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中国人群运动性猝死相关基因快速检测方法研究

摘要 目的:建立一种中国人群运动性猝死相关基因多态性速测方法。方法:用Chelex法提取外周静脉血基因组DNA, 应用定点突变技术获得运动性猝死相关基因的突变阳性DNA模板, 然后经过等位基因特异性PCR法扩增目的基因。优化内参引物、 多态引物的Tm值, 引物浓度比例, PCR循环数等扩增条件; 琼脂糖凝胶电泳进行基因分型。结果:AS-PCR可检测运动性猝死相关基因多态性, PCR产物琼脂糖凝胶分型与DNA测序结果完全一致。 结论:本研究建立的AS-PCR方法适用于中国人群运动性猝死相关基因的快速检测。
关键词 运动性猝死; 基因多态性; 等位基因特异性PCR
中图分类号 G804.83
近年来, 高强度竞技体育运动项目动性猝死案例频发, 而且其数量呈逐年上升的态势。当前, 临床对运动性猝死的常规检测手段主要有家族史、 个人史筛查, 体格及心电图检查, 若为阳性结果, 则进一步查超声心动图、 运动负荷试验和24小时动态心电图等[1]。但这些检测方法针对性不强, 检出率低, 具有较大的局限性。国内外对运动性猝死的研究表明[2], 死者的某些基因存在突变, 大多表现为SNP或碱基缺失多态性。本研究选取KCNH2、 KCNE1、 SCN5A、 KCNJ11、 NUP155、 CACNA1C、 CACNB2b, 7个与运动性猝死显著相关的热点突变基因的多态位点作为靶点, 以AS-PCR方法为检测手段, 从而建立准确、 快速筛查运动性猝死基因多态性的方法。

1. 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
Chelex-100购自上海生物工程公司; 定点突变试剂盒MutanBEST Kit , PMD18—T Vector , PCR扩增试剂包括TaKaRa Taq™ Hot Start DNA热启动Taq酶, dNTPs,Buff以及核酸电泳分析试剂DL1000 DNA分子量标准, DNA无毒染料, 琼脂糖,均购自日本Takara公司; Bigdye3.1 DAN测序试剂盒,购自美国Life公司。主要仪器设备有: 美国ABI9700型PCR扩增仪, 英国UVR电泳凝胶成像系统, 美国ABI3130型DNA测序仪。
1.2 基因组DNA提取
50例猝死个体临床血液样本, 采用Chelex基因组DNA 提取试剂盒, 参照使用说明书操作, 提取基因组DNA。取直径3-5mm血斑置于1.5ml离心管中, 加入sdH2O 1ml,振荡离心, 弃上清, 重复步骤两次, 弃上清, 将5% Chelex-100振荡悬浮后快速用剪掉头的枪头吸取200μl 加入离心管中, 振荡数秒, 于56℃水浴保温30min后, 振荡数秒, 95℃沸水浴10min,轻微振荡数秒。 rpm离心5min, 上清为提取的DNA,-20℃保存备用。
1.3 阳性模板制备
根据7个靶基因SNP位点设计突变引物, 并进行PCR扩增, 将引入突变位点的目的片段克隆到pMD 18-T Vector载体中, 测序验证后作为后续PCR的DNA模板。
1.4 AS-PCR引物设计
根据Genbank中的靶基因序列和AS-PCR原理, 采用primer premier 5软件设计多态引物及内参引物, 针对变异位点设计一对等位基因特异性引物,其3′末端分别与变异位点的碱基互补。为增加扩增特异性和检测分辨率, 在3′端第2 位引入错配碱基的AS-PCR引物。同时为排除PCR反应系统敏感性所致基因型判断失误, 在AS 引物上游设计了内参引物PF, 下游共用引物PR与其中一种AS 引物用作突变检测。内参引物与下游共用引物扩增较大的片段作为PCR 的质控参照。AS-PCR引物设计原理示意图如图1.。

