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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一章 当代生物技术,一、当代生物技术定义与主要内容,生物技术,(Biotechnology or Bioengineering,）,:,对生物,有机体,（微生物至高等动、植物）或其,组成部分,（器官、组织、细胞或细胞器等），利用分子生物学、细胞生物学、生物化学、生物物理学、生物信息学等伎俩，研究、设计、改造，以,改良生物,乃至,创造新生物品种,一个技术体系。,生物技术制药专业专家讲座,第1页,当代生物技术包含四个方面：1,）,基因工程：,生物遗传物质,核酸,分离、提取、体外剪切、拼接重组以及扩增与表示等技术。,（,2,）,细胞工程：,细胞（也包含器官或组织）离体培养、繁殖、再生、融合及细胞核、细胞质及染色体与细胞器（如线粒体、叶绿体等）,移植与改建,等操作技术。,生物技术制药专业专家讲座,第2页,（,3,）,酶工程：,利用酶，借助,固定化、生物反应器和生物传感器等,新技术、新装置，高效优质地生产特定产品技术。,（,4,）,发酵工程（微生物工程）：,给微生物提供最适宜发酵条件以生产特定产品技术。,生物技术制药专业专家讲座,第3页,生物技术依据和出发点：生物有机体种种,机能,，是生物在生长、发育与繁殖过程中进行物质合成、降解和转化能力（即利用其新陈代谢能力），,反应器、代谢反应、酶、特定遗传基因,关键基础：,基因工程和细胞工程,“,工程菌株,”,或,“,工程细胞株,”,使酶工程或发酵工程生产出更多、更加好产品，发挥出更大经济效益。,酶工程和发酵工程,当代生物技术产业化，尤其是发展大规模生产,最关键步骤,。,生物技术制药专业专家讲座,第4页,二、当代生物技术优越性,（一）,不可取代性,植物品种改良 杂交育种,基因工程改良品种,基因资源起源可不受限制,牛,(,猪,),生长激素基因,鱼,生长、发育快，体重速增,人,血红蛋白基因,猪,体内,生产人血红蛋白，分离，可作为人血液替换物。,生长激素释放抑制因子,（抑制生长激素不合时宜分泌，“肢端肥大症”特效药）,50,万个羊脑,5mg,样品，化学法,300,多美元,/5mg,基因工程,7.5,升大肠杆菌发酵,5mg,成本几十美分。,生物技术制药专业专家讲座,第5页,（二）,快速、准确,试剂盒 有效早期诊疗（遗传病、病毒引发,疾病和癌症等）。,McAb,检验妇女妊娠,比用,抗血清法,检验提升了灵敏度，,怀孕后,8,天,得知，准确率,100,生物技术制药专业专家讲座,第6页,（三）,低耗、高效,“酶”催化化学效应，无需高温、高压和强酸碱等大大降低能耗成本、能耗。,例：,L-,苹果酸生产（生物技术）,产氨短杆菌 搜集菌体固定化细胞,L-,苹果酸,原理：延胡索酸,L-,苹果酸,成本比化学合成降低几十倍。,人生长激素（治疗侏儒病）,一个患者每年需用量,50,个死人垂体中提取,基因工程生产 价格为,1,4,提取，不需依赖死人脑。,生物技术制药专业专家讲座,第7页,（四）,副产物少、不良反应小、安全性好,疫苗生产,常规方法 用血液，成本高，可带来病毒感染危险性。,当代生物技术 用大肠杆菌,如乙肝疫苗，凝血因子等大大改进使用安全性。,生物技术制药专业专家讲座,第8页,2.“,生物导弹”,McAb,接抗癌药品体内,McAb,只与该肿瘤细胞特异性结合抗癌药品专一、靶向到肿瘤细胞,小鼠免疫球蛋白,McAb,免疫球蛋白分子中含有些人免疫球蛋白分子片段,三、当代生物技术在医药领域应用,（,）在疾病诊疗与治疗中应用,1.,单克隆抗体与疾病诊疗 妊娠试验,FDA,同意上市,McAb,产品,已经有几十种。,生物技术制药专业专家讲座,第9页,3.,基因诊疗,核酸分子杂交技术,80,年代中期,聚合酶链反应,（,polymerase chain reaction,PCR,）体外扩增基因方法,产前和症状前基因诊疗,:,苯丙酮尿症、珠蛋白合成障碍性贫血、假肥大型肌营养不良、甲型血友病、乙型血友病、成年型多囊肾、慢性进行性舞蹈病等遗传病,4.,基因治疗,因单一结构基因即编码蛋白质基因缺点所引发遗传病。,治疗,:,导入正常基因校正缺点基,因,引发,DNA,代谢异常及细胞突变使之恢复正常功效。