人教版222动物细胞融合.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,学习目标：,1,、说出动物细胞融合原理、过程和方法,2,、单克隆抗体的原理和应用,重点和难点：,1.,动物细胞融合的过程,2.,单克隆抗体的制备和应用,2.2.2,动物细胞融合与单克隆抗体,复习回顾：,1,、植物体细胞杂交的过程是怎样的？,2,、动物细胞和植物细胞有何不同,？,无细胞壁,全能性受限制,动物细胞杂交与植物细胞杂交的不同：,不需去除细胞壁,不能发育成新的动物个体,2.2.2,动物细胞融合与单克隆抗体,一、动物细胞融合,1,、概念：,也称细胞杂交，,指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。,2结果：,形成具有两个或多个细胞遗传信息的单核细胞,一、动物细胞融合,3,、原理：,细胞膜的流动性,4,、诱导方式,物理法：离心、振动、电激,化学法：聚乙二醇（,PEG),生物法：灭活的病毒,思考：,动物细胞融合原理与植物原生质体融合的基本原理是否相同？,为什么灭活病毒能够作为诱导剂？不灭活的是否可以？,利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。,灭活的病毒对细胞没有感染能力,并不破坏这些病原体的抗原结构。,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂,质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。,一、动物细胞融合,5,、过程：,动物细胞,A,动物细胞,B诱导，融合,杂种细胞,AB,有丝分裂,（膜融合、质融合）,（核融合）,注意：动物细胞的融合也需要把多个两种细胞放在一起，让它们随机融合后，再从中筛选杂交细胞,多核体,一、动物细胞融合,灭活病毒诱导细胞融合,融合后的细胞进行有丝分裂,杂交细胞的特点：,融合形成的杂交细胞具有两个细胞的遗传信息，可表现两个亲本的遗传性状。,一、动物细胞融合,6,、意义：,突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。,7,、应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段,特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体,一、动物细胞融合,比较项目,原理,方法,诱导手段,杂交后细胞的名称,用法,植物体细胞杂交,动物细胞融合,一、动物细胞融合,对比：,细胞膜的流动性、,植物细胞全能性,去壁后诱导原生质体融合,物理法（离心、振动、电激）化学法（聚乙二醇,杂种细胞,形成杂种植株,获得杂种植株,细胞膜的流动性,使细胞分散后诱导细胞融合,除以上方法，还有生物法,杂交细胞,形成细胞群,制备单克隆抗体,杂种细胞,愈伤组织,杂种植株,植物细胞,A,植物细胞,B,原生质体,A,原生质体,B,植物体细胞杂交,去壁,融合,组培,物理法,化学法,生物法：,灭活的病毒,动物细胞,A,动物细胞,B,杂种细胞,动物细胞融合,二、单克隆抗体的制备,1、,抗体,(2),来源：,B淋巴细胞,(,具有特异性。,),复习：,(1),概念：,抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白,。,传统的抗体生产方法是向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需要的抗体。这种生产抗体的方法产量和纯度都很低，而且制备的抗体特异性差,自主阅读,P52：,传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？,二、单克隆抗体的制备,B淋巴细胞的,特点：,B,淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。,动物体内的,B,淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。,每一个,B,淋巴细胞只能产生一种特异性抗体。,二、单克隆抗体的制备,如何获得化学性质单一特异性强的抗体？,体外培养淋巴细胞能无限增殖吗,?,体外培养单个淋巴细胞，提取分泌的抗体,怎样解决这个问题？,二、单克隆抗体的制备,1975,，米尔斯坦和柯勒 杂交瘤技术,极富创造性的方案,将能够产生特定抗体的,B,淋巴细胞,和具有无限增殖能力的,骨髓瘤细胞,融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。,米尔斯坦,(,阿根廷,),和科勒,(,德国,),因此在,1984,年获诺贝尔奖。,二、单克隆抗体的制备,1,、,单克隆抗体,（,1,）概念:,由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。,二、单克隆抗体的制备,诱导其融合的方法有哪些？,融合后培养液中有几种细胞,怎样筛选出杂交瘤细胞，杂交瘤细胞有何优点,注射抗原的目的是什么,（,2,）制备过程：,二、单克隆抗体的制备,为何要进行克隆化培养和专一抗体检测，,多次,筛选,（,2,）制备过程：,二、单克隆抗体的制备,知识拓展,如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？,融合后的细胞经,选择性培养基,培养后，,能存活,的细胞就是,杂交瘤细胞,。,但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。,将杂交瘤细胞稀释,，用,多孔细胞培养板培养,，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后,检测各孔上清液中细胞分泌的抗体,（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行,3,4,次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。