中药制剂检测技术第六章中药制剂含量测定技术.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 紫外-可见分光光度法,第二节 薄层色谱扫描法,第三节 高效液相色谱法,第四节 气相色谱法,第五节 浸出物测定法,第六节 挥发油测定法,第七节 容量分析法,第六章 中药制剂的含量测定技术,高晓波、纪从兰老师编写,1.,定义,紫外,-,可见分光光度法（,Ultraviolet and Visible Spectrophotometry,）系指通过测定被测物质在紫外,-,可见光区,(200,760nm),对光的吸光度或发光强度，进行物质定性定量分析的方法。,2.,特点,设备简单、操作简便、灵敏度和准确度较高等。,3.,适用范围,中药制剂定性鉴别、杂质检查及含量测定。,一、仪器工作原理,（一）紫外,-,可见分光光度仪的构造,光源,单色器,吸收池,检测器,数据,处理,系统,1.,光源（辐射源,),（,1,）可见光光源：为热辐射光源，如卤钨灯、碘钨灯、钨丝灯（白炽灯）。,（,2,）紫外光源：多为气体放电光源，如氢、氘、氙放电灯及汞 灯等。,2.,单色器,是能从光源的复合光中分出测量所需波长单色光的光学装置。,（,1,）棱镜单色器：,有玻璃和石英两种材料。是依据光的折射率不同，而将其分成不同波长的单色光。,（,2,）光栅单色器：,是利用光的衍射和干涉作用制成的。可用于紫外、可见和近红外光谱区域，具有良好的、几乎均匀一致的色散率，且具有适用波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制作等优点，是目前常用的色散元件。缺点是各级光谱会重叠而产生干扰。,3.,吸收池,又叫比色皿。是用于盛放分析试液并提供一定吸光厚度的器皿。一台分光光度计配有几组厚度不同的吸收池，吸收池的大小规格从几毫米到几厘米不等，最常用的是,1,厘米的吸收池。,（,1,）石英池：,适用于可见光区及紫外光区。,（,2,）玻璃吸收池：,只能用于可见光区。,4.,检测器,是通过光电转换元件检测透过光的光通量大小，并将光信号转变成电信号的装置。,检测器应在测量的光谱范围内具有高的灵敏度；线性关系好、线性范围宽；对不同波长的辐射响应性能相同且可靠；有好的稳定性和低的噪音水平等特点。,（,1,）光电池：,常用的光电池有硒电池和硅光电池。,（,2,）光电管：,它以一弯成半圆柱且内表面涂上一层光敏材料的镍片作为阴极，而置于圆柱形中心的一金属丝作为阳极，密封于高真空的玻璃或石英中构成的，当光照到阴极的光敏材料时，阴极发射出电子，被阳极收集而产生光电流。,真空光电二极管,（,3,）光电倍增管：,光电倍增管是一种加上多级倍增电极的光电管，其外壳由玻璃或石英制成，阴极表面涂上光敏物质，在阴极、阳极间装有一系列次级电子发射极，,D,1,、,D,2,等。,光电倍增管工作原理图,5.,信号指示系统,是把检测到的信号以适当的方式显示或记录下来。常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。常用的显示方式有数字显示、荧光屏显示、曲线扫描及结果打印等多种。高性能的仪器还带有数据站，即可对分光光度计进行操作控制，又可进行数据处理。,（二）紫外,-,可见分光光度计的工作原理,1.,单光束分光光度计的工作原理,国产,722,型、,751,型、,724,型、英国,SP500,型以及,Backman DU-8,型等均属于此类光度计。,光学系统工作原理图,单波长双光束分光光度计原理图,2.,单波长双光束分光光度计的工作原理,仪器有国产,710,型、,730,型、,740,型等。,3.,双波长分光光度计的工作原理,紫外分光光度计（,200400nm,）、可见分光光度计（,400,800nm,）和紫外,-,可见分光光度计（,200,1000nm,）。,双波长分光光度计光路示意图,二、仪器操作通法,（一）操作通法,1.,仪器接通电源，预热。,2.,根据测定波长，选择相应光源，继续预热（各型号仪器在操作顺序上略有区别）。,3.,灵敏度钮置,1,档。,4.,将盛有供试品溶液及空白（参比）溶液的吸收池放入吸收池架，使空白（参比）溶液置光路位置，盖好供试品室盖。,5.,量程选择钮置,T,位置。,6.,断开光路调节仪器零点，使显示为,0,。打开光路调节仪器透光率，使显示为,100%,。,7.,量程选择钮置,A,位置。,8.,将供试品置于光路中，读取供试品的吸光度值。,9.,仪器使用完毕，取出吸收池，关机，登记。