,生物技术制药专业专家讲座,第10页,（二）未来医药卫生领域中生物技术展望,转基因动物生产“转基因药品”,1978,年 把人,tPA,基因转入小鼠受精卵发育成转基因小鼠并证实在其乳汁中能得到,tPA,美国,DNx,企业“制药工厂”转基因猪,环球基因药品企业 转基因奶牛,基因酶企业,转基因山羊,英国药品蛋白企业,转基因绵羊,“转基因药品”与基因工程药品相比,产量高，成本低,含有与人体本身产生蛋白相同生物学活性。乳腺细胞能进行一系列翻译后修饰作用，包含糖基化作用等，正确地产生人体蛋白。,生物技术制药专业专家讲座,第11页,2.,人型,McAb(monoclonal antibody),制备,技术路线：,鼠型,McAb,分子中更换一段人抗体分子中与抗原结合链段（用蛋白质工程方法）；,从人鼠杂交瘤细胞中直接克隆人抗体基因，并使之在细菌中得到表示；,将人免疫球蛋白重链,C,区基因转入小鼠受精卵，发育成转基因小鼠，用特定抗原免疫得人型化,McAb,。,3.,基因治疗 “基因打靶”技术,将外源基因定点整合到细胞基因组某一确定位点上，因而能对缺点基因进行原位修复。,生物技术制药专业专家讲座,第12页,聚合酶链反应及其它不停涌现分子生物学新技术,将得到广泛应用。,在细菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等不一样细胞内能得到高效表示载体,将不停地构建成功，大幅提升基因工程生产效率生物技术后处理工程和蛋白质工程,将快速发展,有目标地修饰、改造乃至重新组建,4.,生物技术各个步骤,生物技术制药专业专家讲座,第13页,第一节 生物药品,(biopharmaceutics),一、概念,利用,生物体及其成份,综合利用生物学、生物化学、微生物学、生物组织免疫学、物理化学、药学原理、方法加工制造,预防,诊疗疾病制品,治疗,第二章 生物药品与生物技术药品概述,生物技术制药专业专家讲座,第14页,（一）按起源和制造方法,1.,动物起源 动物脏器 资源丰富,家畜：猪、马、牛、羊,家禽：鸡、鸭,海洋生物：海带、鲨鱼、海蛇,二、分类,生物技术制药专业专家讲座,第15页,2.,微生物起源发酵法,优点：,1,）微生物及其代谢物资源丰富、开发潜力大,2,）培养、繁殖快、产量高、成本低，,便于大规模工业生产，,不受原料、运输、保留、季节和资源供给影响,3,）生产生物药品可综合利用,代谢物和菌丝体,;,诱变选育良种,;,加入前体培养法,4,）体内酶转化作用，使复杂、难反应能专一、快速,生物技术制药专业专家讲座,第16页,4.,化学合成,氨基酸、多肽、核酸降解物及其衍生物、维生素、激素,结构改造以高效，长期有效和高专一性,3.,植物起源,植物中蛋白质、多糖、脂类、核酸等,生物大分子研究和利用,生物技术制药专业专家讲座,第17页,5.,当代生物技术产品,基因工程技术生产重组活性多肽,活性蛋白质类,基因工程疫苗,McAb,各种细胞生长因子,利用转基因动、植物生产生物药品,利用蛋白质工程技术改造天然蛋白质创造自然界没有而功效上更优良蛋白质类生物药品,生物技术制药专业专家讲座,第18页,生物技术药品,（基因工程药品，,Biotech Drugs,）,:,以,DNA,重组技术（包含基因工程技术、蛋白质工程技术）生产蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子类药品。,细胞因子干扰素类：,IFN-,、,IFN-,和,IFN-,。,IFN-,有,lb,，,2a,，,2b,等,2.,细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子类：,IL-2,和突变型白介素,-2,；,TNF-,和,TNF,受体。二、生物技术药品主要类型,第二节 生物技术药品,一、概念,生物技术制药专业专家讲座,第19页,3.,造血系统生长因子类,：,粒细胞集落刺激因子（,G-CSF,）、巨噬细胞集落刺激因子（,M-CSF,）、巨噬细胞粒细胞集落刺激因子（,GM-CSF,）、红细胞生成素（,EPO,）、促血小板生成素（,TPO),、干细胞生长因子（,SCF,）等。,4.,生长因子类：,促进细胞生长、组织再生和创伤治疗。,胰岛素样生长因子（,ICF,）、表皮生长因子（,ECF,）、血小板衍生生长因子（,PDGF,）、转化生长因子（,TGF-,与,TGF-,）、神经生长因子（,NGF,）及各种神经营养因子。