珠江啤酒-PYF絮凝因子检测方法的探索和实践-发布会.doc

PYF（酵母提前絮凝）因子检测方法的探索和实践
陈明 陈凤
广州珠江啤酒股份有限公司技术中心 510308

[摘要]：PYF（Premature Yeast Factor）是一种引起酵母提前絮凝的物质，据国外研究报道认为是大麦在潮湿的收获条件或贮藏条件下为防止微生物的生长而产生的一种抗体物质，存在于大麦麦皮内；另外在制麦发芽过程中，因通风效果差，也有可能促使大麦产生一种抗体物质。这些抗体物质可溶于水，并且对啤酒酵母的絮凝会产生比较明显的影响，但它的分子组成成份和机理目前仍不是很清楚。通过检测此因子，可了解大麦质量和制麦过程的质量，并对预防酵母过早絮凝、产生不利风味（如乙醛含量无法及时被酵母还原而含量过高）有较好的预防预警作用。本文介绍了作者在建立和验证PYF检测方法过程中的探索和实践以及一些心得体会,而且还对大生产过程中酵母絮凝过快的现象进行了分析，认为麦芽PYF因子和酵母提前絮凝有一定的相关性。

[关键词] PYF絮凝因子、酵母絮凝、发酵、风味物质

一、概述
目前对酵母絮凝的机理研究认为主要是基于外源凝集素和酵母细胞壁甘露糖残基间的相互作用结果。外源凝集素的分析认为主要和麦芽中的外皮浸出物——高分子酸性多糖或蛋白有关。因此在国外的研究中引入了PYF（Premature Yeast Factor）概念，是由PYF因子介导的形成比正常细胞团状物大的絮凝现象。根据国外有关文献报道:絮凝因子可用水萃取出来,通过比色皿和吸光度来分析测定麦芽提取液对酵母细胞的沉降速率来衡量酵母的絮凝性。由于文献中提供的检测方法比较简单,我们只能通过在实际检测过程中反复验证,从而不断完善检测方法。

二、检测仪器和试剂
1、 检测仪器
1.1、 冷冻摇床
1.2、 冷冻离心机
1.3、 磁力搅拌器
1.4、 GBC紫外/可见光分光光度计
2、 化学试剂
2.1、PYF酵母培养基（1%酵母浸粉，2%蛋白胨，7.5%麦芽糖，2.5%葡萄糖）
2.2、去离子水
2.3、0.1M EDTA溶液
2.4、无水乙醇
2.5、0.05M乙酸钠-0.1%氯化钙缓冲液
三、PYF絮凝因子检测方法
PYF絮凝因子检测方法主要分为三部分，以下简要介绍此方法的主要内容：
1、专用酵母培养与收集
1.1、酵母活化和培养：
将斜面菌种接种到培养基于12℃冷冻摇床120rpm培养96h（不同菌种可能有所变化，指的是对数生长后期所要求培养的时间。在操作时要间隔4～5小时检测酵母数，然后画出酵母生长曲线后，再定对数生长后期即拐点处的时间）。
1.2、酵母收集：
离心10min收集酵母， 用去离子水洗涤1次；再用0.1M EDTA溶液洗涤2次；最后用去离子水洗涤2次。
2、絮凝因子的提取
将25g大麦（或麦芽）粉碎后加入150g去离子水利用磁力搅拌器搅拌30min，然后10000rpm离心15分钟收集上清液，加入等体积的无水乙醇搅拌10min，10000rpm离心15分钟收集沉淀，再溶于12.5mL去离子水中（温度40℃左右，一开始用玻璃棒捣碎，再搅2min左右，然后再静置，放置1小时），再10000rpm离心15分钟收集上清液，不用过滤，0-5℃贮存。
3、PYF絮凝因子的测定
3.1、酵母：使用前加适量去离子水稀释酵母至600nm吸光值接近4。
3.2、检测：
在1cm的玻璃比色皿中加入2.6mL的0.05M乙酸钠-0.1%（w/w）氯化钙缓冲液，再加入0.4mL的大麦（或麦芽）提取物，通过添加酵母液调节600nm下的吸光度至3.0（蒸馏水作空白），然后以比色皿盖覆盖并颠倒混合于室温下静置30min。振荡比色皿使沉降的酵母重新悬浮，测定6min内酵母的沉降曲线（每分钟读一次吸光值）。絮凝力定义为含有样品的酵母悬浮液在前6min内的光度值变化X；
空白样：以水代替样品的酵母悬浮液在6min内的光度值变化Y。
3.3、PYF因子的计算：含有样品的酵母悬浮液与以水代替样品的酵母悬浮液在6min内的光度值变化之比值。
X
PYF =
Y
四、对PYF絮凝因子检测方法的探索和实践
1、酵母对数生长期拐点时间的确定
由于不同菌种的对数生长期拐点时间不同，需要确定我公司酵母的具体拐点时间。为此我们进行了多次试验，试验方法是将酵母斜面接种到150mlPYF培养基，跟踪酵母数的变化，然后画出酵母生长曲线，确定对数生长后期拐点处的时间为66小时。
2、不同酵母来源对PYF的影响
本次试验选用大生产对数生长期的2代种酵母，发酵液糖度7.5P，悬浮酵母数42.5*106个/ml来做试验。检测数据如下：（见表1和图1）