,10.,不同型号的紫外分光光度计其操作方法和要求亦有所不同，使用前应详细阅读使用说明书。,（二）注意事项,1.,量瓶、移液管及吸收池 均应经洗净、校正后使用。,2.,吸收池的校正,3.,吸收池使用方法 使用前的处理；吸收池使用；使用后的处理。,4.,狭缝宽度的选择,5.,吸光度的测定,6.,制剂含量的测定,三、含量测定,（一）基本原理,紫外,-,可见分光光度法的定量分析依据是朗伯,-,比尔定律。,数学表达式为：,A=KCL,A,为吸光度；,K,为吸收系数；,C,为溶液浓度；,L,为液层厚度。,吸收系数：百分吸收系数、摩尔吸收系数。,中国药典,采用百分吸收系数。,（二）操作步骤,1.,对照溶液品与供试品溶液的制备,2.,紫外可见分光光度计的校正,（,1,）波长准确度的校正,吸光度准确度的标准范围,波长（,nm,）,吸收强度,百分吸收系数,相对偏差范围,235,257,313,350,最小,最大,最小,最大,124.5,144.0,48.62,106.6,123.0,126.0,142.5,146.0,47.0,50.3,105.5,108.5,（,2,）吸光度的校正,铬酸钾溶液的吸光度,/nm,吸光度,A,/nm,吸光度,A,/nm,吸光度,A,/nm,吸光度,A,20,0.4559,310,0.1518,380,0.9281,460,0.0173,230,0.1675,310,0.0458,390,0.6841,470,0.0083,240,0.2933,320,0.0620,400,0.3872,480,0.0035,250,0.4962,330,0.1457,410,0.1972,490,0.0009,260,0.6345,340,0.3143,420,0.1261,500,0.0000,270,0.7447,350,0.5528,430,0.0841,280,0.7235,360,0.8297,440,0.535,290,0.4295,370,0.9914,450,0.0325,（,3,）杂散光的检查,杂散光的检查,试剂名称,试剂浓（,g/100ml,）,测定用波长（,nm,）,透光率（,%,）,碘化钠,亚硝酸钠,1.00,5.00,220,340,0.8,0.8,3.,选择测量条件,显色反应的条件、消除干扰物质的方法、测量波长、参比溶液、及测量波长、吸光度范围及仪器狭缝宽度的选择。,4.,进样测试,5.,含量计算,（三）含量测定的方法,1.,单组分样品的定量分析,（,1,）吸收系数法：,按药品标准规定的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度（,A,），根据,A=KCL,与药品标准规定的被测物质的百分吸收系数，计算供试品溶液的浓度,C,供,（,g/100ml,）。,含量W/W,）,=C,供,D,供,V,样,100W,供,如,中国药典,驻车丸中总生物碱的含量测定、前列舒丸中牡丹皮的含量测定等采用本法。先计算,C,供,，再计算出药品中被测成分的含量（,W/W,）。含量计算公式有两种：,含量（,mg/,丸）,=C,供,（,mg/ml)D,供,V,样,(ml),平均丸重（,g/,丸）,W,样,（,g,）,含量（标示量,%,）,=C,供,（,mg/ml)D,供,V,样,(ml),平均丸重（,g/,丸）,W,样,（,g),标示含量（,mg/,丸）,100%,（,2,）对照品比较法：,按药品标准的规定，在相同条件下，在规定波长处分别测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度，按 计算供试品溶液中待测组分的浓度。,式中：,A,R,为对照品溶液的吸光度；,A,X,为供试品溶液的吸光度；,C,R,为对照品溶液的浓度；,C,X,为供试品溶液的浓度。,中国药典,华山参片中生物碱的含量测定、黄杨宁片中环维黄杨星,D,的含量测定均采用本法。,（,3,）标准曲线法（工作曲线法）,：,配制一系列不同浓度的对照品溶液，选择合适的参比溶液，在相同条件下分别测定各对照品溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制,A-C,曲线，称为标准曲线或工作曲线。然后在完全相同的条件下测定样品溶液的吸光度，从标准曲线,(,或回归直线,),上查出样品溶液的对应浓度，或代入回归方程，求出样品溶液的浓度。,标准曲,线,在做精密测量时，用对照品溶液的浓度进行线性回归，求出回归直线方程（相关系数,r0.999,），绘出回归直线代替标准曲线，以尽量消除偶然误差。