丹溪痛风加减方对MSU致家兔急性痛风性关节炎的防治作用.doc

丹溪痛风加减方对MSU致家兔急性痛风性关节炎的防治作用
李宝龙，韩玉生，刘旭，周忠光*
(黑龙江中医药大学, 哈尔滨　150040)

摘要　目的: 观察丹溪痛风加减方对微晶型尿酸钠(MSU)诱导的兔急性痛风性关节炎的防治作用,并探讨其可能作用机制。方法:采用MSU诱导家兔痛风性关节炎模型,在致炎5 h后对关节液进行白细胞计数,并测定其细胞因子和炎症因子含量,同时进行病理组织学检查。结果: 丹溪痛风加减方高中剂量灌胃可显著降低兔关节液白细胞数以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α),前列腺素E2(PGE2),IL-1β,IL-8水平,减轻关节及软组织水肿和炎细胞浸润、变性坏死。结论: 丹溪痛风加减方能明显改善MSU诱导的兔痛风性关节炎,其机制可能是抑制炎症细胞趋化和激活,抑制炎症因子、细胞因子的合成与释放。
关键词:丹溪痛风加减方;痛风性关节炎;微晶型尿酸钠;细胞因子
1　材料
1.1　药物与试剂　
丹溪痛风加减方（苍术、黄柏、防己、威灵仙、制南星、泽泻、车前子各15g, 川芎、桃仁、红花、羌活、桂枝各10g, 土茯苓25g, 萆薢20g），水煎浓缩2g/ml浓度待用,临用前用0.8% CMC-Na稀释。
秋水仙碱片,昆明制药集团,批号20071051；尿酸,Sigma公司产品;IL-1β,IL-8 ELISA检测试剂盒,武汉博士德产品； TNF-α 、PGE2放免试剂盒,北京东亚。
1.2　动物　
雄性家兔,体重(2-3)kg,购于黑龙江中医药大学动物试验中心。在实验室正常饲养1周后进行试验。
1.3　主要仪器　FA2004型电子天平(上海精密仪器厂); BIO-RAD550型酶标仪(美国伯乐公司)。
2　方法
2.1　尿酸钠结晶及尿酸钠溶液的制备[1]　
取2 g尿酸加入400 mL沸水中,用1 mol/LNaOH溶液调pH值至7.4,再加热至95℃,室温冷却并轻轻搅拌,4℃放置4-6h过滤,得微晶型尿酸钠,80℃灭菌。用前称取1000 mg尿酸钠,充分研磨,加无菌生理盐水20 ml配成50 g/L的混悬液。
2.2　动物给药与造模　
雄性家兔,随机分6组(n=8):正常组,模型组, 丹溪痛风加减方高、中、低剂量组(12,6,3 g/kg),灌胃给药,每天1次,连续7d;对照组给等量的0.8%CMC-Na溶液:阳性对照组(秋水仙碱0.3 mg/kg),从第4天开始ig给药,末次给药1 h后,除正常组关节腔注射无菌生理盐水外,每只家兔右侧膝关节腔内注射0.5 mlMSU(50 g/L)混悬液致炎。
2.3　关节液白细胞计数及炎症因子、细胞因子的测定　
收集关节液,进行白细胞计数。IL-1β,IL-8含量检测按ELISA法试剂盒说明书进行;TNF-α,PGE2采用放射免疫测定法。
2.4　关节及周围软组织病理学检查　
取关节囊、滑膜组织,10%福尔马林溶液固定、梯度酒精脱水,常规石蜡包埋切片,HE染色,光镜观察关节囊及滑膜组织病变。
2.5　统计方法　
所测数据用(x±s)表示,统计学处理采用SPSS11.0统计软件包,组间比较采用t检验。
3　结果
3.1　对关节液白细胞计数及TNF-α和PGE2水平的影响　
造模后,兔关节液中白细胞数量明显增加,提示出现急性炎症反应;与模型组比较,高、中、低剂量组和秋水仙碱组兔关节液中白细胞数量明显减少(P<0.01)。见表1。
表1　对关节炎关节液白细胞计数的影响(x±s,n=8)
组 别
剂量(g/kg)
白细胞计数(109/L）
正常组
模型组