麦芽1
麦芽2
麦芽3
麦芽4
大生产对数生长期的2代种酵母PYF值
1.358
1.696
1.568
1.329
斜面接种活化酵母PYF值
0.714
分析：从检测数据看，大生产对数生长期的酵母PYF值和斜面接种活化酵母PYF值有明显区别。原因可能为大生产酵母已经受到其它因素（如压力、酒精度等等）对其絮凝的影响，使其絮凝倾向加大，所以明显比扩培出来的酵母PYF检测值大。
0.76
0.711
0.607

3、不同缓冲液PH的影响
为验证酵母在不同PH的乙酸钠-氯化钙缓冲溶液条件下絮凝区别，设计了三个不同PH条件的实验，结果如下：（见表2和图2）
麦芽样品
絮凝因子PYF(PH3.8)
絮凝因子PYF(PH4.3)
絮凝因子PYF(PH4.5)
1
0.335
0.604
0.711
2
0.163
0.64
0.607
3
0.12
0.727
0.619
4
0.189
0.63
0.544
5
0.291
0.745
0.69
6
0.257
0.555
0.573
图2如下：

数据分析：当缓冲液PH为3.8时对酵母的絮凝性最不敏感；此酵母在PH4.3和4.5时敏感程度比较大，PYF检测值比较高，更能反映酵母的凝聚性能。
4、不同扩陪时间的影响
为明确酵母在哪个生长阶段对PYF因子影响更大，我们选择对数生长期和对数生长期延长48小时后的酵母进行絮凝性检测对比，数据对比如下：（表3和图3）

酵母对数生长后期酵母的PYF检测值
酵母对数生长期延长两天的PYF检测值
第一次检测结果
1.224
1.178
第二次检测结果
1.139
1.018
第三次检测结果
0.992
1.141
第四次检测结果
1.221
1.076
第五次检测结果
1.156
1.098
第六次检测结果
1.108
1.087
六次检测平均值
1.14
1.10
标准偏差
0.078
0.05
变异系数（相对偏差）
6.84%
4.58%
分析：从数据看对数生长期和延长48小时后的酵母絮凝性没有明显差异，另外此检测方法的重复性实验变异系数小于10%，可认为是可信的。

五、PYF絮凝因子和生产过程中酵母提前絮凝现象的相关性
从麦芽的PYF值和生产过程酵母的沉降凝聚情况看，有比较明显的对应关系。
1、PYF值和酵母絮凝的影响和对应关系（见表四和图4）
麦芽样品
絮凝因子PYF
满罐
第一天
第二天
第三天
第四天
第五天
第六天
第七天
第八天
1
0.611
12
16.7
21.5
40.7
45
46.1
35.5
20.4
8.6
2
0.607
10.1
9.9
20.6
30.5
40
30.7
20.6
10.9
6.8
3
0.619
10
15.4
28.8
49.7
35.9
23.5
24.7
21
10.7
4
0.69
14.6
16.7
23.8
48
53.3
13.5
9.9
10
7.2
5
0.573
15.2
18.1
30.7
45.5
56.4
41
22.7
11
7.1

分析：由图4可看出，麦芽样品4的PYF因子为0.69，是5个样品中最高的，而且它也引起了酵母提前絮凝，在第五天就出现明显下降。
2、酵母提前絮凝对产生风味的影响（见表5和图五、图六），单位ppm
麦芽样品
絮凝因子PYF
正丙醇
异丁醇
异戊醇
活性戊醇
乙酸乙酯
乙酸异戊酯
总醇
总酯
醇酯比
乙醛
1
0.611
8.62
12.1
61.14
9.5
21.99
1.48
91.39
23.5
3.89
2
2
0.607
10.11
11.4
56.84
9.08
21.39
1.59
87.47
23
3.81
3.1
3
0.619
9.15
11.4
55.6
8.85
17.74
1.31
84.99
19.1
4.46
3.57
4
0.69
10.43
9.16
52.3
9.89
11.89
0.63
81.78
12.5
6.53
5.48
5
0.573
10.34
12.8
65.29
10.01
2007
1.65
98.44
21.7
4.53
3.7
分析：由图5可看出，麦芽样品4的PYF值最高，其高级醇含量相比其它样品最低，并且产生的酯含量明显偏低，醇酯比最高；另外麦芽样品4的乙醛含量也是最高的。本次试验说明PYF因子高的麦芽不但引起了酵母提前絮凝，而且对发酵液的风味，特别是酯含量和乙醛含量产生了明显的不利影响。
图五和图六：

六、总结和讨论
在建立和验证PYF检测方法的过程中，我们确定了我公司酵母的对数生长期拐点时间。发现了大生产对数生长期的酵母PYF值和斜面接种活化酵母PYF值有明显区别，必须使用专用培养基扩陪出来的酵母；酵母在不同PH的乙酸钠-氯化钙缓冲溶液条件下表现出来的絮凝能力也有较大区别；酵母在PH4.3和4.5时敏感程度比较大，PYF检测值比较高，更能反映酵母的凝聚性能。从对数生长期和延长48小时后的酵母絮凝性数据比较分析，认为两者没有明显差异。
对大生产过程中酵母絮凝过快的现象进行了分析，认为麦芽PYF因子和酵母提前絮凝有比较明显的对应关系。另外本次试验还说明PYF因子高的麦芽不但引起了酵母提前絮凝，而且对发酵液的风味，特别是酯含量和乙醛含量产生了明显的影响。

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