,亦可利用计算器将一系列对照品溶液的浓度与相应的吸光度进行一元线性回归，求出回归方程（相关系数,0.9990,），将供试品溶液的吸光度代入回归方程，算出供试品溶液的浓度。,回归方程：,A=a+bC,式中，,A,为被测溶液吸光度；,C,为被测溶液浓（,g/ml,）；,a,为截距；,b,为斜率。,中国药典,槐米中芦丁及青黛中靛蓝的含量测定，复方皂矾丸中的硫酸亚铁，独一味胶囊、益心酮片、消咳喘糖浆和排石颗粒中的总黄酮，桂林西瓜霜中的总生物碱的含量测定等均使用该法。,2.,混合物的测定方法,当待测组分彼此不发生化学反应时，根据吸收定律的加和性，不需化学分离，可同时测定样品中两种或多种组分的含量。,当溶液中同时存在两组分,a,和,b,时，它们的吸收峰相互重叠的程度有三种情况，如图所示。,混合组份吸收光谱重叠示意图,（,1,）在最大吸收峰处互不重叠：如图,(1),，可分别在,1,和,2,处用单组分样品的测定方法，先后测定组分,a,和,b,的浓度。,（,2,）在最大吸收峰处部分重叠：如图,(2),，在,1,处，组分,b,无吸收，在,2,处，组分,a,和,b,均有吸收。则可先在,1,处用单组分样品的测量方法，测定样品溶液中组分,a,的浓度；然后在,2,处测定样品溶液的吸光度,Aa,b,2,，根据吸光度的加和性原则，计算组分,b,的浓度。,（,3,）两组分在最大吸收峰处相互重叠：如图,(3),，常采用解线性方程组法。选择两个测定波长,1,和,2,，首先测定两组分在两波长处的吸收系数的值，然后在两波长处测定样品溶液的吸光度，最后用解线性方程组的方法求出两组分的浓度。,（,4,）等吸收双波长测定法：,对于图,(3),的情况，可利用等吸收双波长测定法对其中一种组分或两种组分同时进行测定。,操作步骤：选择参比与测定波长；绘制标准曲线；含量测定,等吸收双波长测定法示意图,（,5,）导数光谱法：,导数光谱法又称微分光谱法，是一种消除光谱干扰的方法。以吸光度,A,对波长,的吸收光谱称为零阶光谱，对吸收光谱进行一级微分，即可得到,(dA/d)-,曲线，称为一阶导数光谱，以同样方法可得到二阶导数光谱,(d,2,A/d,2,)-,曲线，三阶导数光谱,(d,3,A/d,3,)-,曲线，四阶导数光谱,(d,4,A/d,4,)-,曲线。,各阶倒数光谱的基本曲线图,1.,零阶,2.,一阶,3.,二阶,4.,三阶,5.,四阶,原理：,在导数光谱中，导数信号与浓度成正比，即：,dA/dC,，,d,2,A/d,2,C,，,d,3,A/d,3,C,，,d,4,A/d,4,C,。信号对浓度的灵敏度取决于吸收系数在特定波长下的变化率，即：,d/d,，,d,2,/d,2,，,d,3,/d,3,，,d,4,/d,4,，导数光谱的测量法有几何法和代数法。在几何法中，导数光谱的定量参数是振幅。,导数光谱的微分阶数,n,越大，峰形越尖锐、分辨率越强，但信噪比将降低，通常不超过四阶。,操作步骤：,干扰情况考查；选择测定条件；绘制标准曲线；样品测定。,（,6,）差示光谱法,(A),法：,先选定一个理想的参比溶液，使待测组分发生特征光谱变化，而共存组分不发生光谱变化，由此消除其干扰。一般是取两份相等的供试液，在一份中加酸或碱，形成不同的酸碱介质环境；或加入能与待测组分发生反应的试剂，使待测组分以不同的形式存在，吸收光谱发生显著变化，将两份供试液稀释至同样浓度，分别置于样品池与参比池中，于选定波长处测其吸光度差值,A,，在一定浓度范围内，,A,与待测组分浓度,C,呈线性关系，可作为物质定量分析的依据。,原理：,导数光谱的微分阶数,n,越大，峰形越尖锐、分辨率越强，但信噪比将降低，通常不超过四阶。导数光谱的波长间隔,越大，灵敏度越高，但分辨率降低。一般选,1,2nm,为宜。导数光谱的中间波长,m,的选择原则是：干扰组分在此波长处的导数值最好为零，而且通过选择适宜的波长和求导条件，可消除背景吸收、杂质和共存物的干扰。,操作步骤：,干扰情况考查；选择测定条件；绘制标准曲线；供试品测定；,四、案例,（一）六味地黄颗粒中牡丹皮的含量测定,供试品溶液的制备,参比溶液的制备,紫外,分光光度计,含量计算,取本品约,2g,，精密称定，用水蒸气蒸馏，收集馏出液约,450ml,，置,500ml,量瓶中，加水稀释至刻度。照紫外分光光度法，在,274nm,波长处测定吸光度，按丹皮酚,(C,9,H,10,O,3,),的吸收系数为,862,计算，即得。本品每袋含牡丹皮按丹皮酚,(C,9,H,10,O,3,),计，不得少于,6.0mg,。