高剂量组
中剂量组
低剂量组
阳性对照组
-
-
12
6
3
0.0003
1.56 ±0.46★
6.21 ±0.42
3.14 ±0.54★
4.21 ±0.73★
4.56 ±0.34★
3.21 ±0.42★
注:与模型组比较,▲P<0.05,★P<0.01
造模后,模型组兔关节液中TNF-α和PGE2水平均明显增加;与模型组比较,秋水仙碱组和高,中剂量组TNF-α和PGE2显著降低(P<0.05或P<0.01)。见表2。
表2　对关节液中TNF-α和PGE2水平的影响(x±s,n=8)
组 别
剂量(g/kg)
TNF-α(μg/L)
PGE2(μg/L)
正常组
模型组
高剂量组
中剂量组
低剂量组
阳性对照组
-
-
12
6
3
0.0003
16.7±3.6★
40.7±9.5
23.6±7.3★
29.5±5.8▲36.2±7.6
21.3±8.3★
9.3±3.4★
27.6±5.8
14.3±6.2★
18.3±4.2★
25.4±6.3
15.2±6.1★
注:与模型组比较,▲P<0.05,★P<0.01
3.2　对关节液中IL-1β和IL-8水平的影响　
造模后,模型组兔关节液中IL-1β和IL-8水平均明显升高;与模型组比较,高,中剂量组IL-1β和IL-8显著降低(P<0.05或P<0.01)。同时,秋水仙碱组IL-1β和IL-8均显著降低(P<0.01)。见表3。
表3　对关节液中IL-1β和IL-8水平影响(x±s,n=8)

组 别
剂量(g/kg)
IL-1β(μg/L)
IL-8(μg/L)
正常组
模型组
高剂量组
中剂量组
低剂量组
阳性对照组
-
-
12
6
3
0.0003
0.167±0.049★
0.372±0.057
0.251±0.072★
0.301±0.064▲0.348±0.069
0.247±0.043★
0.102±0.047★
0.425±0.034
0.321±0.042★
0.356±0.037▲
0.413±0.074
0.267±0.034★
注:与模型组比较,▲P<0.05,★P<0.01

3.3　对兔急性痛风性关节炎关节软组织及滑膜组织的影响　
正常组家兔关节软组织细胞未见异常表现;模型组关节软组织充血水肿,弥漫性白细胞浸润,滑膜坏死脱落。秋水仙碱组关节软组织有炎细胞,滑膜细胞变性,但结构基本完整。高,中剂量组关节周围软组织有炎细胞渗出,滑膜和软骨基本正常,低剂量组关节周围软组织见明显炎细胞浸润,滑膜及软骨细胞变性、坏死。
4　讨论
目前应用尿酸钠盐局部关节注射,已在多种动物体内成功地诱导出急性痛风性关节炎模型,其病理表现、机制与人类痛风关节炎相似, 被认为是经典的痛风性关节炎的造模方法，故可用于评价抗痛风性关节药物的药效[1-3]。
越来越多的证据表明痛风性关节炎的核心是中性粒细胞(PMN)介导的炎症, ,一般循环中PMN是非活化状态,必须在趋化因子和激活因子作用下被激活,继而侵入炎症组织引起组织损伤并在组织损伤中起重要作用。中性粒细胞依赖性急性炎症是急性痛风的中心环节。细胞因子能够介导细胞间信号传导,在免疫和炎症反应中起至关重要的作用。研究表明,IL-1β,IL-8,TNF-α作为炎症趋化因子和激活因子在痛风性关节炎的发生、发展过程中起重要作用,认为IL-1β,TNF-α是前炎症网链中的一级细胞因子,而IL-8是由IL-1β,TNF-α诱导的二级前炎症细胞因子[4-6]。
丹溪痛风加减方以《丹溪心法》上中下痛风方为基础, 去龙胆草、神曲、白芷, 易土茯苓、萆薢、泽泻、车前子。在临床上常以其进行组方用于治疗痛风、痛风性关节炎和类风湿性关节炎等，具有毒副作用小，复发率低，疗效确切等优点。
在本研究中,给药组家兔关节液中白细胞数量显著减少。造模5 h后,模型组兔关节液中IL-1β,IL-8和TNF-α, PGE2水平均明显升高,秋水仙碱组炎症因子、细胞因子均显著降低;丹溪痛风加减方高、中剂量组关节液中IL-1β,IL-8,TNF-α,PGE2水平显著降低。组织学检查表明丹溪痛风加减方可以显著抑制MSU引起的家兔关节炎性细胞因子的合成或释放,明显改善家兔关节病理损伤程度。
本研究结果提示, 丹溪痛风加减方能明显改善MSU诱导的兔痛风性关节炎,其机制可能是抑制炎症细胞趋化和激活,抑制炎症因子与细胞因子的合成与释放。
参考文献
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[4]　Terkeltaub R., Baird S., Sears P.,et al. The murinehomolog of the interleukin-8 receptor CXCR-2 is essential forthe occurrence of neutrophilic inflammation in the air pouchmodel of acute urate crystal-induced gouty synovitis[J].Arthritis Rheum,1998,41(5):900-909.
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[6]　Mastsukawa A.,Yoshimura T.,Miyamoto K.,et al.Anaysisof the inflammatory cytokine network among TNF-α,IL-1β,IL-1receptor antagonist, and IL-8 in Lps-induced rabbitarthritis[J].Lab Invest,1997,76(5):629.

*通讯作者简介：周忠光（1957-），教授，男（汉族），黑龙江哈尔滨市人，现任黑龙江中医药大学药物安全性评价中心主任，博士学位，博士生导师，主要从事中医药抗衰老的实验研究和中医药防治风湿疾病的实验研究。