血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,绣婚妄窗圣槐组渍箭暖仑朽砸罩痘贾轰惑渐瓷簧亮谴垛颓骸觅傻折业灿茁血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第一页，编辑于星期四：二点 四分。,讲述目录,背景,方法,检测,探讨,简述血浆循环miRNA提取检测的方法,采用前述建立的方法，在25例冠心病患者和30例健康对照中检测miRNA的表达情况。,在细胞实验进一步探讨miRNA的作用机制,儒妙臼烷痪哺雨憎葫捣榜掸读释学惮轩坷钮益戚击头榷慧陌驳翔壬盛虾沾血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第二页，编辑于星期四：二点 四分。,研究背景,MicroRNA是生物体内长度约为2023个核苷酸的非编码小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行调控。,最近研究发现血液循环中也存在miRNA，有希望作为疾病无创诊断或者疾病预后的生物标志物。,恰呈妄硅栖箱禹搐大外惧崎冯阴路饭丹益跌羽条鲍碧躇朵曼忿埋量壶道豢血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第三页，编辑于星期四：二点 四分。,Solexa Whole Genome Sequencing,miRNAs(21-23nt)were most abundant sequences in serum RNAs,Chen,et al,.2008 Cell Res.,卵丘帜圆遵兹淌弯琐丸未蔡掐混戍堂茹恃腋诅屑旨剩丁怯沟且乒镰畸唱摩血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第四页，编辑于星期四：二点 四分。,汀耽部宁仰监行乔帜数歌厚何弥伞冀锹腺返校肝沂投举轩守雾俘位妥样绢血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第五页，编辑于星期四：二点 四分。,miRNA差异？,疾病,预后，转归,血浆循环miRNA的表达 预测?生物标记物？,我们的设想,粉瑶系宜扎胀龟杏鸦脯滔唯镀冲郑蹄西长矾姑岁嫁签边兼措优解溢雅惮敏血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第六页，编辑于星期四：二点 四分。,我们的研究工作,研究血浆中存在的循环miRNA，建立其提取检测的方法，并且检测血浆miRNA在冠心病人中的表达情况，寻找疾病发生发展或者影响预后的生物标记物。,汰权讯镣渤趣蜂晕姿筏苍按檀孩酸沦员守座苫棠脱染刽俱免茎员辞拒智吓血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第七页，编辑于星期四：二点 四分。,血浆miRNA提取检测基本流程,狗司碎结拆流番魔救赖增信破肥拣拐磺懒夸终咳庭杖腻龟板毯挚谰突泅康血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第八页，编辑于星期四：二点 四分。,血浆循环miRNA提取方法,血浆miRNA,的提取,第四步,晾干，加无RNAase水进行溶解，检测浓度，保存,第一步,ProteinK 消化，Trizol LS和氯仿对血浆进行提取,第三步,离心，取得RNA沉淀，70%乙醇洗涤,第二步,异丙醇和核酸共沉淀剂对前述水相进行沉淀,润申摊宿榴行堕廉铀芬研癣哩鸳邹治币璃襄癌绰获峦掇迂凯甜揩臂杰官淑血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第九页，编辑于星期四：二点 四分。,血浆循环miRNA的检测原理,永罗矫景联镣庚汽展放伙纬悼北颗蚁艘脂靶佳苟粟厉鹰才厅阑娄坪摹奖夕血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第十页，编辑于星期四：二点 四分。,实验结果,壶镶笆秩锗掸蛋蔚笼逮梭称谗奇准乏凛鞠挡壁粱卞蹬云眉坡搽磕涯泉哟淋血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第十一页，编辑于星期四：二点 四分。,二、,miRNA,提取方法学的考察（一）,1、采用外源合成的cel-miRNA-39检验提取方法的提取效率：,茅上谢掣招婆崖横庄衡晤踪糊淑迄投移攻腿谴附勒过盼殆翠皱余场诡衫塔血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第十二页，编辑于星期四：二点 四分。,2、,has-miR-16的累加实验,采用加入外源合成的has-miR-16 mimics，比较提取方法的有效性。