,5.,重组蛋白质与多肽类激素：,人重组胰岛素（,Humulin,）、人生长激素（,rhGH,）、促卵泡激素（,FSH,）、促黄体生成素（,LH,）、绒毛膜促性腺激素（,HCG,）等。,生物技术制药专业专家讲座,第20页,6.,心血管病治疗剂与酶制剂：,心血管疾病和抗肿瘤治疗,因子、,水蛭素,、,组织纤溶酶原激活剂（,tPA,）,、尿激酶、链激酶、葡激酶、门冬酰胺酶、超氧化物歧化酶（,SOD,）、葡萄糖脑苷酶及,DNase,等。,7.,重组疫苗与单抗制品：,重组乙肝表面抗原疫苗（酵母）、乙肝基因疫苗（重组乙肝表面抗原疫苗、,CHO,细胞）、艾滋病疫苗和肿瘤疫苗等。,己开发,McAb,有,72,种，多用于治疗难治性疾病如预防移植物急性排斥、免疫性疾病和肿瘤等。,生物技术制药专业专家讲座,第21页,8.,基因药品：,应用于基因治疗目标,DNA,片段重组,药品。,基因治疗,:,将,外源基因,导入机体以到达治疗疾病目标。,遗传性疾病、肿瘤、艾滋病、囊性纤维变性、糖尿病和心血管病等。,我国已同意上市品：,IFN-,1b,（自研），,IFN-,2a,，,IFN-,2b,，,IFN-,，,IL-2,，,IL-2,125Ser,，,G-CSF,，,GM-CSF,，,SK,，,EPO,，,EGF,，,ECF,衍生物，,b-ECF,，胰岛素，,GH,，,TPO,，,TNF,衍生物，抗,IL-8,单抗乳膏剂，胸苷激酶基因工程细胞制剂，乙肝疫苗，痢疾疫苗等。,生物技术制药专业专家讲座,第22页,细胞,:,生物有机体形态结构和生命活动基本单位。,第三章 细胞工程技术概念,细胞工程：,以细胞作为研究对象，利用细胞生物学、分子生物学等学科原理与方法，按照人们意志设计改造细胞一些,遗传性状,，培育出新生物,改良,品种或经过细胞培养取得自然界中难以取得,宝贵,产品新兴生物技术,细胞培养、细胞融合、细胞重组和遗传物质转移等,生物技术制药专业专家讲座,第23页,第一节 细胞培养技术,细胞培养：,生物体内某一块组织，用酶消化法,分散,成单个细胞，接种至特定培养容器中并给予必要生长条件，使其在体外生长繁殖技术。,细胞生长所需培养条件：,1.,足够营养，,糖、氨基酸、维生素、无机盐等；,2.,生长环境，适当温度、,pH,值、无菌条件。,生物技术制药专业专家讲座,第24页,动物细胞培养：,先在无菌条件下用消化酶将组织分散成单个细胞，用培养基制成,细胞悬液,，使其在体外适当条件下生长繁殖技术。,一、动物细胞培养,细胞培养对象 单个细胞，,组织培养对象 组织块,（,0.5,1mm,），,器官培养对象 器官一部分或整个器官。,生物技术制药专业专家讲座,第25页,动物细胞分类：,（）动物细胞培养特征,贴壁依赖性细胞,贴壁 大多数动物细胞,非贴壁依赖性细胞,悬浮,血液淋巴细胞、肿瘤细胞、,杂交瘤细胞、转化细胞系,兼性贴壁细胞,附壁或悬浮,生物技术制药专业专家讲座,第26页,1.,原代培养,（,or,首次培养，,primary culture,）,胚胎或出生后几天幼龄动物脏器获取组织，,剪成小块 长宽,1mm,、厚约,0.5mm,，,胰酶消化分散，稀释成,210,5,710,5,ml,，,分装到培养瓶（板）于,37,CO,2,培养箱内培养。,原代培养细胞特点：离体时间短，普通具,二倍体遗传性状,，能很好地反应在体内生长情况,适适用作,药品测试和细胞分化,研究工具。,（二）动物细胞培养技术,生物技术制药专业专家讲座,第27页,2,传代培养,（,或继代培养，,subculture,）,将细胞悬液转接分装到,两个瓶中培养 传代培养。,分裂次数：正常细胞有限,普通人正常细胞可传代,50,60,次,有限细胞系,（,finite cell line,），,传代过程中可无限制生长繁殖细胞系,连续细胞系,（,continuous cell line,）或已确立细胞系 肿瘤细胞,生物技术制药专业专家讲座,第28页,（三）动物细胞培养营养条件,1.,培养基,1,）天然培养基 成份复杂、起源有限,血清、水解乳蛋白、胶原、胚胎浸液等。,主含蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素、其它对维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学活性不可缺乏未知因子，促进细胞,贴壁,、中和有毒物质以保护细胞。