,（二）独一味胶囊中总黄酮的含量测定,本品每粒含总黄酮以无水芦丁,(C,27,H,30,O,16,),计，不得少于,26mg,。,独一味胶囊中总黄酮的含量测定采用的是何种方法,？,供试品溶液是如何制备的？,对照品溶,液的制备,标准曲线,的 制备,吸光度,的测定,含量,计算,供试品溶,液的制备,课堂互动,（三）黄杨宁片中黄杨宁的含量测定,药品标准规定每片含黄杨宁以环维黄杨星,D,（,C,26,H,46,N,2O,）计算，应为标示量的,90.0%,110.0%,。,供试品溶,液的制备,对照品溶,液的制备,吸光度,的测定,含量,计算,黄杨宁片中黄杨宁的含量测定采用的是何种方法,？,供试品溶液是如何制备的？,课堂互动,1.,定义,薄层扫描法是供试品经薄层分离后,用一束波长、强度一定的紫外线或可见光对薄层板进行扫描，通过测定薄层板上的斑点对光的吸收强度或斑点经激发后所产生的荧光强度,将扫描得到的图谱及积分数据进行定量的方法。,2.,特点,设备简单、操作方便、分离快速、灵敏度及分辨率高、显色剂选择范围广、适用于多组分及微量组分定量等。,第二节 薄层扫描法,一、仪器工作原理,（一）薄层色谱扫描法的基本原理,薄层色谱扫描法的测定原理是用长宽可以调整的一束波长、强度固定的光，对薄层板上的斑点进行扫描，通过测量斑点或被斑点反射的光束的强度变化，求出待测组分含量。薄层扫描法可分为吸收薄层扫描法和薄层荧光扫描法。,第二节 薄层扫描法,1,.,吸收薄层扫描测定法,是用可见,-,紫外光的单色光对薄层板上色谱斑点进行扫描，根据扫描获得的吸光度随展开距离变化的图谱及积分数据进行定量的方法。根据测光的方式不同，吸收扫描测定法又分为透射法和反射法两种。第二节 薄层扫描法,透射法,是测定光透过供试品斑点后的吸收情况进行的定量方法,透射法扫描,L-,光源,MC-,单色器,P-,薄层板,S-,斑点,PD-,检测器,反射法,是测定供试品斑点对光的反射情况进行的定量方法。,L-,光源,MC-,单色器,P-,薄层板,S-,斑点,PD-,检测器,反射法扫描,第二节 薄层扫描法,第二节 薄层扫描法,吸光度与物质的浓度及液层厚度间不呈线性关系的解决方法,选择曲线中,的直线部分,进行定量分析,采用,Kubelka,-Munk,方程,利用非线,性方程定量,2.,薄层荧光扫描法,是通过仪器对供试品吸收可见,-,紫外光后发射的荧光强度扫描得到的吸收光谱及积分数据，求出供试品含量的方法,第二节 薄层扫描法,荧光反射法扫描,L-,光源,MC-,单色器,P-,薄层板,S-,斑点,PD-,检测器,第二节 薄层扫描法,当样品量很少时，斑点中组分的浓度与荧光强度呈线性关系，可按公式计算：,F=2.3K/I,o,ECL,或,F=KC,式,F=2.3K/IoECL,中：,F,为荧光强度；,I,o,为入射光强度；,C,为浓度；,E,为吸收系数；,K,为常数（与荧光效率有关）；,L,为薄层厚度。,式,F=KC,中：,C,为浓度；,K,为,2.3K/I,o,EL,之积。,在薄层荧光扫描法中，常用斑点荧光强度的积分值（色谱峰面积）代替公式中的,F,，斑点中组份的含量代替公式中的,C,进行计算。,（二）薄层扫描仪的构造,薄层扫描仪主要由主机（光源、单色器、供试品室、薄层板台架、检测器）及工作站组成。,1.,光源,光源室能提供稳定的、具有一定强度的所需波长范围内的连续光源。包括紫外光源氘灯（,200nm,370nm,）；可见光源钨灯（,370nm,700nm,）；荧光光源氙灯或汞灯（,200nm,700nm,），其中汞灯为线光源，可提供特征辐射光谱。,第二节 薄层扫描法,2.,单色光器,单色光器可以将光源发出的连续光分解为单色光。其主要由入射狭缝、出射狭缝、色散元件、平行光装置（准直镜）等部分构成。薄层扫描仪多采用光栅为色散元件。,3.,薄层板台,包括薄层板台架及驱动装置。,4.,检测器,检测器是用来检测和放大由供试品斑点透射、反射或发出荧光强度的装置。,5.,工作站,具有设定仪器参数、控制仪器工作条件和信号采集、处理计算和打印输出等功能的装置。,第二节 薄层扫描法,（三）仪器性能的检定,1.,波长准确度的检查,一是利用汞灯的特征光谱线对仪器的波长进行准确度检查。二用氘灯以反射方式对硅胶,G,的薄层板上的,10mg/ml,的膦酸氯喹水溶液斑点做光谱扫描，如在,25710nm,和,34310nm,有最大吸收峰，则准确度符合要求。,2.,重复性测定,系指同一薄层板上、同一供试品溶液相同浓度的数个斑点，扫描结果的相对标准偏差。以峰面积的积分值计算相对标准偏差。