酵母多糖在养猪应用中的实验报告-整理.doc

中央投资企业 北方最大的啤酒酵母生产基地

2011年6月

酵母细胞壁粉在生长猪上的应用试验报告
畜禽饲料中长期大量应用抗生素而造成抗生素在畜产品中的残留及使细菌产生耐药性使人们迫切地意识到寻求抗生素替代品的重要性。酵母细胞壁是一种全新的天然绿色饲料添加剂，其产品为浅灰至深灰色粉末状，富含β-葡聚糖、甘露寡糖、海藻糖等功能成分，占细胞壁干重的85%左右。二十世纪四十年代，Pillemer博士首次发现并报道酵母细胞壁中有一种物质具有提高机体免疫力的作用。酵母细胞壁作为一种高效免疫增强剂，可以刺激动物产生非特异性免疫应答，提高和调节动物细胞免疫和体液免疫水平，维护活菌平衡，控制疾病等生理功效。在猪饲料中添加少量酵母细胞壁提取物，能改变其消化道微生物菌群，提高猪的增重和饲料转化率，且对肠道组织具有保护和营养作用。岳文斌(2002)报道，甘露寡糖能极显著提高断奶仔猪血清IgG水平(P<0.01)。Eicher(2006)所做的试验表明，对于未断奶仔猪和断奶后仔猪，将β-葡聚糖与维生素C联合使用，比单独使用vc的对照组的平均日增重要高，差异达到显著水平(P<0.05)。
由于酵母细胞壁的天然无公害性，本研究选用生长猪以研究酵母细胞壁的免疫促进作用及对生长猪生产性能的影响，为在养猪生产中不使用抗生素生产安全猪肉提供科学依据。
1 试验材料及方法
1.1试验产品
唐山托普生物科技有限公司生产啤酒酵母免疫多糖。
1.2 试验动物
平均体重在30.0 + 0.5 kg左右的杜×长×大三元杂交小猪。由河北唐山玉田养猪场提供。
1.3试验日粮
根据营养标准配置基础日粮，饲粮配方及营养水平指标见表1，试验组在基础日粮上添加2g/kg拓普啤酒酵母多糖。饲喂28天。
表1 饲料配方及营养水平指标
Table 1 Forumlation and nutrient level
原料名称
原料配比
营养水平
营养成分含量
对照组
处理组
玉米2级(%)
68.6
68.6
猪消化能 (MJ/kg)
13.81
大豆粕,2级(%)
23.1
23.1
粗蛋白质 (%)
16.97
鱼　粉(%)
1.0
1.0
钙 (%)
0.61
小麦麸(%)
5.0
4.7
总磷 (%)
0.52
赖氨酸(%)
0.08
0.08
有效磷 (%)
0.28
石　粉(%)
0.9
0.9
食盐 (%)
0.43
磷酸氢钙(%)
0.7
0.7
赖氨酸 (%)
0.90
食　盐(%)
0.4
0.4
总含硫氨基酸 (%)
0.57
猪用多矿(%)
0.2
0.2
蛋氨酸 (%)
0.28
猪用多维(%)
0.02
0.02

酵母细胞壁(%)