,动物血清：,缺点：起源困难，成份不确定，使得细胞生长过程不易检测控制。,生物技术制药专业专家讲座,第29页,水解乳蛋白,乳白蛋白水解产物,胶原,动物真皮（豚鼠、牛）或大鼠尾腱起源组织提取物,胚胎浸液,鸡胚和牛胚,生物技术制药专业专家讲座,第30页,特点：一定化学组成,主要组分：氨基酸、维生素、糖、无机盐、,其它一些辅助因子。,2.,合成培养基,依据天然培养基成份，人工设计模拟合成,RPMI-1640,、,DMEM,、,TC199,、,Eagle,s MEM,等。,只能维持细胞生存,(,基础培养基,),须补充部分天然培养基，,血清 普通为,10,20%,。,生物技术制药专业专家讲座,第31页,维持细胞,生长,所需激素和生长因子,胰岛素、生长激素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子,细胞,贴壁,或,铺展,所需细胞因子，,纤维粘连素、铺展因子、胎球蛋白等；,血清在培养液中主要作用：,提供,识别维生素、脂类、激素和金属,结合蛋白,，调整被结合物活力,白蛋白 与维生素、脂类、激素结合，将它们载入细胞,转铁蛋白 结合并传递铁离子，,结合蛋白与有毒金属或热原结合则可解除它们毒性；,细胞,生长,所需,脂肪酸与微量元素,磷脂质、胆固醇、前列腺素等，铜、锌等；,生物技术制药专业专家讲座,第32页,蛋白酶抑制剂,，使胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害；,起,缓冲,作用，确保培养液,pH,稳定。,不足：,成份复杂，含已知或未知成份，,研究激素、细胞因子及药品作用时，干扰,分析,；,产品生产 增加细胞培养后产物,提取,难度，或影响产品,质量,；,大规模培养,成本,过高。,生物技术制药专业专家讲座,第33页,消除因不一样,批次血清之间差异,而造成试验误差，确保试验结果准确性与稳定性；,降低血清中可能存在支原体、病毒所造成,污染,；,3.,无血清培养基,优点 与含有血清培养基相比,产品,分离纯化愈加轻易,，简化判定细胞工程产品程序；,起源稳定,，供给充分。,生物技术制药专业专家讲座,第34页,无血清培养基组成：,基础培养基,+,替换血清作用补充成份。,1,激素和生长因子：,激素胰岛素、胰高血糖素、生长激素等多肽激素,及孕酮、氢化可松、雌二醇等甾体类激素。,胰岛素调整和控制细胞内各种代谢路径，,加强糖原、蛋白质、甘油三酯及,DNA,合成。,生长因子表皮生长因子、神经生长因子、成纤维生长因子、血小板生长因子等。,补充成份种类：,生物技术制药专业专家讲座,第35页,2.,结合蛋白：,转铁蛋白增强细胞摄取和利用培养液中铁能力，,可结合有毒金属离子解除其毒性；,白蛋白与脂类、金属离子、激素等结合后能够增强其作用，刺激细胞增殖。,3.,贴壁和铺展因子：,惯用贴壁因子有纤维连结素、多聚赖氨酸、胶原，,血清铺展因子则是一个糖蛋白。,4.,低分子量营养因子和元素：主要有维生素,A,、抗坏血酸、,-,生育酚、硒等,生物技术制药专业专家讲座,第36页,（四）动物细胞培养环境条件,培养基，培养环境无毒无菌；适当温度、湿度、气体环境和,pH,值。,1.,培养环境无毒无菌：,动物细胞,体内 强大,免疫系统,，去除和抵抗病原体,免受侵害,体外培养 失去抵抗能力,确保环境无毒无菌,(,首要条件,),加双抗液,青霉素、链霉素,以抑制可能存在细菌和霉菌生长,生物技术制药专业专家讲座,第37页,2,温度哺乳动物细胞,35,37,，,动物细胞耐低温能力强于耐高温能力，,41,细胞严重受损，,4,细胞也能存活数日。,培养物,+,保护剂,二甲亚砜（,DMSO,）或甘油,-80,或液氮罐（温度可降至,-196,）,可长久保留。,3,渗透压：,哺乳动物细胞,260,320mOsm,kg渗透压可略低 培养过程中水分蒸发,渗透压,生物技术制药专业专家讲座,第38页,4,气体环境与,pH,：,普通为,95,空气,+,5%CO,2,，,O,2,参加三羧酸循环，产生能量供给细胞生长，,CO,2,细胞生长所必需成份，,细胞代谢产物，,维持培养液,pH,。