锯齿扫描的相对标准偏差应,1.5%,，线性扫描的相对标准偏差应,2.0%.,第二节 薄层扫描法,（四）薄层扫描仪的工作流程,1.,吸收薄层扫描法的薄层扫描仪工作原理,以,CS-9301PC,型双波长扫描仪为例。,第二节 薄层扫描法,薄层扫描仪的光学系统结构示意图,2.,薄层荧光扫描法的薄层扫描仪工作流程,以岛津,CS-9000,型双飞点扫描仪为例。,第二节 薄层扫描法,CS-9000,型仪器的光学系统,三、含量测定,（一）概述,1.,原理,薄层扫描法含量测定有外标法和内标法两种方法，中国药典仅采用外标法。,2.,类型,根据对照品标准曲线性质的不同，外标法又分为外标一点法和外标两点法。,第二节 薄层扫描法,供试品,选择,检,测,方,法,含量计算,薄层扫描发含量测定操作步骤,溶液的制备,薄层板,点样,展开,扫描,扫,描,波,长,对照品,系统,适用性,实验,测,定,方,式,扫,描,方,式,第二节 薄层扫描法,（二）操作步骤和方法,外表一点法和外标二点法的点样操作。,（,1,）外标一点法,（,2,）外标两点法,外标两点法点样方法,第二节 薄层扫描法,4.,系统适用性实验,（,1,）灵敏度的检测：,（,2,）分离度：,（,3,）重复性,5.,上机扫描,（,1,）检测方法选择,（,2,）测定方式选择,:,反射法和透射法,第二节 薄层扫描法,（,3,）扫描波长选择：单波长扫描法；双波长扫描法,;,薄层荧光扫描波长的选择,第二节 薄层扫描法,单波长、单光束扫描仪光路图,单波长、双光束扫描仪光路图,（,4,）扫描方式的选择：直式扫描（线性扫描,),；锯齿扫描（飞点扫描）；圆形扫描；倾斜扫描。,扫描时，应自下而上扫描，不可横向扫描。扫描光束（点）的形状和大小，可通过调整狭缝的高度和宽度实现。,第二节 薄层扫描法,线性扫描图,第二节 薄层扫描法,锯齿扫描,6.,含量计算,（,1,）外标一点法：标准曲线通过原点。,计算公式：,C=F,1,A,（,2,）外标两点法,(,随行标准法,),：标准曲线不通过原点。,计算公式：,C=F,1,A+F,2,由,C,1,=F,1,A,1,+F,2,C,2,=F,1,A,2,+F,2,得,第二节 薄层扫描法,7.,结果判断,将测定结果与,2010,年版,中国药典,中的各品种项下标准进行对比，符合标准即为合格。,8.,注意事项,四、案例,（一）灵宝护心丹的含量测定,供试品溶液的制备,对照品溶液的制备,薄层扫描,含量计算,本品每,1g,含牛黄以胆酸（,C,24,H,40,O,5,）计，不得少于,2.5mg,。,灵宝护心丹的胆酸含量测定采用的是何种方法,？,供试品溶液是如何制备的？,课堂互动,第二节 薄层扫描法,1.,定义,高效液相色谱法是采用高压输液泵将流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离并测定含量的方法。,2.,特点,分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（供试品不需气化，只需制成溶液即可）、流动相选择性大、流出组分易收集、色谱柱可反复使用等特点。,3.,范围,挥发性低、热稳定性差、分子量大、离子型化合物。,第三节 高效液相色谱法,一、仪器工作原理,（一）仪器的构造,第三节 高效液相色谱法,高压输液系统,色谱分离系统,数据处理系统,进样系统,检测系统,高效液相色谱仪的构造,第三节 高效液相色谱法,高效液相色谱仪,1.,贮液罐,2.,脱气装置,3.,梯度洗脱,4.,高压输液泵,5.,流动相流量显示,6.,柱前压力表,7.,输液泵头,8.,过滤器,9.,阻尼器,10.,进样装置,11.,色谱柱,12.,检测器,13.,数据处理系统14.,废液贮罐,第三节 高效液相色谱法,1.,高压输液系统,由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。,（,1,）贮液罐：,由玻璃、不锈钢或氟塑料等化学惰性、耐腐蚀材料制成，有无色及棕色两种贮液罐。,（,2,）脱气装置：,贮液瓶配有抽真空及吹入惰性气体的脱气装置。,超声波振动脱气；抽真空脱气；加热回流脱气；吹氦脱气；真空在线脱气。,第三节 高效液相色谱法,（,3,）高压输液泵：,完成流动相的输送任务。,柱塞往复泵示意图,两种连接方式,的柱塞往复泵,第三节 高效液相色谱法,（,4,）过滤器：,在流动相进入色谱柱之前，用于除去流动相中固体颗粒杂质的直径为,0.45W,滤膜装置5,）梯度洗脱系统：,可分为高压与低压两种梯度洗脱装置。