称取样品的质量( g) 。1g
由上诉测量结果可得: Vc的含量( μg∕g) =18*10∕( 0.2*1) =900μg∕g
3.9 体外抗氧化活性测定结果( 见表10)
3.9.1 真菌多糖对02-·的清除率
A对照= 0.381; A样品 = 0.399 ;A样品空白= 0.029
清除率( %) = [A对照－( A样品－A样品空白) ]/ A对照*100% =2.89%
3.9.2 真菌多糖对-OH的清除率
A0 = 0.665 ; A1 = 0.621 ; A2 = 0.028
清除率( %) ＝[( A0-(A1-A2)) /A0]×100 =10.83%

表10 真菌多糖对02-·和-OH的清除率
类别 02-·的清除率% -OH的清除率%
总提取物 2.89% 10.83%

4. 讨论与结论
4.1 超声时间对棕色蘑菇多糖提取率的影响
超声波法提取棕色蘑菇多糖时, 超声时间不宜过长。超声处理15min时提取率达到最大, 随着处理时间的延长, 提取率反而下降。原因可能是由于超声波具有较强的机械剪切作用, 长时间的作用会使大分子的多糖断裂, 从而在后处理的过程中的损失增大而影响多糖的提出率。
4.2 料液比对棕色蘑菇多糖提取率的影响
棕色蘑菇子实体的粒度大, 且含有大量的胶质, 子实体不易与水混合。加入量过少会影响设备的利用率, 加入量过多浪费能源, 增加成本。因此, 确定恰当的灵芝加入量就十分重要。实验表明, ω(棕色蘑菇):ω(溶剂水) =1:30时, 提取率最高。
4.3 棕色蘑菇多糖测定方法对提取率的影响
棕色蘑菇多糖的组成十分复杂, 其中大部分为β-型的葡聚糖。当前最常见的糖含量测定方法是硫酸—苯酚定糖法。但在实际工作中, 特别是在测定天然产物中的糖含量时, 发现测得的结果常常与实际情况不符。原因是以葡萄糖作为标准对照, 这对含有多种单糖的天然多糖来说必将使测量值与实际含量不符。本实验中就有将近70%的产物末被检出, 这是在糖含量测定方法的研究中常常遇到的问题。如果在制作标准曲线时能够根据多糖的组成, 用多种单糖适当混合后作为标准对照, 就能够在一定程度上改进这种情况。
4.4 棕色蘑菇多糖对 和-OH的清除作用
研究表明, 自由基和人类多种疾病有着密切的关系 [21]。体内自由基过多, 可引起蛋白质、 核酸( DNA) 变性, 导致细胞和组织器官损伤, 诱发各种疾病, 并加速机体衰老。随着膳食植物化学物研究的发展, 人们发现许多菌类及水果蔬菜对自由基有很强的清除作用。菌类及水果蔬菜除含有众所周知的维生素C、 E、 类胡萝卜素以外, 还含有丰富的萜类、 甾体类、 多糖类及微量稀有金属元素等物质, 这些物质具有较强的抗氧化、 改进机体自身环境的作用。棕色蘑菇清除自由基的作用可能是由于其含有的多糖或甾体化合物在起作用。
由上述实验可知超声波法提取棕色蘑菇中多糖的最佳工艺条件是超声功率50W、 超声温度50℃、 超声时间15min、 料液比1:30。本研究采用了超声波辅助热水提取棕色蘑菇中多糖, 从实验结果能够看出本方法精密度、 稳定性良好, 可在较低的温度下得到多糖。经检测发现棕色蘑菇子实体中含有16种氨基酸, 12种微量元素。维生素C的含量为900µg/g。羟基自由基清除率为10.83%, 氧自由基清除率为2.89%。

【参 考 文 献】

[1] 白润江. 香菇多糖对机体免疫功能的影响及抑瘤作用 [ J ].兰州医学院学报, 1990, 16 (1) : 101
[2] 曲章义. 香菇多糖抗肿瘤作用的机理 [ J ]. 中国食用药1997, 16 (5) : 3
[3] Chihara G,Hamuro J ,Maeda YY,et al . Fraction and pu2rifiction of the polysaccharides with marked antitumor ac2tivity ,especially Lentinan ,f rom lentinus edodes sing. Can2cer Res ,1970 ,30 :2776
[4] 盛剑秋等, 香菇多糖的免疫调节作用研究进展 .《胃肠病学和肝病学杂志》, 1998, 3, 7( 1)
[5] 潘冉,香菇多糖临床应用研究进展及香菇的药用价值.《Strait Pharmaceutical Journa