,大多数细胞生长适宜,pH,是,7,.,2,7,.,4,NaHCO,3,细胞培养过程中不停释放出,CO,2,，使培养液变酸，,添加一定量,NaHCO,3,碳酸盐缓冲系统,维持培养液,pH,值相对稳定,生物技术制药专业专家讲座,第39页,（五）动物细胞种质保留与运输,超低温冰冻方法,长久保留,细胞冻存液中加入保护剂,DMSO,或甘油，将细胞密封保留于,-80,或,-196,液氮罐中。,1.,保护剂甘油或,DMSO,，,速渗透入,胞内结合,H,2,O,，降低冰点，延缓冻结过程，同时增加,胞膜对水通透性,，使,H,2,O,在冻结前迟缓透出胞外，降低胞内冰晶，降低因冰晶形成而造成胞损伤。,使用浓度 甘油,5,20,，,DMSO 5,10,。,影响细胞冻存质量原因：,生物技术制药专业专家讲座,第40页,DMSO,与甘油相比，作用更加快，膜通透性更强，抗冻伤能力也更强，细胞在,DMSO,中,30,秒即可到达细胞内外平衡（甘油需,2h,）,试验室普遍采取。,2.,细胞悬液冻存速度,:,降低冻存速度使冰晶尽可能在胞外形成，降低胞内冰晶形成降低对细胞伤害。,先缓降至一定温度，如,-30,，使胞外冻结，胞内脱水，再快速降温。,3.,冻存后用液氮超低温保藏,-150,-196,，,细胞全部理化活动均降至最低程度，或忽略不计,长久储存。,生物技术制药专业专家讲座,第41页,4.,细胞复苏时融化速度。,细胞冻存管,取出,快速升温,胞外结晶在短时间内融化,防止因迟缓融化而使水分渗透胞内再次形成冰晶对细胞造成伤害。,操作：取出后马上投入到,37,38,水浴。,生物技术制药专业专家讲座,第42页,大规模培养：,在人工条件下,高密度,大量培养特定动物细胞从而生产宝贵医药产品技术,是实现大规模生产关键技术。,产品：疫苗、激素、细胞因子、单克隆抗体等。,（六）动物细胞大规模培养,生物技术制药专业专家讲座,第43页,1.,培养基,与试验室培养基基本一致（除用无血清培养基外）。,无血清培养基中难生长细胞,采取渐适法驯化细胞,使适应于在无血清培养基中生长。,*无血清培养液中易出现细胞毒（与水中微量元素或有机物污染相关）,制备培养液须用,高纯水,，经,0.22,m,微孔滤膜,过滤除菌。,生物技术制药专业专家讲座,第44页,培养方法：悬浮培养，贴壁培养，贴壁,-,悬浮培养。,（,1,）悬浮培养,非贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞,气升式,生物反应器或,通气搅拌式,反应器,动物细胞 胞膜薄，娇嫩易碎，抗剪切能力弱,气升式反应器工作原理：经过气体上下循环起到供氧以及搅拌效果。,培养规模,5L,、,30L,、,100L,到,1000L,2,动物细胞大规模培养系统,而微生物可用搅拌式发酵罐,生物技术制药专业专家讲座,第45页,（,2,）贴壁培养（单层细胞培养）,贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞,转瓶（滚瓶）培养,培养瓶旋转使吸附在瓶壁上细胞,交替与培养液及空气接触,而增加细胞吸附面积。,优点：普遍适合用于大多数细胞培养，规模较易放大，轻易实现,罐流培养,(,及时放出陈旧培养液，补加新鲜培养液,),。,缺点：操作较为繁琐，传代或放大时需要用蛋白酶将其从瓶壁上消化下来。,生物技术制药专业专家讲座,第46页,（,3,）微载体培养,基本原理：将细胞附着在微载体表面，后置于培养液中悬浮培养，使细胞在载体表面单层生长繁殖。,商品微粒,:DEAE-,交联葡聚糖、二甲氨丙基聚丙烯酰胺（,Biocarrier,）及聚苯乙烯（,Biosilon,）等市售。,优点：细胞附着表面积增大；,细胞生长环境均一，条件易于控制；,取样及细胞计数简单；,细胞与培养液易于分离；,大规模培养只需对微生物发酵罐或气升式深层培养系统稍加改进即可；,适合于培养原代细胞、二倍体细胞株以及基因重组细胞。,生物技术制药专业专家讲座,第47页,（,4,）固定化包埋培养与微囊培养,固定化包埋培养,(,大载体培养,),用高分子材料将细胞包埋并制成固定化颗粒，在培养液中培养。,海藻酸钙包埋,:细胞溶液与海藻酸钠溶液混合，经过喷珠装置将其喷入氯化钙溶液,直径约,2.6mm,固定化颗粒,，去除氯化钙溶液，通入培养液培养。,海藻酸钠分子中含有重复排列葡糖醛酸和甘露糖酸与钙离子作用后形成网络状凝胶珠，而将细胞包埋于其中。,生物技术制药专业专家讲座,第48页,微囊培养,：,细胞包被在薄半透性膜中,采取海藻酸钠包埋细胞制成固定化凝胶颗粒，,再用长链氨基酸聚合物、多聚赖氨酸包被形成坚韧、多孔可通透外膜。