,三元高压梯度洗脱系统示意图,1,，,2,，,3-,阀门驱动器；,4,，,5,，,6-,比例阀；,7,，,8,，,9-,溶剂贮罐；,10-,溶剂比例控制器；,11-,梯度洗脱程序；,12-,高压泵；,13-,溶剂混合器,第三节 高效液相色谱法,2.,进样系统,进样器有高压进样阀、六通手动进样阀及自动进样器等装置。,（,1,）高压进样阀,（,2,）六通阀进样器,六通进样阀,1,，,4-,定量管；,2-,泵；,3-,进入色谱柱,5,，,6-,排液口,（,a,）取样 （,b,）进样,第三节 高效液相色谱法,（,3,）自动进样装置,自动进样器,1-,冲洗液管；,2-,冲洗泵；,3-,电磁阀；,4-,单向阀；,5-,注射器；,6-,三通阀；,7-,六通阀；,8-,冲洗液；,9-,空气间隙；,10-,样品；,11-,采样针头；,12-,空气；,13-,供试品瓶；,14-,冲洗瓶,3.,色谱分离系统,色谱分离系统由保护柱、色谱柱、恒温装置和连接阀等组成。,（,1,）保护柱：具有防止供试品和进样阀垫圈中的固体颗粒的进入分析柱作用。,（,2,）色谱柱：色谱柱是高效液相色谱仪的重要部件，由柱管、接头和过滤片组成。,第三节 高效液相色谱法,第三节 高效液相色谱法,带保护柱的,PEEK,色谱柱,1-,柱接头；,2-PEEK,保护柱；,3-0.5m,钛金属滤过片；,4-,电解铝外壳；,5-PEEK,色谱分析柱；,6-0.5m,钛金属滤过片；,7-,柱接头,柱管、接头、过滤片,第三节 高效液相色谱法,柱接头的液流分配功能,内接式柱结构,1-,毛细连接管；,2-,压紧螺丝；,3,，,7-,密封圈；,4-,滤过片；,5-,柱头螺帽；,6-,锁紧螺帽；,8-,柱管,（,4,）恒温装置：,恒温装置,(,恒温箱,),精确控制色谱柱温度的装置，具有调节温度的功能。,（,5,）色谱柱柱效的评价：,硅胶柱、反相色谱法的色谱柱（,ODS,柱等）、正相色谱法的色谱柱（氰基或氨基柱）,测各组分的,W,1/2,及,t,R,，计算理论塔板数,n,及相邻组分的分离度,R,（,1.5,）,第三节 高效液相色谱法,4.,检测系统,高效液相色谱检测器通常分为两类：通用性检测器和选择性检测器。,（,1,）通用性检测器：蒸发光散射检测器、示差折光检测器。,（,2,）选择性检测器：可见,-,紫外检测器、二极管陈列检测器、荧光检测器、电化学检测器及质谱检测器。,第三节 高效液相色谱法,紫外检测器（,Utraviolet detector,，,UV,）：紫外检测器是高效液相色谱法中使用最广范的选择性检测器。分为固定波长、可变波长和二极管阵列检测器三种类型。,固定波长检测器；可变波长检测器；二极管阵列检测器（,Diode array detector,）。,第三节 高效液相色谱法,荧光检测器（,Fluorophotometrie detector,FD,电化学检测器（,Electrochemical detector,ECD,）,蒸发光散射检测器,（,Evaporative light scattering detector,ELSD,）,示差折光检测器（,Differential refractive index,RID,）：,5.,数据记录与处理系统,是将色谱系统的检测信号进行记录和处理成分析结果的装置。,6.,仪器性能,衡量仪器性能的指标包括仪器的重复性、噪音、基线漂移、敏感度、线性、波长精度等。,第三节 高效液相色谱法,典型的高效液相色谱仪流程如图所示,第三节 高效液相色谱法,（二）仪器工作原理,1.,贮液罐,2.,脱气装置,3.,梯度洗脱,4.,高压输液泵,5.,流动相流量显示,6.,柱前压力表,7.,输液泵头,8.,过滤器,9.,阻尼器,10.,进样装置,11.,色谱柱,12.,检测器,13.,数据处理系统,14.,废液贮罐,1.,用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。,2.,打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约,20ml,，设置高流速（如,9ml/min,）或用冲洗键（,PURGE,）进行泵排气，出口处流动相连续液流后，将流速逐步回零或停止冲洗，关闭排放阀。,第三节 高效液相色谱法,二、仪器操作通法,（一）泵的操作,3.,将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏。初始平衡时间一般需约,30,分钟。如为梯度洗脱，应在程序器上设置梯度状态，用初始比例的流动相对色谱柱进行平衡。