P-2A-错配碱基

PR
PF
P-2A-错配碱基

目的基因基因

参考片段

图1. AS-PCR引物设计原理示意

1.5 AS-PCR 反应及条件优化
1.5.1 AS-PCR反应
本实验的反应条件为95℃ 3min, 94℃ 30s, 55～65℃ 30s, 72℃ 30s ; 72℃ 3min, 共35个循环。PCR缓冲液( 其中, Tris-HCl pH8.3 100mM; KCl 500 Mm; MgCl2 15mM) , dNTPs混合物的各组分浓度为 2.5mM, 热启动Taq酶为5U/μl, 内参上游引物的浓度为10uM, 多态性引物的浓度为10uM, 下游引物的浓度为10uM。
1.5.2 温度梯度PCR优化退火温度
平行进行56管反应, 设定温度梯度范围为55～65℃ , 各管的退火温度分别为: 55.0、 56.3、 57.6、 59.1、 60.7、 62.2、 63.8、 65.0。反应条件同上, 反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离, 凝胶成像仪观察 选择无非特异条带, 特异性条带最亮的管所对应退火温度为后续反应的退火温度。
1.5.3 引物浓度优化
本实验采用半巢式PCR的方法进行扩增, 因此存在PCR竞争的情况。将内参引物与目的基因引物的比例进行引物浓度优化。反应产物经用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离, 凝胶成像仪观察, 选择内参条带与目的条带亮度比例适中, 便于判读的引物比例为后续反应的引物浓度。
1.5.4 DNA测序验证AS-PCR扩增产物
为了进一步验证采用一系列AS-PCR扩增条件优化后的产物多态性的准确性, 经过PCR产物琼脂糖凝胶回收试剂盒将扩增产物回收。由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物, 将10μl上样混合物与1μl扩增产物或等位基因分析标准物混合, 避免产生气泡, 95℃变性5min, 冰浴后电泳, 用ABI3130遗传分析仪检测分析。

2、 结果
2.1 阳性模板的制备
本研究根据7个基因SNP位点, 应用定点突变技术在野生型的基础上得到相应的DNA阳性模板, 各个基因的SNP多态性如表1所示。

2.2 AS-PCR 反应条件优化
运用AS-PCR方法同时检测这7个SNP多态位点。为了实现运动性猝死基因检测的高效性, 特异性, 要求各个PCR扩增反应的Tm值基本一致, 而由于半巢式PCR方法扩增目的基因, 存在PCR引物竞争, 选择最优的退火温度和引物浓度的电泳, 如图2所示。检测的7个基因中, KCNE1基因的参考片段大小为894bp,目的条带大小为754bp;KCNH2基因的参考片段大小为760bp,目的条带大小为579bp; KCNJ11基因的参考片段大小为795bp,目的条带大小为624bp; SCN5A基因的参考片段大小为764bp,目的条带大小为698bp; CACNA1C基因的参考片段大小为851bp, 目的条带大小为203bp; CACNB2B基因的参考片段大小为914bp,目的条带大小为750bp; NUP155基因的参考片段大小为610bp, 目的条带大小为321bp。

图2 AS-PCR反应条件优化

3. 讨论
本研究检测的50个猝死样本中, 发现KCNE1基因的两种突变型各1例, KCNH2基因突变1例。临床研究结果显示, 中国汉族人群中广泛存在KCNE1、 KCNH2、 KCNJ11单核苷酸多态性改变, 从而导致室性心动过速的猝死。因此, 钾离子通道相关基因导致的猝死属于高危基因突变型; 未发现钠离子通道相关基因SCN5A, 钙离子通道相关基因CACNA1C、 CACNB2B的突变, 这两类基因突变导致的运动性猝死在人群中分别约占1-5‰和0.1-0.3‰, 属于低度危险突变型; 发现NUP155基因的突变1例, 据文献报道, 编码核孔复合物组分的基因NUP155基因是中国汉族人群中发现的与运动性猝死显著相关的特有基因。50例猝死样本中, 检出4例与本研究靶基因相关的阳性突变。可能的原因是, 在猝死的样本中, 除了有心源性猝死外, 还有脑源性猝死, 或者其它原因的导致的猝死。而且在猝死的案例中, 因基因突变导致心功能受损而发生猝死的比例也较其它原因猝死概率低。从猝死样本检测出4例基因突变阳性样本, 表明本研究所采用的方法可靠, 结果准确, 可是, 与钠离子、 钙离子通道相关的3个基因型没有检测到临床阳性样本, 因此还须经过筛查大量的临床猝死样原来确保检验方法的可靠性。