,液化胶化小珠，使其成胶物质从多孔膜流出，活细胞或生物活性物质留在多孔外膜内，,置气升式培养系统中进行增殖。,生物技术制药专业专家讲座,第49页,（,5,）中空纤维培养,数千根中空纤维封存于特制圆筒里，组成一个中空纤维培养系统。,“,内室,”,灌流无血清培养液供细胞生长；,“,外室,”,细胞贴附于管壁上，吸收从,“,内室,”,渗透出来养分，快速生长繁殖。,单抗等细胞分泌大分子量物质只能留在外室，且不停被浓缩。,搜集产物 打开,“,外室,”,总出口,代谢废物为小分子物质，渗进内室，从其出口流出，不对外室细胞产生毒害,生物技术制药专业专家讲座,第50页,优点：,培养器体积小，细胞密度高；,产物浓度高、纯度高；,自动化程度高，细胞生长周期长。,缺点：价格较贵。,（,5,）中空纤维培养,生物技术制药专业专家讲座,第51页,第二节 细胞融合,离体条件下用人工将两或多个不一样种细胞经过无性方式融合成一个杂合细胞过程,融合后细胞含两或多个不一样细胞核（异核体），随即细胞有丝分裂中，有些不一样胞核染色体合并到一个核中,单核杂种细胞，而不能形成单核融合细胞在培养过程中逐步死亡。,细胞融合,(,体细胞杂交,):,法国,Barski 1960,年,过程：细胞在,促融因子,作用下发生凝集现象，胞间质膜粘连，细胞融合，在培养过程中核融合,杂种细胞。,生物技术制药专业专家讲座,第52页,1,）细胞准备 贴壁培养细胞，两亲本细胞混合培养,悬浮细胞 制成一定浓度悬液；,2,）诱导融合 需要添加促融剂诱导融合；,一、动物细胞融合,小鼠和田鼠，小鼠和小鸡，小鼠和人 远缘和超远缘体细胞杂交。,1,、动物细胞融合基本过程,3,）杂种细胞选择 利用选择性培养基，使亲本细胞死亡而让杂种细胞存活；,4,）杂种细胞克隆 选择与,纯化,杂种细胞，再经,培养,得所需要无性繁殖系。,生物技术制药专业专家讲座,第53页,2.,促融剂,（,1,）病毒：仙台病毒,(,灭活,),两种不一样动物细胞混合物中存在大剂量病毒,即细胞周围充满病毒，病毒或其组分在细胞间起粘连作用使细胞聚集成团,不一样胞膜蛋白及膜脂质分子重新排布而结合成一个整体。,诱导细胞融合关键,使细胞膜蛋白重新分布,膜中脂质分子重排,生物技术制药专业专家讲座,第54页,（,2,）,PEG,诱导：当不一样种属动物细胞混合液中存在,PEG,时即产生细胞凝集作用，在稀释和除去,PEG,过程中即产生融合现象。,原理：脱水作用,细胞凝集，使膜结构改变，,改变膜表面电荷或膜电位,膜蛋白颗粒聚集及脂层分子重排所致。,特点：使用简便、结果稳定、诱导融合率较高等,选取：分子量,1000,4000,，浓度,30%,50,生物技术制药专业专家讲座,第55页,（,3,）电场脉冲：,将两种细胞混合液经,10,100V,cm,低强度非均匀,交变电场,作用，极化成,偶极子,而相互吸引紧密接触排列成串，此时对该状态细胞施加,瞬时高强度电脉冲,，普通击穿电压为,0.5,10kV,cm,，作用时间为,30,50,s,，细胞之间形成稳定膜连接（可逆性电击穿），不一样细胞间膜脂质分子重排而合并成一个双核或多核细胞。,融合率高，可控性好。,生物技术制药专业专家讲座,第56页,3.,杂种细胞筛选,融合后细胞（五种）,异型融合细胞（双核和多核）、,两种同型融合细胞（双核和多核）、,未发生融合两种亲本细胞。,（,1,）筛选原理,筛选目标：获遗传性状比亲本细胞更优良杂种细胞。,筛选原理：在培养过程中利用,选择性培养基,，杀死四种类型细胞。,生物技术制药专业专家讲座,第57页,（,2,）选择系统,惯用：,HAT,选择系统、抗药性选择系统及营养缺点型选择系统。,HAT,选择系统：,含一定数量,次黄嘌呤,（,H,）、,氨基蝶呤,（,A,）、,胸腺嘧啶核苷,（,T,）选择性培养基。,DNA,为绝大多数生物遗传物质。嘌呤核苷及嘧啶核苷是,DNA,主要组成部分，是细胞生长必需成份。,生物技术制药专业专家讲座,第58页,补救合成路径：细胞从培养液或本身代谢产物中吸收游离嘌呤或嘧啶合成,DNA,。