,1.,开启检测器电源开关，选择光源（钨灯或氘灯），选定检测波长，待稳定后，测试参比和供试品光路的信号应符合要求，设置吸收度方式和检测响应时间（一般不大于,1,秒），设置满刻度吸收值（适用于记录仪）。,2.,开启色谱处理机，设定处理方法，初步设定衰减、纸速、记录时间、最小峰面积等参数，或设定记录仪的纸速或衰减。,第三节 高效液相色谱法,（二）紫外,-,可见检测器和色谱数据处理机的操作,3.,进行检测器回零操作，检查处理机的电平（,LEVEL,），应符合要求，或检查记录仪的笔应处在设定的起始位置，如有变动，可继续回零操作直至符合要求。,4.,记录基线，待稳定后，进行处理机斜率测试，符合要求后方能进行操作。,1.,六通阀式进样器,（,1,）进样手柄置采样位置（,LOAD,）。,（,2,）用供试品溶液清洗配套的注射器，再抽取适量，如用定量环（,LOOP,）载样，则注射器抽取量应不少于定量环容积的,5,倍，用微量注射器定容进样时，进样量不得多于环容积的,50%,。在排除气泡后方能向进样器中注入供试品溶液。,（,3,）把注射器的平头针直插至进样器底部，注入供试品溶液，除另有规定外，注射器不应取下。,（,4,）将手柄转至进样位置（,INJECT,），供试品被流动相带入色谱柱。,第三节 高效液相色谱法,（三）进样操作,2.,自动进样器：,自动进样装置有圆盘式自动进样器、链式自动进样器、坐标式自动进样器等。,（,1,）将供试品溶液用,0.45m,滤膜滤过，取续滤液至进样瓶中，盖上带有垫片的瓶盖，顺时针方向旋紧。为避免堵塞进样器及损伤进样器，一般应选择与自动进样器型号相配套的进样瓶。,（,2,）将进样瓶依次放入贮样室内，记录瓶位置号（,VIAL,）。如果自动进样器有控温装置，设置温度参数。,（,3,）对自动进样器进行校正，使自动进样器为默认位置、进样针冲洗系统正常、管内无气泡、有足够的冲洗液和流动相。,（,4,）设定自动进样参数。即设定供试品溶液自动进样的起始位置、进样体积、稀释倍数、数据文件名等，用,START,进样。,第三节 高效液相色谱法,1.,注样同时启动数据处理机，采集和处理色谱信息，如系记录仪，则注样同时按下记号键作起始记号。,2.,最后一峰出完后应继续走一段基线，确认无组分流出后结束记录。,3.,根据第一张预试的色谱图，调整衰减、纸速、记录时间等参数，使色谱峰信号在色谱图上有一定强度。定量时，一般峰顶不超过记录满量程。再按,3.,（,1,）,4.,（,1,）正式分析操作。,4.,含量测定的对照品溶液和供试品溶液每份至少进样,2,次，由全部进样结果（,n4,）求得平均值，相对标准偏差（,RSD,）不应大于,1.5%,。,5.,系统适用性试验应符合药典规定。,第三节 高效液相色谱法,（四）色谱数据的收集和处理,1.,分析完毕，先关检测器和数据处理机，再用经滤过和脱气的适当溶剂清洗色谱系统，正相柱用正己烷，反相柱如使用过含盐流动相，则先用水，然后用甲醇,-,水冲洗，冲洗前先按上述操作通法项下,1,（,1,）、,1,（,2,）操作，再用分析流速冲洗，各种冲洗剂一般冲洗,15,分钟,30,分钟，特殊情况可延长冲洗时间，尤其是用过含盐流动相的柱子，有时需冲洗数小时甚至更长时间。,2.,冲洗完毕后逐步降低流速至,0,，关泵。进样器也应用相应溶剂冲洗，可用进样阀所附专用冲洗接头。,3.,关闭电源，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱柱、柱压、使用时间（小时）及仪器使用前后的状态等。,第三节 高效液相色谱法,（五）清洗和关机,外标法可分为工作曲线法、外标一点法、外标两点法。,1.,标准曲线法,2.,外标一点法,第三节 高效液相色谱法,三、含量测定,（一）原理,(,外标法,),3.,峰面积归一化法,按药品标准有关项下进行峰面积归一化法求组分的含量，按下式计算,式中：,A,i,为待测组份峰面积；,A,未参与计算的全部峰面积（溶剂峰和其他干扰峰除外）之和。,第三节 高效液相色谱法,4.,杂质检查法,（,1,）加校正因子的主成分自身对照法：,测定杂质含量时，如在检测波长下，杂质色谱峰位置与主成分色谱峰位置不同时，可将主成分作为内标物加到杂质的对照品溶液中，求出杂质相对于主成分的校正因子，然后根据供试品中主成分色谱峰和杂质色谱峰的面积，采用内标法计算杂质的含量。,（,2,）不加校正因子的主成分自身对照法：,在杂质未知或未建立杂质对照品时，可采用不加校正因子的主成分自身对照法测定杂质的含量或限量。