0.2

2.方法
2.1断奶仔猪生长性能测定方法
2.1.1试验分组
选择日龄相近，平均体重在30.0 + 0.5 kg左右的杜×长×大三元杂交小猪60头，猪只健康，大小均匀，公母各半，随机分为2个处理，每个处理3个重复，每个重复10头。对照组：基础日粮组，处理组：基础日粮+酵母细胞壁（2g/kg）。
2.1.2日常管理
每天饲喂3次，早晨6:30，上午11:30，下午18:00，猪只自由饮水。记录试验前重量，每天采食量，腹泻情况，试验后重量并于试验第二十四天前腔静脉采血，每重复3头。猪只发生病变或异常，要及时处理并记录。
2.2试验预处理
在正式试验开始后的第7天，每个重复选取3头体重相近的健康猪，耳后肌肉注射牛血清白蛋白(BSA)1mg/kg体重进行免疫。并在免疫后的0天(试验的第7天)、7天(试验第14天)和21天(试验28天)用10ml真空采血管颈静脉采血5ml，3000转/分离心15分钟，制备血清，-20℃冰箱保存备用。
于试验正式开始后的第14天，对各处理组剩余的猪只随机选取2头，进行皮肤过敏试验。其中1头在猪的左大腿内侧腹骨沟皮下注射0.5ml PHA（Phytone magglutinin ,植物凝集素）溶液(250μg/ml，右腿注射0.5ml生理盐水)，圆圈标记。并分别于注射前和注射24小时后用厚度计测定注射部位的皮褶厚度（三次读数，求平均值），再求出两腿皮褶增厚的差值，观察过敏反应程度。另外1头左腿注射1ml PHA，右腿注射1ml生理盐水(其它处理同上1头猪)，测定24小时后皮褶厚度增厚值。
2.3试验检测指标及方法
2.3.1生产性能指标：以平均日增重、平均日采食量、料肉比以及成活率、下痢猪头数来表示。分别于试验开始时和结束时称量并记录试验猪的初始体重和终体重，记录试验期间各处理组总耗料，计算各试验组生长猪试验期间的平均日增重、平均日采食量、料肉比。
2.3.2血液生化指标：总蛋白(TP)、球蛋白（GLB）、清蛋白（ALB）、计算球/清蛋白比（G/A）。分别于正式试验开始后的第7天、第14天、第28天前腔静脉采血制备血清，检测血清中的总蛋白、白蛋白、计算球/白比值。
2.3.3免疫指标：A、体液免疫指标：使用牛血清白蛋白(BSA)试剂，采用酶联免疫吸附测定法，在酶联免疫自动读数仪492nm处读数，以1：50倍稀释光吸收值表示其抗体生成，测定血清中BSA抗体效价(OD值)。B、细胞免疫指标：迟发性过敏反应的测定，生长猪左腿内侧皮下注射植物血球凝集素（PHA），右侧注射生理盐水，测定24小时后左右腿皮褶厚度增厚差值。
3.试验结果与分析
3.1 生产性能
试验结果见表2。
表2 试验猪生产性能指标
Table 2 The Performance of Polysaccharide from Yeast Cell Wall on the Growing Swine
项目
日增重（g）
日采食量（g）
料肉比
成活率（%）
对照组
658.6a
1586
2.41
100
处理组
698.0b
1633
2.34
100
 注：同列肩注有不同字母者差异显著（P＜0.05）。
由表2可见，处理组生长猪的平均日增重、平均日采食量均好于对照组，且平均日增重经统计分析，处理组与对照组相比差异达显著水平（P＜0.05）,而料肉比处理组猪与对照组相比稍低。同时，在整个试验期间，对照组有5头猪出现下痢后经治疗痊愈，而处理组猪未出现猪只发病情况。
3.2 血液生化指标
试验结果见表3。对照组与处理组血清总蛋白含量在整个试验期间（1-28天）时上升，但对照组与处理组之间差异不显著，同时，在正式试验的第7天、第14天、第28天，血清总蛋白含量各处理组内统计分析差异没达到显著水平。在整个试验期间对照组与处理组血清中白蛋白含量上升，且对照组血清中白蛋白含量上升幅度大于处理组。在试验的第7天、第14天，处理组血清中球/白均高于对照组（P＞0.05），但在试验的第28天时处理组血清中球/白低于对照组，统计分析差异达到显著水平（P＜0.05）。血清白蛋白的作用主要是用以维持机体血管内渗透压的平衡和物质的运输。而抗体是球蛋白重要的组成部分，炎症反应和应激状态下，血清球蛋白的含量增加。本试验结果表明，在经过抗原牛血清白蛋白刺激后，机体的免疫系统被激活，更多的蛋白质用于抗体的合成，随着抗体的产生量的提高，血液中的球蛋白含量随之增加，球/白值升高。在试验的第28天时处理组中球/白比值低于对照组。球/白在整个试验期间先升高后降低，且处理组球/白下降幅度大于对照组，表明酵母细胞壁可以减低免疫反应程度，避免机体长期处于高度应激状态，从而达到促进动物机体生长的作用。
表3 血清生化指标
Table 3 The Results of Blood Serum Biochemistry
试验时间
处理组
总蛋白(g/dl)
白蛋白(g/dl)
球/白
第7天
对照组
5.863+0.642
3.475+0.083
0.691+0.225

处理组
5.558+0.363
3.118+0.186
0.792+0.278
第14天
对照组
6.788+0.616
3.808+0.348a
0.797+0.271

处理组
5.974+0.301
3.304+0.234b
0.814+0.159
第28天
对照组
7.170+0.920
4.161+0.538
0.725+0.105a