,正常细胞中,DNA,合成路径,全合成路径：细胞利用简单外源性小分子物质从头合成路径；,生物技术制药专业专家讲座,第59页,图 细胞中,DNA,合成路径,生物技术制药专业专家讲座,第60页,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺点型（,HPRT,-,）细胞,嘧啶 全合成,+,补救合成,嘌呤 全合成,胸腺嘧啶核苷激酶缺点型（,TK,-,）细胞,嘌呤 全合成,+,补救合成,嘧啶 全合成,惯用亲本细胞：酶缺点型细胞,不能分裂淋巴细胞。,HPRT,-,及,TK,-,细胞无嘌呤或嘧啶补救合成路径,全合成 需甲基（胞中由,二氢叶酸还原酶,作用而生）,DNA,合成两条路径均受抑制，亲本细胞（,HPRT,-,及,TK,-,）在培养过程中死亡。,含,氨基蝶呤,培养基,生物技术制药专业专家讲座,第61页,细胞融合物在,HAT,培养基上选择结果图,生物技术制药专业专家讲座,第62页,同一药品 对不一样种类细胞作用差异。,一个亲本细胞对,A,药品敏感，而对,B,药品不敏感；,另一个亲本细胞对,B,药品敏感，而对,A,药品不敏感。,一定量,A,、,B,于培养液中培养细胞,两种亲本细胞被杀死，融合细胞存活，,抗药性选择系统：,生物技术制药专业专家讲座,第63页,营养缺点型筛选：,有些细胞在一些营养物（如氨基酸、糖、嘌岭、嘧啶或维生素等）合成能力上出现缺点,难在缺乏这种营养成份培养基中存活（该营养营养缺点型细胞）。,亲本细胞 色氨酸缺点型，,苏氨酸缺点型，,选择性培养基中不加入色氨酸和苏氨酸,只有,融合所形成杂种细胞才能生长。,生物技术制药专业专家讲座,第64页,4.,杂种细胞表型,杂种细胞（与亲本细胞相比）在遗传表型上改变：,）,互补作用：,两亲本细胞一些生物学特征在杂种细胞中共同表示现象。,免疫淋巴细胞 分泌抗体，体外培养不能生长；,小鼠骨髓瘤细胞 体外生长。,杂种细胞 既体外生长又分泌特定抗体。,生物技术制药专业专家讲座,第65页,）激活作用：某一亲本细胞,不活动基因,在杂种细胞中被激活现象。,HPRT,-,及,HPRT,+,人细胞分别与,HPRT,-,小鼠细胞杂交，,两种杂种细胞 均显示出正常小鼠,HPRT,酶活性，,人细胞含有激活小鼠细胞,HPRT,基因作用。,生物技术制药专业专家讲座,第66页,）消失作用：亲本,某一或一些性状,在杂种细胞中消失现象。,金黄色仓鼠黑色素瘤细胞 很高多巴氧化酶活性，可催化酪氨酸形成黑色素，,但与不产生黑色素小鼠成纤维细胞融合杂种细胞 不产生黑色素,表明多巴氧化酶基因在杂种细胞中被抑制而呈隐性。,生物技术制药专业专家讲座,第67页,）激活与消失作用：杂种细胞中出现同一亲本细胞某一些非活动基因被激活，而另一些遗传性状同时消失现象。,小鼠胚胎发育早期胸腺细胞能表示,t,12,抗原，但成年后不表示,t,12,抗原而表示,H-2,抗原，,说明其带有,t,12,和,H-2,两种抗原基因，但在不一样发育阶段不一样基因之间表示存在差异。,当成年小鼠胸腺细胞与,小鼠胚胎性癌细胞,融合所形成杂种细胞中，,H-2,抗原基因呈隐性，而,t,12,抗原基因呈显性。,生物技术制药专业专家讲座,第68页,两种亲本细胞遗传物质融合在一个细胞中后，一些遗传物质经过一段时间后可能会逐步消失，其结果是由该基因所控制性状也就随之消失。,遗传物质即使存在，但在杂种细胞中能够表现出其基因性状（显性），也可能不表现出其基因性状（隐性）。,生物技术制药专业专家讲座,第69页,细胞重组：,在体外条件下利用一定试验技术从,活细胞中分离出各种细胞结构或组成“部件”，,再把它们在不一样细胞之间,重新进行装配,，而得到新生物活性细胞。,第三节 细胞重组,（,cell econstruction,）,一、核移植技术（,nuclear transplantation,）,借助显微操作仪，利用,微吸管,将一个细胞细胞核吸出并移植到另一个去核细胞中。,最初鱼类和两栖类动物,后扩展到高等哺乳动物小鼠和家养动物等,生物技术制药专业专家讲座,第70页,二、,细胞器移植,细胞器种类很多，分离与纯化也较轻易，不过研究较多是叶绿体和线粒体移植。,（一）,叶绿体移植：,叶绿体 进行光合作用，把太阳能转变为化学能。,高光合效率,作物叶绿体转移到,低光合效率,作物中,增产。,叶绿体移植方法：,将分离纯化叶绿体与原生质体一道培养，经过细胞,胞饮作用,将叶绿体摄入原生质体，经过培养，原生质体再发育成完整植株,生物技术制药专业专家讲座,第71页,（二）,线粒体移植：,线粒体有自己遗传基因，能够合成一些蛋白质。,线粒体移植，可传递遗传信息，改变受体细胞一些特征，如抗药性和雄性不育性等。