,为何要进行克隆化培养和专一抗体检测，多次筛选,大量增殖杂交瘤细胞获得单抗的方法,（,2,）制备过程：,二、单克隆抗体的制备,（,2,）过程,B,淋巴细胞,骨髓瘤细胞,诱导融合,B-B,细胞,B-,瘤细胞,瘤,-,瘤细胞,杂交瘤细胞（,B-,瘤细胞）,克隆化培养,抗体检测,能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞,体外培养,小鼠腹腔内增殖,单克隆抗体,第一次筛选,用特定的选,择性培养基,第二次筛选,经免疫,的小鼠,提取,二、单克隆抗体的制备,如何大量生产单克隆抗体？,利用,B,淋巴细胞,的功能,利用骨髓瘤细胞,的特性,利用,技术,将两种细胞融合获得具有,B,淋巴细胞和骨髓瘤细胞特性的杂交瘤细胞,利用,技术,大量培养杂交瘤细胞,产生抗体,无限增殖,动物细胞融合,动物细胞培养,二、单克隆抗体的制备,动物特异性免疫,分离,B,淋巴细胞（,B,）；找到骨髓瘤细胞（,G,）。注意,B,淋巴细胞是一个系列。（,B1,B2,B3,-Bn,）,细胞融合,三种融合方式,:,（,BB;BG;GG,）,单抗的制备过程要点：,对小鼠,注射特定的抗原蛋白,二、单克隆抗体的制备,4.,第一次筛选：在,“,选择培养基培养,”,上培养筛选,杂交瘤细胞,（只有,BG,杂交瘤细胞存活。但,BG,杂交瘤细胞也是一个系列：如,B1G,B2G-BnG,。而,BB,GG,在此培养基上不能存活。）,单抗的制备过程要点：,二、单克隆抗体的制备,5.,第二次筛选：在,“,多孔培养板上,”,培养,杂交瘤细胞系列,，,每孔只放一个杂交瘤细胞。,“,克隆化培养,”,每个杂交瘤细胞，并进行,“,单一抗体检测,”,，,“,检测阳性,”,的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。,6.,选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，,体外培养,或注射到,小鼠腹腔内增殖,。,7.,提取单克隆抗体。,二、单克隆抗体的制备,单抗的制备过程要点：,3,）、如何进行第,2,次筛选？,培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。,1,）、本过程利用了哪些技术手段？,细胞融合和动物细胞培养，（免疫原理）,2,）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与,B,细胞融合？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有,B,细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,二、单克隆抗体的制备,小结：,比较项目,第一次筛选,第二次筛选,原理,在选择性培养基中添加某种药物，特异性杀死骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞自身融合的细胞,抗原,抗体的特异性结合,目标,杂交瘤细胞,既能无限增殖，又能产生特异性抗体的杂交瘤细胞,4,）、为何要进行两次筛选？,二、单克隆抗体的制备,2.,单克隆抗体的应用：,作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质，并与特异性结合,优点：准确、高效、简易、快速,在基础理论研究中具有重要意义,单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高、产量大,二、单克隆抗体的制备,用于,运载药物：制成,“,生物导弹,”,治疗疾病：主要用于癌症治疗,既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量。,生物导弹：,抗癌细胞的单克隆抗体,+,放射性同位素,+,化学药物或细胞毒素,。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）,二、单克隆抗体的制备,植物细胞工程与动物细胞工程的主要区别,植物细胞工程,动物细胞工程,技术手段,植物组织培养,植物体细胞杂交等,动物细胞培养、,动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等,分离细胞的酶,纤维素酶和果胶酶,胰蛋白酶,杂种细胞培养,离体细胞（脱分化）,愈伤组织（再分化）,根芽,植物体,原代培养,传代培养,（细胞株,细胞系）等,培养基成分,矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素等,葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等,二、单克隆抗体的制备,总结,两个过程,动物细胞培养过程,单克隆抗体制备过程,三个,“,一,”,一个诱导细胞融合的新方法灭活病毒,一个新细胞杂交瘤细胞,一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势,第一步：从一只小鼠体内提取,T,淋巴细胞，然后与骨髓瘤细胞诱导融合。,第二步：再用普通培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死去。,第三步：对上述经选择性培养的杂交瘤细胞直接在体外条件下做大规模培养，这样从细胞培养液中就可以提出破伤风杆菌单克隆抗体。,实验评价,1,、已注入过灭活破伤风杆菌的小鼠,2,、,B,淋巴细胞,3,、选择培养基,4,、必须经过专一抗体阳性检验,下面是某同学根据单克隆抗体技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案。指出不足之处。