处理组
6.030+0.443
3.995+0.346
0.510+0.021b
注：同列肩标不同字母者差异显著（P＜0.05）。
3.3 牛血清白蛋白（BSA）抗体OD值
在试验期间，前腔静脉采取牛血清白蛋白（BSA）免疫后0天、第7天、第21天的试验猪血清，检测BSA抗体OD值。对照组和处理组的BSA抗体OD值结果见表4。
表4 BSA抗体OD值
Table 4 The OD Amount of Bowine Serum Albumin(BSA) Antibody
试验时间
对照组
处理组
免疫后0天
1
1
免疫后7天
1.091+0.097a
1.426+0.396b
免疫后21天
1.066+0.046
1.173+0.161
注：同行肩注有不同字母者表示差异显著(P＜0.05)。
分析发现，在BSA免疫前，猪血清中中已经含有BSA抗体，且变异很大。而试验设计时认为BSA为一种异源蛋白抗原，猪血清中BSA抗体水平应该为零。估计这种抗体是由于许多疫苗如猪瘟疫苗中含有牛血清白蛋白成分(例如作为佐剂)造成的。事实上，在本试验开始之前，该猪场已对试验猪群进行过两次猪瘟疫苗免疫。尽管如此，当以注射BSA抗体OD值为1时，用各时间点的OD值与之比较，则比值仍可出现较明显的规律性变化，即免疫后第7天时，BSA抗体的OD值均升高（P＜0.05），免疫后第21天时BSA抗体的OD值均下降（P>0.05），且处理组(酵母细胞壁组)下降幅度大于对照组，这与血液生化指标反映的酵母细胞壁具有减低免疫反应程度，避免动物机体长期处于高度应激状态的作用一致。
3.4 皮褶厚度增加值
试验结果见表5。
表5 植物血球凝集素（PHA）注射左右腿皮褶厚度增厚差值 (mm)
Table 5 The Effect of Skinfold Thickness Stimulated by Phytohemagglutinin
PHA处理
处理
试验第7天
试验第14天
试验第28天
左腿注射0.5 ml PHA，右腿注射0.5ml生理盐水
对照组
4.87
6.42
4.67
处理组
7.05
7.15
8.23
左腿注射1.0 ml PHA，右腿注射1.0ml生理盐水
对照组
6.87
8.58
7.36
处理组
9.22
10.92
12.09
PHA是一种促有丝分裂原。动物皮下组织对PHA的反应状况是细胞免疫的一项指标[5,6]。免疫组织学分析，这种皮下反应的主要参与者为单核细胞和致敏的T淋巴细胞。其反应包括局部发炎感染并向皮下扩散，血管周围白细胞聚集成套状、水肿以及皮肤胶原蛋白隆起。由表5可知，处理组猪PHA注射后24小时后左右腿皮褶厚度增加值大于对照组，表明在饲料中添加酵母细胞壁具有提高生长猪细胞免疫的作用效果。PHA注射1ml时皮褶厚度增厚差值大于注射PHA　0.5ml剂量时皮褶厚度增厚差值初步表明皮褶厚度的增厚值与注射PHA的剂量有一定的关系。
4.讨论与小结
进一步研究表明，酵母细胞壁的功能物质主要是β-葡聚糖和甘露寡糖。β-葡聚糖是葡萄糖的一种聚合物，在酵母细胞壁中主要是由D一葡萄糖通过β-D-(1-3)键的方式相结合，也有部分是高度分支的β-D-(1-6)键结合的聚糖，不同于植物细胞壁中的β- (I-4)葡聚糖。β-葡聚糖是酵母细胞壁行使其特殊功能的多糖，约占细胞总重的12%-14%。体内网状内皮系统(RES )在葡聚糖的刺激下，产生大量对机体免疫功能起关键作用的巨噬细胞，而巨噬细胞通过吞噬作用吸收、破坏和清除体内损伤的、衰老的、死亡的自身细胞和侵入体内的病原微生物。
甘露寡糖(Mannan一oligosacharides,MOS或BIO一MOS)是一种重要的寡糖。研究表明，某些对动物体有害的微生物如大肠杆菌、沙门氏菌等，以葡萄糖作为主要的能源，而有益菌如双歧杆菌、乳酸杆菌等则是以寡糖为主要能源。病原菌细胞表面或绒毛上具有类丁质结构(如植物凝集素)，它能够通过识别“特异性糖类”受体(糖脂或搪蛋白的残基)，并与受体结合，在肠壁上发育繁殖，导致肠道疾病的发生。酵母细胞壁所含的甘露寡糖(简称MOS)与病原菌在肠壁上的受体非常相似，并与类丁质(Lectin)有很强的结合能力，动物肠道内丰富的甘露糖源避免了细菌与肠壁的亲和。同时由于MOS不会被消化酶降解并携带病原菌通过肠道，因此甘露寡糖起到吸附肠道病原菌，调节非免疫防御机制，促进动物生长的作用。
本研究结果也证实了在生长猪饲料中添加酵母细胞壁可显著提高生长猪的日增重（P＜0.05），提高饲料转化率，降低料肉比，具有提高生产性能的趋势。能够提高生长猪血清中球/白比值，提高BSA免疫机体抗体OD值，BSA免疫后7天对照组与处理组相比OD值差异达显著水平（P＜0.05）；经使PHA刺激后24小时皮褶厚度增厚值加大，也即具有提高动物机体免疫性能的能力，在生长猪日粮中添加免疫增强剂酵母细胞壁替代抗生素生产安全畜产品具有可行性。

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