,移植方法：微注射、载体转移、胞饮摄入等。,生物技术制药专业专家讲座,第72页,第四节 单克隆抗体技术,外源性物质侵入人体或动物体时,免疫反应。,即，,B,淋巴细胞激活、增殖、分化成浆细胞,抗体（体液免疫）（血清、体液、外分泌液）。,取得一定特异性抗体经典方法：,用抗原免疫动物（如兔、马、羊、鼠等），从其血清中进行分离。,多个抗原表位（决定簇）,针对各种抗原表位混合抗体（多克隆抗体）。,生物技术制药专业专家讲座,第73页,缺点：,1,、抗体不均一，特异性差，效价低，用于检测会影响检测准确性和灵敏度；,2,、成熟能分泌抗体淋巴细胞寿命很短，普通只有几天，抗体产量有限，无法实现大规模生产。,生物技术制药专业专家讲座,第74页,骨髓瘤（恶性肿瘤）细胞,体外培养、无限制繁殖，但不能产生抗体，,遗传表现型,HPRT,+,-TK,+HPRT,+,-TK,-,及,HPRT,-,-TK,+,免疫淋巴细胞 产生抗体，但不能在体外长久培养和,无限期繁殖，遗传表现型,HPRT,+,-TK,+,。,杂种细胞,产生抗体、体外长久培养、无限期繁殖（杂交瘤技术，杂交瘤细胞）,杂交瘤细胞株 经体外培养分泌成份,单克隆抗体（,McAb,）,一、单克隆抗体及其特征,生物技术制药专业专家讲座,第75页,二、单克隆抗体制备过程,第一步用抗原免疫动物（如鼠）。,第二步脾细胞与骨髓瘤细胞融合。,第三步杂交瘤细胞筛选与克隆化。,第四步单克隆抗体大规模生产。,体外法转瓶或生物反应器,对杂交瘤细胞大规模培养并表示对应单抗,体内法动物体内培养杂交瘤细胞生产单抗,生物技术制药专业专家讲座,第76页,McAb,制备图,生物技术制药专业专家讲座,第77页,高纯度,单一抗体，在氨基酸序列及特异性方面均为一致，检测灵敏度极高；,可经过对杂交瘤细胞,大规模培养,进行生产；,McAb,优点：（与常规抗体相比）,杂交瘤细胞可用,液氮深冻法,进行长久保留；,可在分子水平上解析存在于病毒表面抗原或受体；,可用不纯抗原制备纯,McAb,。,生物技术制药专业专家讲座,第78页,缺点：,McAb,特异性太强，有时不能检出微生物突变株；,有时不能产生与抗原交联功效；,易受,pH,、温度、盐浓度影响，或亲和力较低、半衰期短；,制备程序复杂、工作量大。,生物技术制药专业专家讲座,第79页,疾病诊疗与治疗。纯度高、特异性强、易于大规模生产特点，用于临床疾病诊疗敏感性高、特异性强、检测结果重复性好，,血清学检测 取代常规多克隆抗体 免疫学诊疗。,已生产抗激素、抗病毒、抗细菌、抗寄生虫、抗肿瘤相关抗原等单克隆抗体，,体内激素或药品等微量物质测定、传染病与肿瘤诊疗等,三、单克隆抗体应用,生物技术制药专业专家讲座,第80页,疾病治疗 癌症治疗,结直肠癌、淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、白血病、前列腺癌、胰腺癌等，治疗类风湿性关节炎、,A,型糖尿病单抗。,与各种毒素（如白喉外毒素、篦麻毒素）、放射性元素或药品（如氨基蝶呤、阿霉素等）化学偶联制备成,靶向性药品,（,targetting drug,）肿瘤治疗,、用于生物活性蛋白分离与纯化。,目标蛋白单抗交联到溴化氰活化层析介质（如,Sepharose,）上，制成,亲和层析吸附剂,生物技术制药专业专家讲座,第81页,1,什么叫动物细胞工程？包含哪些内容？,2,动物细胞培养基分为哪几个类型？各有何特点？,3,何谓动物细胞原代培养与传代培养？各有何特点？,4,怎样控制动物细胞悬液冻存速度？,5,怎样控制动物细胞培养时气体环境与,pH,稳定,?,6,动物细胞大规模培养有哪些方法？各有何特点？,7,气升式生物反应器工作原理是什么？,8,叙述血清在细胞培养中作用及其不足。,9.,与含有血清培养基相比，无血清培养基有哪些优点？,10.,简述无血清培养基组成。,生物技术制药专业专家讲座,第82页,11.,微载体培养细胞法有哪些优点？,12.,中空纤维培养细胞有哪些优点？,13.,淋巴细胞杂交瘤形成原理是什么？简述其制备路线。,14.,什么叫单克隆抗体（,McAb,）？有哪些基本特征？,15.,什么叫细胞融合？其促融剂主要有哪些？,16.,叙述无血清培养基需补充成份及其作用。,17.,转瓶培养,细胞法有哪些优点？,生物技术制药专业专家讲座,第83页,单克隆抗体制备流程图,生物技术制药专业专家讲座,第84页,