,点击此处添加标题文字,思考与探究,1.,植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合，动物细胞是两个体细胞直接融合。,点击此处添加标题文字,2.,哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的,B,淋巴细胞，,B,淋巴细胞能分泌相应的抗体以凝聚或杀死这些抗原，动物在免疫反应的过程中，每一种,B,淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌单一抗体的,B,淋巴细胞大量增殖。,B,淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种,B,淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性,-,在体外条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性抗体,课堂练习,1,科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（）,A.,经过免疫的,B,淋巴细胞,B.,没经过免疫的,T,淋巴细胞,C.,经过免疫的,T,淋巴细胞,D.,没经过免疫的淋巴细胞,A,2.,动物细胞融合的目的中最重要的是,-,（）,A.,克服远缘杂交不亲和,B.,制备单克隆抗体,C.,培育新品种,D.,生产杂种细胞,3.,动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较中，正确是（）,诱导融合的方法完全相同,B.,所用的技术手段基本相同,C.,所采用的原理完全相同,D.,都能形成杂种细胞,B,D,课堂练习,B,4,（,2004,年，全国）用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下列实验步骤中错误的是（）,A,将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的,B,淋巴细胞,B,用纤维素酶处理,B,淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞,C,用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的,B,淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,D,筛选杂交资金积累细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体,课堂练习,5.,关于单克隆抗体，下列叙述不正确的是,(),A.,可以制成诊断盒，用于疾病的诊断,B.,可以与药物结合，用于病变细胞的定向治疗,C.,可以利用基因工程技术生产,D.,可以在生物体内生产，不能体外生产,课堂练习,D,6.,单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和,B,淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）,淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞,B,淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞,A,B,C,D,C,课堂练习,7,、,动物细胞融合过程中所用的诱导剂,灭活的病毒，抗原性和感染力的有无是（,）,A.失去抗原性，具有感染力,B.具有抗原性，也具有感染力,C.失去抗原性，也失去感染力,D.具有抗原性，失去感染力,D,课堂练习,8,、,单克隆抗体是指（,）,A.单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体,B.单个B淋巴细胞增殖产生的抗体,C.单个杂交瘤细胞增殖产生的高度单一的抗体,D.单个抗体通过克隆化，产生大量抗体,C,课堂练习,9,、,“生物导弹”是指（,）,A.单克隆抗体 B.杂交瘤细胞,C.产生特定抗体的B淋巴细胞,D.在单克隆抗体上连接抗癌药物,D,课堂练习,10.,下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案,2,、该方案能达到预期效果吗？为什么？,4,、图中,B,为,_,过程，常用,_,作为诱导剂，该细胞继承,_,的遗传特性，既能,_,又能,_,。,1,、该实验方案的目的是,_,3,、,A,是从小鼠的脾脏中取得,_,该细胞能够产生,_,5,、,C,过程指细胞培养，该过程包括,_,培养和,_,培养两个阶段，其中,_,代以内的的细胞属于细胞株。,制备单克隆抗体,B,细胞,抗体,细胞融合,灭活的病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,B,体外培养,骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞,足够数量的细胞群,注射到,小鼠腹腔,A,C,没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生单一抗体的,B,淋巴细胞,.,11,、下图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。,（,1,）,_,技术是单克隆抗体技术的基础。,（,2,）根据培养基的用途分类，图中,HAT,培养基属于,_,培养基。,（,3,）单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是,_,。,（,4,）动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用的诱导剂外，还可以采用,_,。