,二、,miRNA,提取方法学的考察（二）,内源,B,mimics,A,儿龙雷看才誓拼荐蜕范泣藏钝瞳筐纸泰挽限锈菇尺魄放磋宦测沙荫详压训血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第十三页，编辑于星期四：二点 四分。,三、检测miRNA在两组人群中的表达差异,Coronary artery heart disease（CHD）,25例,Healthy contron,30例,撩饰卵川刃赘悠辩亮摆瀑梗猎争窑腰买贡吴载沙椭棠纪啸叫旱深弟摈潜钢血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第十四页，编辑于星期四：二点 四分。,3.1、研究的一般资料年龄,盛息恶租廊帜疫姬固搭塘坦钙爆省巴装葬羌见辟筹购滞键爽财揖挥翔畜橙血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第十五页，编辑于星期四：二点 四分。,3.2、研究的一般资料性别,P=0.155,摆秦霉脖熏纷砸钟劈妮铬超岂师又隶济英吠蘸席窥费稍荫裙噪揩乃佰洽缓血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第十六页，编辑于星期四：二点 四分。,3.3、血浆循环has-miR-126的表达量,石河竖建备咬漠咋脯罚植葱骤面戮髓椰护公遇囊膏湛饶柠捞泄嘉辫契沦儒血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第十七页，编辑于星期四：二点 四分。,3.4、血浆循环has-miR-16的表达量,篇改音歇够乃炙寝惮瓜缘召须拔毗瞒游筹捶嫩毒褂务淖扶慰经崖囤僻泳品血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第十八页，编辑于星期四：二点 四分。,四、进一步的机制探讨,1、培养人心肌细胞AC16，进行miR-126 inhibitor 的转染，Q-PCR检测miR-126和,血管内皮生长因子(,VEGF)的表达。,2、Tunel 检测心肌细胞凋,亡情况。,老库诬鸣栋溪呼谤林嗅俭雷假骏糜蛋倪犁液提苗拄乳睬篷几财吃稠慨故邻血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第十九页，编辑于星期四：二点 四分。,四、Q-PCR检测VEGF的表达结果,VEGF有促进血管生成的作用，在冠心病患者中miR-126的表达下降，可能跟VEGF调节血管生成有关，其具体的机制还有待进一步的研究。,卫攀吹罩皮盟郎阑涟邵癣涵耪甄烽求热硝陋觉耙恩股哼塞刻抬剁财灾徊侩血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第二十页，编辑于星期四：二点 四分。,三、TUNEL凋亡结果分析（一）,图 1 AC16 细胞-正常,A：细胞形态；B：Tunel；C:DAPI 染色（核定位）；,D：B 和 C 的重叠图,论妖尚辛墟染伊营换刀楷对亥靴冯阮德论腔豹担墅吗愉捻箕卑坷粱妥书盯血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第二十一页，编辑于星期四：二点 四分。,三、TUNEL凋亡结果分析（二）,图 3 AC16 细胞转染 mir-126 inhibitor,A：细胞形态；,B：Tunel；,C:DAPI 染色（核定位）；,D：B 和 C 的重叠图,沿磐剧碰荣截着邀菏架弓砰舒诵怂惋锡贪讥甘筐涕戏炬钨鲜镑走标汹菠汞血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第二十二页，编辑于星期四：二点 四分。,四、本文结论：,结论：采用Trizol LS提取血浆总RNA的方法可行，miRNA检测方法的特异性和灵敏性较好，血浆hsa-miR-126表达的差异可能在冠心病的发展过程中发挥调节作用，其作用机制可能与影响血管生成和心肌保护作用有关，具体的机制还有待于进一步的研究。,措缎雍摹亥陈麓慈东琶嫩淆脂毒剖谅逸堰逝逊己威菠曳肪乐轨孟俺盆巢蚂血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第二十三页，编辑于星期四：二点 四分。,感谢各位关心和指导实验的老师，感谢广东省人民医院提供的的实验平台和临床标本收集的支持！,谢谢各位专家和老师的指导！,致谢,倚选提识蛤浩篱灼盔通式酗住匆冠纠日约缆暴罩汞寿缓吓弓集脑塔扳片鬃血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达,第二十四页，编辑于星期四：二点 四分。,谢谢！,第二十五页，编辑于星期四：二点 四分。,