FISH基本原理-PPT.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,荧光原位杂交技术,原理,仪器耗材,试剂及配制,标本制备,探针的制备,杂交与检测,注意事项,一、原理,将荧光素直接标记的核酸探针（或生物素、地高辛等标记的核酸探针）与标本中的靶核酸序列按照碱基互补配对原则进行杂交，经洗涤后直接（或通过免疫荧光信号扩增）在荧光显微镜下观察，从而对靶目标中的待测核酸进行定性、定位或定量的研究。,二、仪器耗材,仪器：,荧光显微镜及分析软件，,PCR,扩增仪（变性），,37,0,C,隔水培养箱,(,杂交,),，湿盒，恒温水浴箱，冰箱，普通离心机，小型高速低温离心机，移液枪（,1000ul,200ul,20ul,，,10ul,）,玻片盒，通风橱，震荡混匀器，染色缸、计时器，温度计，温湿度显示器，量筒，酒精灯，烧杯，天平，试剂瓶等。,二、仪器耗材,耗材：,离心管,(50ml,15ml,1.5ml),，,PCR,管，各种规格的,tip,头，载玻片（带磨砂的），大盖玻片（方形，用于镜检），小盖玻片（一般用圆形，用于杂交时候封片），封片胶等。,三、试剂,液体,LB,，氯霉素，,STE,，,BAC,试剂盒，异丙醇，,NICK,试剂盒，无水乙醇，甲酰胺,20,SSC,，,2,SSC,，,70%,酒精，,90%,酒精，,100%,酒精，,BSA,，,HumanCotI,DNA,，,50%,硫酸葡聚糖，,0.3%NP40/0.4SSC,，,PBS,缓冲液，,0.1%NP40/2,SSC,，,DAPI,染色液等,。,四、标本制备,按第四章人淋巴细胞培养及收获及染色体制备收获外周血中期染色体，调整悬液浓度（,20,倍物镜视野下,20-30,个细胞，分裂指数在,4%,以上为宜），悬液,-20,0,C,保存。,五、探针的准备,BAC-DNA,的抽提,标记,纯化,1,、,BAC-DNA,的抽提,无菌操作台上，接种,BAC,菌种,7ul,于含氯霉素（氯霉素终浓度为,30ug/ml,）的,15ml,液体,LB,培养液中，空气摇床上,37,，,280rpm,，震荡培养,18-20h,。,4000 rpm,，,4,，离心,10min,去上清，加入,5mlSTE(,冰预冷,),重悬,4000 rpm,，,4,，离心,10min,去上清，加入,250ul P1(,冰预冷,),重悬,转入,1.5mlEP,管中,(,冰预冷,5min),加入,250ul P2(,预温,),轻轻转,6,次，室温静置,5min,加入,250ul P3(,冰预冷,),轻轻转,6,次，冰上,5min,13200 rpm,，,4,，离心,10min,1,、,BAC-DNA,的抽提,移上清至新的,EP,管（冰预冷），加入,700ul,异丙醇，混匀,13200 rpm,，,4,，离心,10min,去上清，加入,1ml 70%,无水乙醇混匀,13200 rpm,，,4,，离心,10min,去上清，加入,15ul Nuclease-free water,溶解,DNA,室温放置,2,、标记探针,采用缺口平移标记法（,NICK,试剂盒）,在,0.5mlEppendorf,管中加入：,Nuclease-free water 13.5ul,dNTP,mix,（,0.1mM,）,10ul,dTTP,（,0.1mM,）,5ul,10,buffer 5ul,模板,DNA,（,1-1.5ug,）,6ul,SpectrumGreen,或,SpectrumOrange,或,SpectrumRed,dUTP,（,0.2mM,）,25ul,Nick translation enzyme 8ul,总体积,50ul,2,、标记探针,上,PCR,仪：,15,8,小时,75,10,分钟灭活,4,保存,取标记后的探针,5ul,跑,1%,琼脂糖凝胶电泳检测，标记后探针长度范围在,100-400bp,较好（稳定，达到,5000bp,）,3,、纯化探针,在,1.5mlEppendorf,管中加入：,E,coli,tRNA,（,1ug/,ul,）,1ul,鲑鱼精,DNA,（,10mg/ml,）,5ul,8M,醋酸胺,6ul,糖元（,10mg/ml,）,1ul,4,保存。,3,、纯化探针,将标记好的探针加入上述,Eppendorf,管，再加入,-20,无水乙醇,200ul,，,-70,放置,30,分钟,4,，,15000rpm,，离心,10,分钟,去上清，加入,200ul70%,乙醇,4,，,15000rpm,，离心,5,分钟,吸去乙醇，立即加入甲酰胺,25ul,室温，避光，溶解,10,分钟，,-20,保存,六、杂交与检测,外周血玻片准备,杂交体系准备,杂交,洗脱,结果观察,1,、外周血玻片准备,75,烤箱烘烤,2,小时,置于,2,SSC,中,30min,依次放入,70%,，,90%,，,100%,酒精中各,2min,室温干燥,2,、杂交体系准备,在,1.5mlEppendorf,管中加入,20,SSC 1.5ul,BSA,（1ug/,ul,）,1ul,HumanCotI,DNA,（,1mg/ml,）,2ul,探针,3.75ul,甲酰胺,3.75ul,50%,硫酸葡聚糖,3ul,总体积,15ul,3,、杂交,PCR,扩增仪开启，使温度达到,80,滴加配好的杂交液,15ul,于杂交区,盖上盖玻片，封胶，,PCR,扩增仪,80,变性,2min,将玻片置于湿盒，放入,37,杂交,16,小时以上,4,、洗脱,杂交次日,70,0.4SSC/0.3%NP40,漂洗,2min,室温,2,SSC/0.1%NP40,漂洗,1min,室温,2,SSC 2min,室温,70%,，,90%,，,100%,酒精中脱水各,2min,室温干燥,加,20ul DAPI,加到杂交区，盖上盖玻片，复染,10min,荧光显微镜下观察结果,5,、结果观察,观察镜下荧光杂交信号，计数,30,个细胞和采集,4,张图像。,七、注意事项,玻片准备时要注意玻片的干净和透明度；,杂交过程中要保持湿润；,杂交必须对玻片变性温度进行摸索；,染色体制备分裂相应尽量长且分散，胞质应尽量去干净；,荧光素和甲酰胺应注意避光保存；,甲酰胺有神经性毒性，操作时应注意戴手套；,探针溶解应完全；,标记模板,DNA,应尽量纯，没有其他蛋白质及核酸的污染；,需要,-20,保存的试剂都应分装后,-20,保存。,谢谢！,