,（,5,）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的,_,特点，又具备淋巴细胞的,_,特点。,（,6,）淋巴细胞是由动物体,_,中的,_,细胞分化、发育而来。,（,7,）杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是,_,。,动物细胞培养,选择,特异性强,灵敏度高,灭活的病毒,在体外大量增殖,分泌特异性抗体,骨髓,造血干细胞,主动运输,12.,下图是单克隆抗体制备过程示意图，据图回答：,（,1,）图中,A,过程是从小鼠的脾脏中取得,_,细胞，该细胞能够产生,_,。从小鼠体内提取分离该细胞之前，应给小鼠注射,_,类物质。,（,2,）,B,过程是一个,_,过程，该过程的进行需要灭活的,_,或,_,的诱导。,B,抗体,抗原,细胞融合,病毒,聚乙二醇,点击此处添加标题文字,13.,现有,A,和,B,两个肉牛品种，,A,品种牛的细胞组成可表示为,A,细胞核、,A,细胞质，,B,品种牛则为,B,细胞核、,B,细胞质。,（,1,）如果要获得一头克隆牛，使其细胞由,A,细胞核和,B,细胞质组成，基本步骤是，从,A,品种牛体内取出体细胞，进行体外培养。然后再从培养细胞中取出,_,注入,B,品种牛的,_,卵母细胞，经过某处刺激和培养后，可形成胚胎，该胚胎被称为,_,，将该胚胎移入代孕母牛的,_,中，通过培育可达到目的。,（,2,）一般来说，要想大量获得这种克隆牛比较难，原因之一是卵母细胞的数量,_,，为解决这一问题，可以用,_,激素处理,B,品种母牛。,细胞核,去核,重组胚胎,子宫,不足,促性腺,（,3,）克隆牛的产生说明,_,_,具有全能性。克隆牛的性状主要表现,_,_,品种牛的特征。由,A,、,B,两品种杂交得到的牛与克隆牛相比，杂交牛细胞核的遗传物质来自,_,个亲本，细胞质来自,_,性亲本，克隆牛和杂交牛的遗传物质组成,_,（相同，不同）,动物体细胞核,A,两,雌,不同,14.,回答下列有关动物细胞培养的问题：,在动物细胞培养过程中。当贴壁细胞分裂生长到细胞表面,时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的,。此时，瓶壁上形成的细胞层数是,。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是,。,随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现,现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成,细胞，该种细胞的黏着性,，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量,。,现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是,。,相互接触,接触抑制,单层（或一层）,胰蛋白酶,衰老甚至死亡,不死性,降低,减少,由于活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不能着色（或由于死细胞的膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色）,检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到,期的细胞用显微镜进行观察。,在细胞培养过程中，通常在,条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中,的活性降低，细胞,的速率降低。,给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作,进行攻击。,中,冷冻（或超低温、液氮）,酶,新陈代谢,抗原,16.,1975,年，英国剑桥大学分子生物学实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细胞，实现在体外大量生产抗体的目的。实验过程如图所示。,(1),淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能,“,融合,”,在一起，说明细胞膜,。,(2),单克隆抗体的准确定义应为,(),A,一类特殊抗体,B,无性繁殖系,C,单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体,D,单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体,(3),杂交瘤细胞繁殖进行的是,_,分裂，其遗传性状,_,。,(4),单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原,(,病原体或癌变细胞等,),并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为,“,生物导弹,”,这是利用了,_,。,具有一定的流动性,C,有丝,不变,抗体能与抗原发生特异性结合的特点,点击此处添加标题文字,克隆：又称,“,无性繁殖系,”,。遗传组成完全相同的分子、细胞或个体及其组成的一个群体。则指个体、细胞、基因等不同水平上的无性增殖物。,（,1,）个体水平：在植物的无性增殖中，植物的发芽、插条等由同一个体通过无性生殖而增长的个体群均被视为克隆。采用,组织培养,方法可使,植物细胞培养,发育成完全的个体（,愈伤组织,），采用这种方法得到的具有相同,基因型,的个体群，也被称为克隆；在动物的无性增殖中，典型的例子是采用,核移植,实验方法，把分化细胞的核移植到一个事先去核的蛙卵中，让其发育并得到克隆蛙。克隆动物具有均一遗传性质，,2,）细胞水平：由一个细胞经过有丝分裂生成的,细胞群,叫克隆。,（,3,）基因水平：利用基因重组操作技术，使特定的基因与,载体,结合，在细菌等,宿主,中进行增殖，有可能得到均匀的基因群。,