,第三节 高效液相色谱法,1.,溶液的制备,2.,系统适应性试验,（,1,）色谱柱的理论塔板数（,n,）：,（,2,）分离度（,R,）：分离度应大于,1.5,。,（,3,）重复性：相对标准偏差不大于,2.0%,。,（,4,）拖尾因子（T,）：,T,应在,0.95,1.05,之间。,第三节 高效液相色谱法,（二）操作步骤和方法,（,5,）色谱图及其参数,保留时间,tR,；峰高,h,；峰宽,W,；峰面积,A,。,第三节 高效液相色谱法,色谱图及其参数,3.,进样测试,4.,含量计算,（,1,）外标法：,5.,结果判断,四、案例,（一）固本咳喘片中补骨脂素和异补骨脂素的含量测定,供试品溶液的制备,对照品溶液的制备,高校液,相色谱仪,含量计算,第三节 高效液相色谱法,【,处方,】,党参,151g,白术,(,麸炒,)151g,茯苓,100g,麦冬,151g,补骨脂（盐炒）,151g,炙甘草,75g,五味子,75g,本品每片含补骨脂以补骨脂素（,C,11,H,6,O,3,）和异补骨脂素（,C,11,H,6,O,3,）的总量计，不得少于,0.30mg,。,为什么选择补骨脂素和异补骨脂素为指标性成分？,（二）胃舒宁颗粒中甘草酸含量的测定,【,处方,】,甘草,595g,海螵蛸,595g,白芍,464g,白术,310g,延胡索,310g,党参,119g,第三节 高效液相色谱法,为什么选择甘草酸为指标性成分？,供试品溶液的制备,对照品溶液的制备,高校液,相色谱仪,含量计算,本品每袋含甘草以甘草酸（,C,42,H,62,O,16,）计不得少于,20mg,。,1.,定义,以气体为流动相（称载气）流经色谱柱，进行分离定量的色谱分析法称气相色谱法（,GC,）。,2.,特点,分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快等特点,3.,适用范围,具有挥发性，在常温下可气化或加热后可气化的物质的含量测定。,第四节 气相色谱法,一、仪器工作原理,（一）仪器的组成,第四节 气相色谱法,气,控,系,统,进,样,系,统,柱,分,离,系,统,检,测,系,统,信,号,处,理,系,统,温,控,系,统,第四节 气相色谱法,气相色谱仪结构示意图,1.,载气钢瓶（,N2,）,2.,氢气钢瓶,3.,空气钢瓶,4.,减压阀,5.,干燥器,6.,稳压器,7.,压力表,8.,针形阀,9.,转子流量计,10.,进样器及汽化室,11.,色谱柱（虚线表示恒温室）,12.氢火焰离子化检测器（虚线表示恒温室）,13.,微电流放大器,14.,记录器,第四节 气相色谱法,1.,气流控制系统,包括气源、气体净化装置、气体流速控制和测量装置。,气,体,流,量,调,节,阀,高,压,阀,减,压,阀,压,力,表,净,化,器,检,测,器,转,子,流,量,计,色,谱,柱,放空,气,化,室,第四节 气相色谱法,（,1,）气源及净化：,气源（载气）：是气相色谱仪载气和辅助气的来源，可以是高压气钢瓶、氢气发生器以及空气压缩机。,（,2,）减压阀：,是指联接在高压钢瓶和气体流路之间中减压装置，将由高压钢瓶供给的气体压力降至,0.2,0.5mPa,。,（,3,）稳压阀：,又称压力调节器，可以为针形阀提供稳定的气压；为它后边的稳流阀提供恒定的参考压力。,第四节 气相色谱法,减压阀结构示意图,1-,调节手柄；,2-,弹簧；,3-,隔膜；,4-,提升针阀；,5-,出口腔；,6-,入口腔；,7-,气体入口；,8-,高压压力表；,9-,气体出口；,10-,低压压力表,稳压阀示意图,1-,阀座；,2-,针形阀（或平面阀）；,3-,波纹阀；,4-,弹簧；,5-,手柄；,6-,阀杆,第四节 气相色谱法,（,4,）压力表：,压力显示器，指示和监测载气流量的仪器。,（,5,）净化装置：,联接在气源与仪器之间的净化载气中的杂质和水分所用载气的装置。,（,6,）气体流量调节阀（稳流阀）：,调节载气流量、稳定气体压力的装置。,（,7,）转子流量计：,测定显示载气流速的仪器。,稳流阀示意图,1-,弹性膜片；,2-,上游反馈管；,3-,手柄；,4-,针阀,第四节 气相色谱法,2.,进样系统,供试品引入装置（进样器）和气化室（进样系统）温度控制装置组成。,（,1,）进样器：将供试品加到气相色谱仪中的装置，主要有手动微量注射器、自动进样器及顶空进样器。,气体进样器：六通阀或微量进样阀、注射器；,液体进样器：微量注射器或有分流装置的气化室。,第四节 气相色谱法,（,2,）进样系统和进样模式：,填充柱进样系统；分流进样系统；不分流进样系统；冷柱头进样；程序升温气化进样；大体积进样；顶空进样技术；热解进